使用含丙烯酰胺的過濾器分離蛋白的制作方法
【專利摘要】用于從含有感興趣的蛋白(例如，抗體)的樣品去除雜質(zhì)(如蛋白聚集體)的新穎組合物。可以在蛋白純化過程中的病毒過濾步驟之前使用這種組合物，以便去除聚集體且保護病毒過濾器免于淤塞，因此改進病毒過濾器容量。包括具有至少兩種單體的共聚物的多孔固體支持物，其中所述單體中的至少一種包含丙烯酰胺且至少第二單體包含疏水性結(jié)合基團，其中所述固體支持物選擇性結(jié)合蛋白聚集體，由此將感興趣的單體蛋白與蛋白聚集體分離?？梢栽谥行灾粮遬H和高導(dǎo)電率條件下進行所述方法。
【專利說明】使用含丙稀醜胺的過濾器分離蛋白
[0001 ]本申請要求2013年12月12日提交的美國臨時申請序列號61 /915，125的優(yōu)先權(quán)，所 述申請通過引用并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本文公開的實施方案設(shè)及使用含丙締酷胺的過濾器從含有感興趣的產(chǎn)物的生物 藥物制劑去除雜質(zhì)(包括蛋白聚集體)的方法。
[0003] 背景 用于蛋白純化的常規(guī)方法通常設(shè)及細胞培養(yǎng)方法，例如，使用經(jīng)重組工程改造 W產(chǎn)生 感興趣的蛋白（例如，單克隆抗體）的哺乳動物或細菌細胞系，隨后為從細胞培養(yǎng)液移取細 胞和細胞碎片的細胞收獲步驟。細胞收獲步驟通常隨后為捕獲步驟，其通常隨后為一個或 多個層析步驟，也稱為精加工步驟(polishing St邱S)，通常包括陽離子交換層析和/或陰 離子交換層析和/或疏水性相互作用層析和/或混合模式層析和/或徑基憐灰石層析中的一 種或多種。在捕獲步驟之后也可W包括病毒滅活步驟。拋光步驟通常隨后為病毒過濾和超 濾/滲濾，其完成純化過程。參見，例如，Shukla等人，J. Chromatography B., 848 (2007) 28-39; Liu等人，MAbs, 2010: S巧-Oct 2(5): 480-499。
[0004] 病毒過濾步驟是蛋白純化中的重要步驟，尤其是當期望產(chǎn)品用于診斷或治療應(yīng)用 中時。病毒過濾步驟通常利用保留病毒顆粒、同時允許感興趣的蛋白通過的病毒保留過濾 器。實現(xiàn)有效的病毒過濾的挑戰(zhàn)之一在于，一些雜質(zhì)，尤其是蛋白聚集體，具有與病毒顆粒 類似的大小。因此，蛋白聚集體最終渺塞或堵塞病毒保留過濾器，由此顯著降低感興趣的蛋 白通過過濾器的流速。
[0005] 雜質(zhì)如蛋白聚集體在純化過程的不同階段形成，并且為了維持病毒保留過濾器的 足夠通量，需要在到達病毒保留過濾器之前去除蛋白聚集體?，F(xiàn)有技術(shù)中已嘗試實施基于 疏水相互作用層析化1C)介質(zhì)的流通聚集體去除（參見例如美國專利號7,427,659)。但是， 基于HIC的制備型分離具有窄應(yīng)用性，運是因為通常方法開發(fā)難，操作窗口窄，并且緩沖液 中所需的鹽濃度高。
[0006] 弱分配層析(WPC)是層析操作的另一種模式，其中產(chǎn)物結(jié)合比結(jié)合-洗脫層析情況 下更弱，但比流通層析情況下更強(參見例如美國專利號8,067，182);但是，￥?(：也具有與其 相關(guān)的特定缺點，包括操作窗口窄和與結(jié)合-洗脫方法相比更低的雜質(zhì)去除容量。
[0007] 此外，選擇性去除蛋白聚集體的最方便方式之一是通過使蛋白和/或其他生物分 子的溶液在到達病毒保留過濾器前通過過濾介質(zhì)，由此去除蛋白聚集體，允許所純化的蛋 白流過病毒保留過濾器。運種過濾器的實例可見于美國專利號7，118,675，其討論在病毒過 濾步驟前，使蛋白和病毒的溶液過濾通過吸附深度過濾器或帶電荷或表面改性的膜。
