專利名稱：：含乙二胺四乙酸和聚乙烯亞胺的組合、能透化微生物細(xì)胞壁的新組合物的制作方法含乙二胺四乙酸和聚乙烯亞胺的組合、會隨化微生物細(xì)的新組^/本發(fā)明涉及會隨化微生物細(xì)的新組合物，其包含乙二胺四乙酸(EDTA)和聚乙烯亞胺(PEI)的組合，本發(fā)明也涉及該組合物的應(yīng)用，特別是在液體或氣體介質(zhì)中計數(shù)和/或鑒定耙微生物的方法中進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明更特別應(yīng)用于，例如進(jìn)入食品和藥品生產(chǎn)線的液體和氣體介質(zhì)的微生物質(zhì)量調(diào)控。在該領(lǐng)域，待檢測微生物翻常較少，因為它們被大量體積的水或氣體所稀釋。然而，它們的鑒定必須肯定地確定。事實上，微生物控制必須使得能在盡可能短的時間內(nèi)檢出作為所制造產(chǎn)品組合物的成分的流體的任何污染物，以便能在^S情況下停止該產(chǎn)品的制備或，并采取必要去污步驟。為^^;f^微生物培養(yǎng)時間最小化，已發(fā)展出多種微生物檢測方法。包含液體經(jīng)膜過濾的微生物檢測方法，已在例如專利申請WO01/59157中記載。根據(jù)該方法，含在液體樣品中的微生物，在液體經(jīng)膜后，會保留在濾膜表面。將微生物在膜表面與瓊脂培養(yǎng)基接觸培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間要求形成肉眼不可見微m。然后，將形成微皿的細(xì)胞裂解，以釋方ii:H磷酸腺苷(ATP)和核酸內(nèi)含物。用ATP-生物發(fā)光法，將戶，放AIP作為鑒定及定量活細(xì)胞的f莉己物。AIP可作為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶底物，其中，通過該反應(yīng)可獲得光信號然后用合適的視頻界面進(jìn)行檢測(例如-LCD相機)。以圖象形式衛(wèi)共的所劍言號，倉巨使可原位看見微生物生長的膜位點，這與在細(xì)菌培養(yǎng)皿瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行的傳統(tǒng)計數(shù)方微似。在該實例中檢測被認(rèn)為是普M用的，因為ATP是在所有活微生物中都存在的新己。因此，該方法不能區(qū)分不同種屬的微生物。Millipore公司出售的"Milliflexmpid"系統(tǒng)，就是用上述記載原3KS行的操作。該系統(tǒng)被設(shè)計成在同一S肚進(jìn)行過濾和檢測步驟，其中，所述膜用塑料支持物進(jìn)行支撐。對該支持物進(jìn)行設(shè)計，以使其能^A各種裝置用于過濾、微生物培養(yǎng)、和檢測。與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)皿檢測相比，該微型系統(tǒng)能節(jié)省大量時間。此外，該方法4也能存儲數(shù)碼介質(zhì)所獲的圖象，所述圖象在對分析產(chǎn)品進(jìn)行^gl的情況下，是有利的。然而，該系統(tǒng)因為以下事實而具有某些局限性在實踐中，對膜表面微生物進(jìn)行計數(shù)，是在細(xì)胞裂解之后進(jìn)行的。進(jìn)行該裂解是必需的，以從細(xì)胞提取發(fā)光試劑反應(yīng)產(chǎn)物，例如ATP而產(chǎn)生待檢測發(fā)光信號。然而，ffi^膜進(jìn)行處理之后，就船隹再利用纖進(jìn)行例如精確鑒定所檢測微生物的其它分析。可禾,與微生物戶;f^核^(DNA或RNA)特異性雜交的探針鑒定微生物。最常用的這類徽，包含通常長度為1040核苷酸的寡核苷斷段，戶腿片段與微生物DNA或RNA戶^序列可形^補序列。PNA(肽核酸)類探針，也認(rèn)為在該^^測中有利，因為它們具有胖微生物中所存在,酶不太敏感的肽骨架，而且，娜核酸也鵬了一種不同標(biāo)己手段。專禾伸請WO2004/050902記載了一種^^測系統(tǒng)，所述系統(tǒng)在不引起微生物任何裂解的情況下，可檢測血樣是否存在微生物污染。該系統(tǒng)的特點在于，通過將豐私己試劑經(jīng)細(xì)胞壁透化至微生物中而進(jìn)行檢測。所用*射己試劑為小尺寸分子，特別是那些可嵌入核酸(DN入RNA)的化合物，例如花青素衍生物，碘化丙啶，吖啶橙，或溴化乙啶。禾擁現(xiàn)有技術(shù)已知的透化劑，例如聚乙烯亞,1),糊黃皂苷，莫能菌素，六偏磷,或氯化節(jié)烷銨，上述小舒化合物可相對容易經(jīng)Hig化至微生物中。首先，將含待測微生物液體辦在細(xì)臓化劑存在情況下，稀釋于^^i己試劑的5S化溶液，然后，將微生物會彌過濾由此檢測。該方法可以良S^fl率來檢測微生物。然而，由于^i己魏用標(biāo)記，即該^iB^微生物不具有特異性，所以，該系統(tǒng)并不能精確確定所檢測微生物的種類。形卜，該系統(tǒng)的微生作(在透化液中溫育)要在溶液中進(jìn)行，而由此需要特定職和復(fù)雑備。應(yīng)該注意，過將活細(xì)胞在溶液中溫育還有下列缺點~~^膜固定前0M細(xì)胞會纖續(xù)生長和分化，由此實際上可導(dǎo)致檢測最終結(jié)果具有不確定性。與i^^析相關(guān)的另一困難在于，必須用^t化溶液的透化劑用量。事實上，溯*1^根據(jù)待測微生物類型而變化。例如，根據(jù)微生物(在細(xì)菌例子中)是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性類型，透化劑在同一濃度下會有不同效果，更壞的是，i^C果4絵導(dǎo)i^存在微生物,?？傊?，革蘭氏陽性菌具有由肽聚糖(肽和多麟會腿的聚合物)艦的厚外層單膜，由此其透化性較革蘭氏陰性菌更加困難，其中，戶腐革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁由其中肽聚糖并不富余且更易分散的,膜鄉(xiāng)M。聚乙烯3K(PEI)為弱堿性、聚陽離子脂0J夷聚合物，已經(jīng)記載，其可使某些革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁可透過各種抗生素分子[Helander，LM.etal.,Polyethyleneimineisaneffectivepermeabilizerofgram-negativebacteriajMicrobiology(1997),143:3193-3199]。用于該目的以獲搏細(xì)菌例如鄉(xiāng)桿菌(￡.0/0的PEI濃度在20-30Mg/ml之間。乙二胺四乙酸(EDTA,肝式C10H16N2O8)是公知的齡劑，其通常在生物化學(xué)中用作穩(wěn)定劑，特別翻作驗抗氧化反應(yīng)的抑第柳。為此目的，EDTA出現(xiàn)在特定組合物中。然而，已會述示，為獲得核酸^i己目的，特別魏革蘭氏陽'性tt言，^4封OTEDTA并不能獲得的微生物細(xì)^化作用(WO,50902)。溶菌酶是在許多方案中用作透化革蘭氏陽性菌細(xì)、以進(jìn)行核酸細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一種產(chǎn)品。它特別Mil7jC解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖的某些N-乙S^胺和N-乙mt,離而起作用。本發(fā)明的目的是針對J^擬啲現(xiàn)存檢測系統(tǒng)的限制，特別是被認(rèn)為稱隹處理的革蘭氏陽性菌。令人驚奇他，本發(fā)明人注意到，EDTA與PEI的組合，與現(xiàn)有技術(shù)中記載的組^t/相比，特別慰卩徵含PEI或EDTA的組^/相比，能更有縱化微生物細(xì)鵬。因此，可以確信，至少組合PEI和EDTA的組^/，特別適用于微生物的3t4七，特別是革蘭氏陽'性菌。根據(jù)本發(fā)明，這些組^t^另脂調(diào)于用寡核苷酸^h標(biāo)己戶;M微生物的方法中，其中，戶;^核苷酸探針可用彿異性檢測戶腐微生物。戰(zhàn)方飽括4tm生物，在iH己大5H^如寡核苷酸MI"或PNA，Mli^情況下，與本發(fā)明包括PEI和EDTA聯(lián)用的組，接觸，以致t斜己大M會經(jīng)細(xì)胞^g化至微生物中而由此發(fā)生結(jié)合。財卜，這樣處理的微生物似乎更能耐受高濃度的PEI，該濃度要比正常使用濃度大而不弓胞招可細(xì)胞的標(biāo)志'1解。在本發(fā)明中，術(shù)語"微生物"是指在單細(xì)或多細(xì)^組成包膜中包含遺傳物質(zhì)、的扮可(餓或原核),胞，單細(xì)胞生物體，配偶體，鵬毒。Jd^定義的組合物可允許大針透腿微生物中，而同時僅限制性破壞其細(xì)鵬。大^T是指，大量簡單分子結(jié)合所形成的分子，例如多肽、蛋白、糖蛋白、寡核苷酸、多糖、核^DNA,RNA)、抗體、或者它們的衍生物。本發(fā)明戶雁合的大^f，通常為^f量大于1000道爾頓(lkDa)，,大于2000,頓(2kDa)，更雌大于5000跡頓(5kDa)的^T。聚乙烯3EJ^PEI)是以多種形式可獲得的可溶產(chǎn)品。^量約750kDa的聚合化^J^體形式，是本發(fā)明的，形式(CASNo.9002-98-6)。PEI可在多種領(lǐng)域中應(yīng)用，特別是在各種純化步驟中，用作溶液中蛋白和核酸的絮凝劑。由于它具有可逆性破壞細(xì)胞壁磷脂的特性，所以它也可用作透化劑，由此導(dǎo)1^脫細(xì)胞自通常不允許透化至細(xì)胞中的相關(guān)試劑z變得可透化。因此，本發(fā)明的第一目的是含PEI和EDTA組合的、會調(diào)于透化微生物細(xì)鵬的組合物。透i^且合物中PEI的濃度，可以在100-1000Mg/ml之間，,在150-900pg/ml之間，更tt^在200-800ng/ml之間。豐艮據(jù)本發(fā)明，EDTA通常出現(xiàn)在透i^且^t/中的終濃度為1-200mM，■為5-100mM。tt^ife，EDTA終濃度大于50mM，更1t^在50mM-100mM之間。^fe，該組，也包賺繊，微度通常在0.5-5mg/ml，雌在14mg/ml。本發(fā)明的另一目的涉及本發(fā)明組，的應(yīng)用，更特另哋，涉mh檢測微生物的方法，戶;M方^括將標(biāo)己t^^f透tt^微生物中的步驟。因某些詳細(xì)不明原因，PEI與EDTA組合可有助于大肝例如核苷酸探針，透化至微生物中，同時，使用溶菌酶可有助于戶脫微生物細(xì)M中所存鄉(xiāng)聚糖的片段化。