[000引此外，PCT公開號W02010/098867討論使用帶負電荷的多孔介質(zhì)用于去除蛋白聚集 體，且PCT公開號W02012/175156討論基于聚酷胺的過濾器用于去除蛋白聚集體。最后，2013 年3月4日提交的美國申請序列號13/783,941，US 20130245139 A1討論使用包含陽離子交 換基團的組合物用于去除蛋白聚集體，但是，其中描述的組合物僅在適合于陽離子交換層 析的抑和導(dǎo)電率條件下操作良好。
[0009] 概述 本文^的實施方案提供用于從含有感興趣的蛋白（例如，抗體）的樣品去除雜質(zhì)（如 蛋白聚集體)的新穎組合物。因此，可W在蛋白純化過程中的病毒過濾步驟之前使用運種組 合物，W便去除聚集體且保護病毒過濾器免于渺塞，因此提高病毒過濾器容量。
[0010] 本文描述的組合物相比于先前已知在病毒過濾步驟前使用W去除雜質(zhì)（如蛋白聚 集體)的組合物提供優(yōu)點，因為它們可W在廣泛范圍的溶液條件下使用。
[0011] 在一些實施方案中，所述組合物是帶負電荷的。在其他實施方案中，所述組合物是 中性的(疏水的）。
[0012] 在一些實施方案中，所述組合物可W在低抑和低導(dǎo)電率條件下使用(例如，帶負電 荷的組合物）。在其他實施方案中，所述組合物可W在中性至較高抑和中度至高導(dǎo)電率條件 下使用(例如，疏水性組合物）。
[0013] 在一些實施方案中，提供從樣品中的蛋白聚集體分離感興趣的單體蛋白的流通方 法，其中所述方法包括使所述樣品與包含共聚物(其包含至少兩種單體)的多孔固體支持物 接觸，其中所述單體中的至少一種包含丙締酷胺，且至少第二單體包含疏水性結(jié)合基團，其 中所述固體支持物選擇性結(jié)合蛋白聚集體，由此從蛋白聚集體分離感興趣的單體蛋白；且 其中所述方法可W在有利于疏水性相互作用的條件(例如，中性至較高抑和中度至高導(dǎo)電 率條件)下進行。
[0014] 在一些實施方案中，疏水性結(jié)合基團選自乙基、下基、己基、2-乙基己基、十二燒 基、硬脂基、徑丙基、苯基和芐基。
[0015] 在一個具體實施方案中，所述疏水性結(jié)合基團是芐基丙締酷胺。
[0016] 在一些實施方案中，根據(jù)本文描述的組合物的共聚物包含W下結(jié)構(gòu)：
其中X、y和Z是該共聚物中的各單體的平均摩爾分數(shù)，且獨立地范圍為約0.01至0.99; Ri是選自乙基、下基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、徑丙基、苯基和芐基的疏水 性脂族或疏水性芳族結(jié)合基團； R2是兩種聚合物之間的衍生自選自丙締酸醋類、丙締酷胺類、甲基丙締酸醋類、乙締基 酸類和苯乙締類的可聚合的單體的不帶電荷的脂族或芳族有機接頭;且 m表示類似的共聚物鏈在接頭的另一端連接。
[0017] 在一些實施方案中，根據(jù)本文描述的組合物的共聚物包含W下結(jié)構(gòu)：
其中X和y是該共聚物中的各單體的平均摩爾分數(shù)，且獨立地范圍為約0.01至0.99;且 R堪選自乙基、T基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、徑丙基、苯基和芐基的疏水性脂 族或疏水性芳族結(jié)合基團，其中所述共聚物經(jīng)由共價鍵接枝至顯示為矩形的固體支持物 上。
[0018] 在本文描述的各種結(jié)構(gòu)中，所述疏水性結(jié)合基團是芐基丙締酷胺。在某些實施方 案中，提供過濾系列，其包括預(yù)過濾器、澄清過濾器、層析介質(zhì)(例如，陽離子交換、陰離子交 換）、膜吸附器和去除產(chǎn)品/過程污染物的病毒清除過濾器中的一種或多種。
[0019] 在某些實施方案中，所述預(yù)過濾器包含多孔固體支持物，所述多孔固體支持物包 含含有至少兩種單體的共聚物，其中所述單體中的至少一種包含丙締酷胺且至少第二單體 包含疏水性結(jié)合基團。
[0020] 附圖簡述 圖1描繪了等高線圖，其表明當對于不同pH和導(dǎo)電率值的IgG進料溶液在病毒過濾器的 上游使用帶負電荷的預(yù)過濾器時病毒過濾器Viresolve ? Pro的通量。X-軸代表導(dǎo)電率 (mS/cm)，且右側(cè)Y-軸代表抑。