，地，本發(fā)明組合物不含任何去垢劑，由皿下文詳述微生物檢測t法角度講，Hi共了許多優(yōu)點。不頓去塘劑，例如能防止破壞該方法實施所需的某些蛋白，如溶菌酶及參與信號產(chǎn)生以熒光檢測的酶。不4頓去垢劑也能更有效皿交聯(lián)，^^生物固定于MJ:。參與微生物檢測的特異性探針，雌是能與所述微生物核糖體RNAs雜交的那些寡核苷針。這^^針,包括下列序列之一SEQIDNO.1:5，TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC3，SEQIDNO.2:5，HTGTGGGATTGGCnAACCTCGCG3，SEQIDNO.3:5，GCTTCTCGTCCGTTCGCTCGAC3，SEQIDNO.4:5，ACTTTACTCCCITCCTCCCCGCTG3，SEQIDNO.5:5，AAATCACTTCACCTACGTGTCAGCG3,這，列分別允i，異性檢測綠膿桿菌(i^ewobwonosom^>7a0，枯草芽孢桿菌(fiflc說wsjw誠is)，金黃色葡萄球菌(iSfe97/^/ococa/iSowr微)，大腸桿菌(i&c/zen'c/iiiaco/z)，和腸道沙門氏菌亞禾』^1卩亞種(&/20朋//0e"terfcaarizoae)。1t據(jù)本發(fā)明，能用于微生，測方法中的大^f并不限于寡核苷酸探針，例如，它能包括可直接針^r微生物內(nèi)部成分的抗原、抗體或核酸適體，這徵質(zhì)也能用于檢測本發(fā)明的微生物。圖1示意了本發(fā)明特異性檢測微生"法的各步驟，如實施例1所示。圖2對(A)AIP生物發(fā)^il用檢測法所獲結(jié)果與(B)禾偶含1mg/ml溶菌酶、100mMEDTA、374.5Mg/mlPEI、禾口RNAse抑帝躋!j(lx濃度)作為試劑的7號透tt^合物、以根據(jù)本發(fā)明方法用相應(yīng)于SEQIDN0.2的雜交探針，特異性檢測枯草^S桿菌(及似M&)所獲結(jié)果，進(jìn)行了比較。方銜A)和(B旌同一Rh進(jìn)行，其中革蘭氏陽性菌枯草，桿菌(丑做M的細(xì)胞沉積于戶;fmh。左圖在計算機生成圖中顯示了通^±的發(fā)光檢測至啲細(xì)菌小離的位置，右圖顯示的是同一膜，雜傾斜平面上突出顯示了各個檢領(lǐng)倒的小離所鄉(xiāng)的光信號強度。產(chǎn)^M著光信號的小^m量顯示在計穀幾生成圖象的右下角。在(A)和(B)中計數(shù)的小m^M基勒胴，然而，(B)信號具有更高的微率。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明艦枯草芽艦菌(丑孤雄將異性微時所獲的計1圖，戶艦圖分別涉及細(xì)^^(A)枯草^Wf菌(及幼Mis)，(B)金黃色葡，菌CS:omt卿)，(C)綠膿桿菌(iaerwg/wora)，(D)鄉(xiāng)桿菌(Ecoft)，以及(E)腸道沙門氏菌亞利穀P亞種(5:ewten'o^wfo;a^owae)。該圖顯示，本發(fā)明方法能獲繊生物的特異性檢測。圖小9顯示了用枯草魏桿菌(丑做M&)作為耙微生物、按照實施例i戶;n己載的方案獲得的計糊生成圖。各圖分別對應(yīng)于實施例i中指定的透化組合物的4頓。在這些圖中，(A)透化在室溫下進(jìn)行，(B)透化在37'C進(jìn)行。左圖在計算機生成圖中顯示了通,上的發(fā)光檢泖倒細(xì)菌小皿的位置，右圖顯示的是傾斜平面上的同一膜，其突出顯示了各個檢測到的小離所鄉(xiāng)的光信號強度。圖4相應(yīng)于j頓含4mg/ml溶菌酶的透化組合物(組激No.l)作為透化劑。圖5相應(yīng)于使用含4m^ml溶菌酶和5mMEDTA的組合物(2號組合物)作為透化劑。圖6相應(yīng)于使用含4mg/ml溶菌酶和100mMEDTA的組合物(3號組合物)作為透化劑。圖7相應(yīng)于使用含4mg/ml溶菌酶和374.5pg/mlPEI的組合物(4號組合物)作為透化劑。圖8相應(yīng)于j柳含4mg/ml溶菌酶，5mMEDTA和374.5Mg/mlPEI的組合物(本發(fā)明的5號組合物)作為透化劑。圖9相應(yīng)于i^含4mg/ml溶菌酶，100mMEDTA和374.5Mg/mlPEI的組合物(本發(fā)明的6號組合物)作為透化劑。圖10顯示了用含4mg/mlM0酶，100mMEDTA和374.5^^mlPEI的透化組合物作為試劑，根據(jù)本發(fā)明方法特異性檢測革蘭氏陰性菌綠膿桿菌(Aewcfowowos^rwgi^ra)時，獲得的計靴頓圖。左圖在計飾生成圖中顯示了通^EJ:的發(fā)光檢領(lǐng)倒的細(xì)菌小離的位置，右圖顯示的是傾斜平面上的同一膜，其突岀顯示了M檢測到的小0^所，的光信號強度。本發(fā)明的目的更特別涉及將上述透化組合物應(yīng)用于在膜上計數(shù)和域鑒定原存在于液體或氣體介質(zhì)中的微生物的施中。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，該方^r征在于，其包括下列步驟(a)將液體或氣體介質(zhì)^^1濾,使該介質(zhì)中所雜微生物滯留于JUt鵬內(nèi)；(b)將膜和微生物與戰(zhàn)含PEI，EDTA和溶菌酶的透ttla^t^i蟲；(c)將細(xì)TO交,睏定于ai:;(d)，生物與一種或多種倉^T微生物細(xì)胞壁的可選^i己大^f接觸；以及(e)檢測透4tSA微生物的大肝。本發(fā)明方法的目標(biāo)微生物更特別選自，假單胞菌(尸^dbmoms),埃希氏菌(Esc/ien'cteO，軍團(tuán)菌(16^'0彫//0[)，沙門氏菌(&//0彫//<3),李斯特菌(Z^ter^),桿菌(萬acz7/泌)，鏈球菌(5l!r少tocomtf)，弧菌(柳rio)，耳隨氏菌(lferwy2ia),葡萄球菌(iS^/y/ococaAs)，分支桿菌(鄉(xiāng)co6octen'顧)，志賀氏菌(幼扭/械梭菌(C7ortrWww),彎曲桿菌(Cow;^/o6acte。，或氣單胞菌"erawowos)屬的革蘭氏陽性或革蘭氏陰性致病菌；賈第蟲(G^r^0,內(nèi)阿米巴(^tomoAa)，隱孢子蟲(0>tos/x)W—，^f孢子蟲(C^c/as/70ra)屬的原蟲；支原爛A^co//aswa)^il^原傲f/m/aswa)屬的支原體；曲霉屬(^!^6^///泌)，假絲酵母屬(Co^油)或青霉屬(尸朋&/范聽)的真菌；以及導(dǎo)致甲MfF超J[MfF炎的病毒，其中，戶腿微生物天然具有致病性并J3I常會在環(huán)境中iSi廿。該方法原貝y上也可用于檢測諸如藍(lán)細(xì)菌的單細(xì)胞藻類，諸如鄉(xiāng)蟲或線蟲、吸蟲或蛔蟲卵的寄生生物體的單細(xì)胞形式，或g如花粉或精蟲的其它植物或動物配偶子。本方法的目的是，對液體介質(zhì)例如水、或者氣體介質(zhì)例如空氣中所存在微生物逝Ti十?dāng)?shù)，同時盡可育^fe確定它們的種類(科、屬、種、等等)。術(shù)語"液體或氣體介質(zhì)"是指，會^13iiSffl壓力差經(jīng)膜過濾的任何流體，其中所具有的孔平均直^1常在0.1-1.5'絲，，在0.15-0.8，更,在0.2-0.6微米。這樣的流體既可以包括涉及無菌產(chǎn)品制備過程中的單純?nèi)芤?，也可?如t畑水、飲料、醫(yī)學(xué)流體(血清、尿、羊水等)的^溶液。本發(fā)明方法可在診斷領(lǐng)域中有多種應(yīng)用，用以分析源自動物或患者的液體樣品。術(shù)語"膜"在本申請中是指，具有兩面、其孔具有已知平均直徑的合皿持物。用在本發(fā)明中的膜，通常具有較高的表面/體積比，以及其固定厚度優(yōu)選90-200。這樣的膜可以為單層或多層。通常，該膜由選自下列的一種或多種材料組成聚四氟乙烯，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚碳翻旨，聚,，聚酯，聚，醋酸纖維素，和硝酸纖維素。材料雌那些能與所用激湘容的，特別是能與本方法各步驟中所4頓的麟和麟相容。微生物檢測膜，tl^要由PVDF(聚偏二氟乙烯)或Nylon②(尼龍)組成o更皿地，所^EM為Mmipore⑧公司以商標(biāo)Mimflex和貨號MXHVWP124或RMHVMFX24售賣的那種類型PVDF過濾膜。本發(fā)明方法的步驟a)在于，將待分析液體或氣體介質(zhì)鄉(xiāng)ii^J^l濾，以滯留介質(zhì)中船的微生物于膜表面。在微生物過濾并滯留于Rtt后，在本方法步驟a)和步驟b)之間，可包括將微生物與^3g培養(yǎng)基接觸培養(yǎng)的可選步驟。戶皿培養(yǎng)Stt^瓊脂培養(yǎng)基，過濾后將濾,置于其上。該可選步驟使得可獲得各初漱微生物的菌落，使檢測更容易。根據(jù)本發(fā)明，然后在步驟b)中，繊生鵬本發(fā)明的透^S糊中溫育。該溫育步驟在可在濾膜表面形成薄膜的少量溶液中進(jìn)行。^mitk，透化組合物可包含于將膜，在其上的固相支持物(例如浸漬墊)中，由此，可限制膜表面^5J可能的液,動，而避免微生物混雜。該步驟在20。C-37t:進(jìn)行5-20她本發(fā)明的方法更加有效，因為該方、跑括用交聯(lián)劑將細(xì)胞固定于ah的步該步驟可將細(xì)胞固定于自持物上。本發(fā)明tt^的交職U,選自戊二醛、甲醛和多聚甲醛，其中多聚甲醛是指由至少六個單元甲醛鄉(xiāng)賊的舒。tt^M，固定組合物可包含于將微置在其上的固相支持物(例如浸漬墊)中，由此，可限制膜表面《琉可能的液體移動，而避免微生物混雜。雌地，根據(jù)本發(fā)明，固定步驟在20。C-35。C進(jìn)行5-20餅。該固定步驟也可用UV-射線，mh照J(rèn)f微生物進(jìn)行。膜,由Nylor^組成。，生物與可經(jīng)微生物細(xì)M^(fcM^M微生物中的一種或多種可選t射己大^接觸的步驟d)，伏選在各溫育和固定步驟b)和c)終末進(jìn)行，因為這時是據(jù)觀，生物細(xì)胞自大^的性最高的0#1。在本發(fā)明,的實施方式中，將大^^ia并用^^針。術(shù)語"探針"在本文是指，會巨i湖ij、結(jié)舒賊微生物的生物元件的大肝，由此，允許戶脫微生物被f斜己。本發(fā)明優(yōu)選的一方面，探針是能與微生物中所存在DNA或RNA序歹i豫交、并對0f^核酸具有一定,特異性的大分子。本發(fā)明可,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、會巨與核麟交的任意類型探針，例如簡單寡核苷酸，2'-0甲基-RNA型寡核苷酸，PNA型Mt(嘌呤或嘧啶^代多肽^^鄉(xiāng)1^的)[NielsenRE.etal.Science(1991)254:1497-1500],或#^1』EP1013661中戶;H己載的LNA型探針(含一個或多個2，-04'-0亞甲基務(wù)1>呋喃核糖單體的寡核苷酸)。本發(fā)明人已經(jīng)注意到，能雜交微生繊糖體RNA的微，特別會調(diào)于本發(fā)明。因此本發(fā)明的一方面由下列探針鄉(xiāng)賊，其中戶;f^探針?biāo)男蛄?，與SEQIDNO.1,SEQIDNO.2,SEQIDNO.3,SEQIDNO.4，SEQIDNO.5相同，或者與±列顯示出至少80%、,90%、更優(yōu)選95%的相同性。這樣的探##別^進(jìn)行本發(fā)明的計數(shù)和/或鑒定方法。本發(fā)明的另一方面，透化至微生物中、與上述探針特性相同的大分子，可以用作引物，用于對微生物所含核酸進(jìn)考灘異性擴(kuò)增的嫩卜步驟。如果這樣的大針用于本發(fā)明方法中，那么，該驗卜但可選步驟可在步驟c)和e)之間、雌在步驟d)和e)之間弓IA^:發(fā)明方法。這樣的擴(kuò)增步驟，ffi31增加可用于檢測的核隨，對于以最佳方式檢測微生物有用。如果該擴(kuò)增步驟具有高度特異性，其也能使鑒定微生物具有更高選擇性，由此，可降低假陽性數(shù)量。這樣的擴(kuò)增雌TMA或NASBA型擴(kuò)增[Conq)ton^J.,iV^e(1991)350:91-92]，棘LAMP型擴(kuò)增[NotomiT"」c/<*ife雄c/z(2000)，28(12):e63]。J^微或引物可以進(jìn)《預(yù)計，以檢測一種軌種類型的微生物。掛匕情況下，徽或引物可艱微生物中所雜生物元件具有不同離的特異性。例如，如果弓嫩或探針是擇用于與多種微生物保守核鵬列進(jìn)行雜交的核酸，那么，該鑒定將會是相對與辦異性的；另一方面，如果辦列擇用于僅識別少數(shù)物種的特異鵬列，那么，該鑒定的特異性將較強。在本發(fā)明的又一具體實施方式中，^m，核酸探針或弓嫩與戶腐微生物核,異仏雜交的步驟，在步驟d)之后和其后進(jìn)行的檢測步驟e)之前進(jìn)行。該核#或弓嫩雜交步驟，在本領(lǐng),術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)雜交劍牛下進(jìn)行。該步驟也可包括去除3辦異',交核酸徽或引物的洗滌步驟。為進(jìn)行檢測，本發(fā)明的核酸探針或引物，^a行熒光t斜己，或者將其與能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶進(jìn)行偶聯(lián)。微生物檢測步iKe)，根據(jù)探針或引頓斜己情況用統(tǒng)的界面，ilil^湖鵬自化學(xué)發(fā)光反^^獲熒光的皿的光信號^it行。本發(fā)明的又一雌方面，核酸探針例如寡核苷酸，可與過氧化物斷禺聯(lián)。將過氧化物酶置于發(fā)光氨(過氧化物酶底物)中時，所述過氧化物酶可發(fā)出光子(生物發(fā)光鵬。膜表面小離所發(fā)光子可經(jīng)光纖維俘獲，而傳魅可將光子轉(zhuǎn)化為電子的光電陰極。^電子將產(chǎn)生電子團(tuán)，當(dāng)?shù)竭_(dá)熒光屏?xí)r，該電子團(tuán)又轉(zhuǎn)化為光子。CCD相M^上以每秒30次，記錄鄉(xiāng)光，然后，將圖象傳送至圖象分析儀。另一方面，本發(fā)明的上皿ttia合物，可用于進(jìn)行體外診斷實驗。本發(fā)明組合物的特定性質(zhì)，實際上可用于使核苷酸探針或其它任何分子復(fù)合物，透化至A^動物取樣細(xì)lfe^養(yǎng)基所保存細(xì)胞，以進(jìn)行原位檢測。本發(fā)明的透化組，也可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域的許多方面，例如用作藥物佐劑，以增加通常不易自然透^A細(xì)胞的活性成分諸如抗生素或抗病毒劑的細(xì)胞壁通透性。更特別地，本發(fā)明的組，可用于艦義核酸，特別是反義RNAs(iRNAs)透化至需要抑制某其中基因鋭的細(xì)胞，以特別用于治療遺傳疾病蝶種癌癥。本發(fā)明也包括在液體或氣體介質(zhì)中檢測并計iT微生物的試劑盒，該試劑盒一液體或氣體介質(zhì)過濾膜；和—本發(fā)明記載的透艦激。i^地，該試劑盒中戶;f^的膜，主要由PVDF或Nylon⑧組成。tt，這樣的試劑盒也包括含有選自下列交^0的組^t/:戊二醛、甲醛和多聚甲醛。該第二組合物可(生物固定于膜上，從而進(jìn)行本發(fā)明方法能獲得更好的檢泖腳率。本發(fā)明的試劑盒，也可包,異性檢測戶;f^微生物的探針，特別是如J^f述含有序列與SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4,或SEQIDNO.5具有至少80%相同性的相^。下列實施例的目的，是為了解釋本發(fā)明而不是為了限制本發(fā)明。實施例1IM物—鄉(xiāng)朦縦綠搬激將湖ij微保存于-80。C冷凍低溫管(Dutscher,ref.028049)，所述測試株從ATCC,DSMZ及NCTC登記的凍干株制備而來。為帝l搭^a管，將100ml搖瓶TS肉湯(Biom6rieux^ref.41146)在該管制備的當(dāng)天，接種并35-37'C溫育。生長期間，用光譜儀定期進(jìn)行600nmOD檢測(Eppendorf;Biq)hotometerref:6131000.012)。當(dāng)OD達(dá)到0.5時，終止生長。將600^1f驢微劑(Sigma^乙二醇冷凍細(xì)胞，ref.C6039)和600^1培糊，分輕各《ffi管?；旌显摴?，然后置于-8(TC。計M過io-5和1(^分置##，在肉湯和非冷凍低溫管中進(jìn)行。該##液制備于9ml蛋白胨水搖瓶(Biom^ie叫ref.42111)。用分布器取出各稀釋液100^1，涂覆于TSA瓊脂(Biom&ieu^ref:43011)，35。C溫育24小時。該步驟重^H次。第二天，將^^管解凍并以相同方式計數(shù)。API軟件包(Biom&ieux)能鑒定并確認(rèn)戶賴隨溫管的離。^0有湖賦中，將菌株繊釋于蛋白胨水試管(Biom&ie叫ref.42111)。通過將lml所用fffi管菌株加至試管中的9ml蛋白胨水中，可di^P制備13g獲得所期望稀釋液。用Mlliflex+真^^(Mmipore，ref:MXPPLUS01)，在帶0.45nmJ^zK網(wǎng)格型PVDF膜的MUliflexRapid濾斗上(Mmipore，refRMHVMFX24)進(jìn)考fji濾。將細(xì)菌力卩至5CM00ml含0.9%NaCl的生MltK中(B.Braun^ref0066570E)。在32.5°?！?.5"€溫育器中，將驗薩flex胰蛋白膝旭瓊月KMillipore,ref.MXSMCTS48)或R2A(Mmipore，ref.MXSMCRA48)固體培養(yǎng)基盒中溫育。溫育之后(溫育時間取決于所用細(xì)菌)，^!和生物發(fā)^^!](Millipore，ref.MXRPBLRST)用"MilliflexRapid自動噴射儀"(MMpore,re￡MXRPSPRKT)施于膜，其中戶脫噴射儀可平均分布各試劑35"于膜表面。然后，按制造商使用說明，用MlliflexR^)id系統(tǒng)(Millipore,ref.MXRPKT230)ii^M值。MilliflexRapid系統(tǒng)翻CCD相機檢測、放大并記錄，生物發(fā)光反應(yīng)發(fā)光的餘系統(tǒng)。它由CCD相機檢測臺，放大器，圖象分析儀，以及用于蝶、處理并記錄的軟件纟1^。14分析儀會減除皿信號的背景噪音，以產(chǎn)生計1傳送圖象。然后，膜示意圖會顯示在屏幕上，該系統(tǒng)^i十mh^存在的,，以數(shù)字2-io表示。裙絲發(fā)欽灘膽提微^/#激微纖就MilliflexRapid系統(tǒng)方面而言，用Milliflex+真^在帶0.45mitiPVDF膜的濾斗上(Millipore，ref.MXHVWP124)進(jìn)行過濾。將待測菌株細(xì)胞，加至50-100ml含0.9%NaCl的生理鹽水中。接著，將膜在32.5°C士2.5。C下、在MilliflexTSA培養(yǎng)基盒中(MUlipore，ref.MXSMCTS48)^育足，生物形成微M^的一段時間。將纖瓊脂培養(yǎng)驗出，然后在防滲漏支持物上(MiUipore液體培養(yǎng)基盒吸鵬，ref.MXLMCO120),將膜與2ml透化溶航室溫或37。C下鰂5-20分鐘(取決于所檢測微生物種類)。對下列透化溶、^S行檢測透化溶液No.l—^M酶4mg/ml透化溶液No.2—溶菌酶4mg/ml—EDTA5mM透化溶液No.3—溶菌酶4mg/ml—EDTA100mM透化溶液No.4—溶菌酶4mg/ml—PEI374.5Mg/ml透化溶液No.5(本發(fā)明)—溶菌酶4mg/ral—EDTA5mM一PEI374.5Mg/ml透化溶液No.6(本發(fā)明)溶菌酶EDTAPEI4mg/ml100mM374.5jjg/ml在ra透化溶液處理后，將膜與含下列成分的2ml固定溶、^^溫接觸10她一H202+尿素一甲醛—乙醇—H20然后，將膜轉(zhuǎn)移至雜體，葡聚糖—NaCl—甲鵬焦磷,-PVP—Ficoll—EDTA—TritonX-100—Tris-HCl—恥0.01%1%80%qs1L與含下列成分的1.5ml預(yù)雜交溶液接觸:10%1.74%30%0.1%0.2%0.2%0.186%1%0738%qs1L接著，將膜5(TC輕,蕩(10rpm)溫育15溯。將^^交溶液然后，用1.5ml含lOOmM探針的相同溶液替換，以ffil表面形成薄膜。這樣，在5(TC輕,蕩下(10rpm)，將,雜交溶液溫育60頒。然后，用含下列成分的20ml洗滌溶液(pH=IO)洗滌膜-CAPSO0.26%—Tween200.2%—H20qs1L將該洗滌溶^于5(TC預(yù)熱的1L水中。振蕩下(30rpm)將膜導(dǎo)入洗滌溶液，重！H次。16特異性雜交盒和特異性洗滌皿，可以M皿por^MXREXPEND貨號和MXRFWASHR貨號獲得。然后，將鵬包含作用于與寡核苷酸探針偶聯(lián)的過氧化物^^的發(fā)光試劑噴射劑(發(fā)光氨和過氧化氫—Millipore,ref.WBKLS0050)的噴射儀(MilliflexRapid自動噴射儀)處理，然后，以常規(guī)檢測的相同方式以MilliflexRapidR國pseudo辦，進(jìn)行圖象分析。透化實驗中所測試的各化學(xué)產(chǎn)品，來自Sigma-Aldrid^公司溶菌酶(ref.L6876),EDTA(ref.E5134),聚乙烯M^(ref:P3143),葡錄糖酸氯己定(ref.C9394),精氨酸乙酯(ref!A2883)，蛋白酶K(ref!P4850)，RNase抑制劑(ref.R7397)。溶液于PBS(Gibco,ref.20012-019)制備，并用液體培養(yǎng)基^Zffi于膜。為特異性檢測革蘭氏陽性菌枯草^m桿菌(^d7/泌幼Mto)，將iOT，1-6的各種透化溶游萬獲結(jié)果示于圖4~9。為證實Rh所出現(xiàn)所有細(xì)菌被有^ig化，計算本發(fā)明透化和雜交方割萬檢測皿數(shù)量(使用SEQIDN0.2序列寡核苷酸探針)與常規(guī)瓊B針咅養(yǎng)基計itff檢測0^C量的比率(覆蓋率)。所獲結(jié)果及相應(yīng)的覆蓋率，在下表l中給出。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>從表l可以看出，最有效的透化溶液是貪離酶(4mg/ml)，EDTA(100mM)和？￡1(374.5嗎/1111)的6號組合物，特別是當(dāng)實在37'C使用時。接著，針對該6號組合物進(jìn)行，兩種不同濃度溶菌斷l(xiāng)和4mg/ml)，以確定是否能獲得最佳覆蓋率。對這兩種濃度比較，按±^特異性檢測方案、以枯草魏桿菌(丑仰M&)作為檢測耙，進(jìn)行。鶴結(jié)果示于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>該結(jié)果顯示，lmg/ml溶菌酶濃度根據(jù)本發(fā)明，比4mg/ml該更高濃度，可獲得更腦果。對包含下列成分的"優(yōu)化"透化組^tfNo.7:一溶菌酶1mg/ml—EDTA100mM一PEI374.5^ml—RNAse抑制劑IX按戰(zhàn)指定方案和常規(guī)檢測方案(平行對照)，對枯草魏桿菌(及w夠進(jìn)行觀賦。結(jié)果示于圖2。按R-Pseudo圖象分析i^i十?dāng)?shù)離數(shù)量而計算出的鶴率，為100%。用SEQIDN0.3序列寡核苷酸探針，對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(5&;v/ococaAsaMreMS)(表3)獲得了相似結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>目的在于按本發(fā)明附己載特異性檢測方法是否能特異性檢測枯草，桿菌的(丑似M嗣實驗，用下列5種微生物進(jìn)行枯草芽孢桿菌(丑孤M&)，金黃色葡萄球菌CS:owr卿)，綠膿桿菌(iam/gihora)，大腸桿菌(Eco/z)，和腸道沙門氏菌亞利桑那亞種(Sewten'ca甜fesp^^oMoe)。在TSA培養(yǎng)基25。C過夜溫育之后，進(jìn)行實驗，以保跡有微生物都生長。艦枯草鄉(xiāng)桿菌(丑幼闊特異性探針(SEQIDN0.2)獲得的結(jié)果示于圖3。根據(jù)本發(fā)明在37。C下在浸潤SJ^OT6號透^M^(4mg/ml溶菌酶+100mMEDTA+374.5ng/mlPEI)20^H41，以與枯草芽孢桿菌(及5"M/is)相同的方式特異性檢測革蘭氏陰性菌綠膿桿菌(/^ewGfowomsoen^'朋犯)。為此目的，使用相應(yīng)于SEQIDNO.l序列的寡核苷酸探針作為雜交探針。該實驗*^所獲圖象，經(jīng)圖象分析儀，示于圖10。可以觀察到，本發(fā)明方法允許艦地^^所檢測細(xì)菌的小離。序列表<110>米利波爾公司(MILLIPORECORPORATION)〈120含乙二胺四乙酸(EDTA)和聚乙烯亞胺(PEI)的組合、能滲透微生物細(xì)胞壁的新組合物<130>BIF117190FR<150>FR0754623<151>2007-04-20<160〉5〈170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>25<212>DM<213>artificialDNA<220><221〉misc—binding<222>(1)..(25)<223>hybridizationprobeforthespecificdetectionofPseudomonasaeruginosaRNA<400〉1tctaccgcgtcacttacgtgacacc25<210>2<211>25<212>DNA<213>artificialDNA<220><221>misc—binding<222〉(l)..卿<223>hybridizationprobeforthespecificdetectionofBacillussubtilis■<400>2tttgtgggattggcttaacctcgcg2520<210〉3<211>22<212>DNA<213>artificial腿<220><221>misc_binding<222>(1)..(22)<223>hybridizationprobeforthespecificdetectionofStaphylococcusaureusRNA<400>3gcttctcgtccgttcgctcgac22〈210>4<211>24<212>腿<213〉artificialDNA<220><221>misc—binding<222〉(1)..(24)<223>hybridizationprobeforthespecificdetectionofEscherichiacoliRNA<400〉4actttactcccttcctccccgctg24<210>5<211〉25<212>DNA<213〉artificialDNA<220><221〉misc_binding<222>(1)..(25)<223>hybridizationprobeforthespecificdetectionofSalmonellaenterica腿<400>5aaatcacttcacctacgtgtcagcg2權(quán)利要求1、用于透化微生物細(xì)胞壁的組合物，其特征在于其包括聚乙烯亞胺(PEI)和乙二胺四乙酸(EDTA)的組合，并且在所述組合物中，PEI終濃度大于100μg/ml，EDTA終濃度大于50mM。2、權(quán)利要求1的組^tl，，征在于其進(jìn)一步包括溶菌酶。3、權(quán)利要求1和2任一項的組合物，，征在于EDTA在終組合物中的濃度在5(M50mM之間，優(yōu)選在50-100mM之間。4、權(quán)利要求i-3ft"項的組合物，辦征在于戶;M^且^t;中pei濃度在100-900Mg/ml之間，ifej^在200-800^i^ml之間。5、權(quán)利要求"任一項的組，，辦征在于其不包含倒可去培劑。6、在膜上計數(shù)和/或鑒定原存在于液體或氣體介質(zhì)中的微生物的方法，其特征在于其包括下列步驟(a)將液體或氣體介質(zhì)鄉(xiāng)M過濾，以使該介質(zhì)中所存在的微生物滯留于肚鵬內(nèi)；(b)將戶;M和微生物與權(quán)利要求1-5的用于透化微生物細(xì)鵬的組糊,；(c)用交^0將細(xì)胞固定于膜il;(d)將微生物與一種或多種倉^31微生物細(xì)胞壁的任選地標(biāo)記的大分子劍蟲；(e)檢測穿3^S微生物中的大好。7、權(quán)利要求6的方法，賺征在于雜步驟a)和步驟b)之間，包蹄養(yǎng)該微生物的緲卜步驟。8、權(quán)利要求6和7^^項的方法，，征在于步驟c)中用作交ra鵬試劑選自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。9、權(quán)利要求6-8^E-項的方法，，征在于在步驟d)中所用大^為雜交微，i^核苷酸或PNA-,交微。10、權(quán)利要求9的方法，辦征在于該雜交探針與戶腿微生物的RNA雜交。11、權(quán)利要求io的方法，其特征在于^^交mh與所述微生物的核糖體RNA雜交。12、權(quán)利要求9-lUi^項的方法，，征在于步驟d)中所用^V交探針?biāo)墓押塑?列與選自SEQIDNO.1,2,3，4和5的序列具有至少80%相同性。13、權(quán)利要求6-12任一項的方法，，征在于在步驟d)中，戶腐大^f通過與允許發(fā)出M熒光信號的酶偶^^^ia。14、權(quán)利要求13的方法，其特征在于步驟e)中微生物的檢測MM化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)并用^ii的界面識別發(fā)出的光信號而進(jìn)纟亍的。15、權(quán)利要求6-14任一項的方法，辦征在于絲步驟d)和步驟e)之間，包括^或弓嫩與戶腿微生物的核斷寺異脇交的嫩卜步驟。16、權(quán)利要求645fr^項的方法，辦征在于絲步驟c)和步驟e)之間，包括，生物中所M的核^^灘異性擴(kuò)增的客砂卜步驟。17、權(quán)利要求6-16^~項的方法，，征在于用于微生,測的te要由PVDF或nylon⑧艦。18、權(quán)利要求1-5^"項的透化組^H^:^穿,分離的細(xì)i^:微生物中的應(yīng)用。19、權(quán)利要求1-5任一項的透似且，在計數(shù)禾P/或鑒定微生物的方法中的應(yīng)用。20、包含PEI和EDTA組合的透化組^J作為藥物佐劑的，。21、檢測并計數(shù)微生物的試劑盒，賺征在于其包括一至少一種^i己的大M;和—權(quán)利要求1-5任一項的用化微生物細(xì)鵬的組，。22、權(quán)利要求21的試劑盒，辦征在于其還包齢交職啲組合物，臓交聯(lián)劑選自戊二醛、甲醛和多聚甲醛。23、權(quán)利要求21或22任一項的試劑盒，，征在于戶;f^禾私己的大分子由雜交探針艦。24、權(quán)利要求23的試劑盒，，征在于新己的大分子由含有下^Jf列的雜交探針鄉(xiāng)賊，其中戶;f^列與SEQIDNO.1-5的任一序列具有至少80%相同性。25、權(quán)利要求21-2"h項的試劑盒，賺征在于其還包括濾膜掘PVDF或Nylon②膜。全文摘要本發(fā)明涉及能透化微生物細(xì)胞壁的組合物，其含聚乙烯亞胺(PEI)和乙二胺四乙酸(EDTA)的組合，以及利用上述組合物靶向計數(shù)和檢測膜上微生物的方法。本發(fā)明也涉及含適于執(zhí)行上述方法的探針的試劑盒。文檔編號C12Q1/04GK101451159SQ20081012589公開日2009年6月10日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日發(fā)明者F·馬克,M·霍納德爾申請人:米利波爾公司