[0021] 圖2描繪了柱狀圖，其表明當在病毒過濾器的上游使用下列預(yù)過濾器時Viresolve ? Pro (VPro)病毒過濾器的質(zhì)量通量：含有1.8% AMPS和3.0% AM的預(yù)過濾器(3);含有 1.5% AMPS和3.3% DMAM的預(yù)過濾器(4);含有1.8% AMPS和3.0% DMAM的預(yù)過濾器(5);含有 2.1% AMPS和2.7% DMAM的預(yù)過濾器(6);含有2.4% AMPS和2.4% DMAM的預(yù)過濾器(7);含有 4.8% AMP巧日0% DMAM的預(yù)過濾器(8);含有 1.5% AMP巧日3.3% BMA(9);含有 1.8% AMP巧口 3.0% BMA的預(yù)過濾器（10);含有2.1% AMPS和2.7% BMA的預(yù)過濾器（11);含有1.8% AMPS和 3.0% I0A的預(yù)過濾器（12);含有1.8% AMPS和6.0% I0A的預(yù)過濾器（13);含有1.5% AMPS和 3.3% HPMAM的預(yù)過濾器（14)和含有2.5% AMPS和2.3% HPMAM的預(yù)過濾器（15)。柱狀圖中的 前兩個柱描繪對照：僅病毒過濾器(1)和無任何改性的預(yù)過濾器基膜(2)dX-軸代表預(yù)過濾 器組合物，且巧由代表在V75Wkg IgG/ m2病毒膜過濾器計的質(zhì)量通量。在3.1 cm2的預(yù)過濾 器:病毒過濾面積比率為1:1。
[0022] 圖3描繪了運樣的圖，其表明對于各種預(yù)過濾器/病毒過濾器組合的緩沖液和蛋白 溶液的體積VS .時間曲線(表2)。曲線的斜率對應(yīng)于滲透率。X-軸代表時間(min)，且Y-軸代 表體積(mL)。含有1.8% AMPS和3.0% AM的預(yù)過濾器(3)是顯示在用于初始流量的相同緩沖 液中存在IgG的情況下的滲透率增加的唯一系列。
[0023] 圖4描繪了柱狀圖，其代表各種預(yù)過濾器/病毒過濾器組合(X軸）的過濾系列的滲 透率變化(y-軸，WLMH/psi計）（表2)，因為它們從僅緩沖液切換為相同緩沖液中的IgG溶 液。包含含有1.8% AMPS和3.0% AM的預(yù)過濾器(3)的系列是顯示在IgG存在的情況下的滲透 率增加的唯一系列。
[0024] 圖5描繪了圖3和4中對于含有丙締酷胺的膜表面(預(yù)過濾器3)觀察到的滲透率增 加的可能機制的圖示。預(yù)過濾器3/VPro組合(表2)的滲透率增加是由與帶正電荷的IgG的離 子相互作用導(dǎo)致的含有丙締酷胺的獨特帶負電荷的水凝膠表面的結(jié)果。
[0025] 圖6描繪了在pH 4.0和在不同的溶液導(dǎo)電率(廠軸，mS/cm)的表3中的各種CEX表面 改性膜對于IgG的靜態(tài)結(jié)合容量(廠軸，Wmg IgG/mL膜計）。膜3和17中小的、中性和親水性 的丙締酷胺與CEX結(jié)合基團AMI^的存在得到獨特的聚合物水凝膠，其在《25 mS/cm的導(dǎo)電 率提供更大的靜態(tài)IgG容量。
[0026] 圖7描繪了在CEX結(jié)合條件下等效動態(tài)負載至膜之后，表3中的各種CEX表面改性膜 (X軸)對于IgG的聚集體結(jié)合容量(5^-軸，mg/mL)。使用等效負載后的CEX洗脫物W測定表4中 的膜的IgG容量、通過分析型大小排阻色譜(SEC)的聚集體選擇性，并計算聚集體容量。對于 表3中的膜測量動態(tài)CEX聚集體容量W定量表3中的膜的聚集體選擇性差異。
[0027] 圖8顯示，具有更高聚集體容量的膜（表4,圖7)傾向于提供更好的病毒過濾器 (Vireso 1 ve ? Pro)保護，由此使用實施例1中的方法得到更高的IgG質(zhì)量通量(右側(cè)Y-軸）。 [002引圖9是包括來自表4的膜3、16、5和8的進料負載溶液和洗脫物的歸一化的56(：-冊1〔 覆蓋的代表性色譜圖（廠軸是UV230皿Ab，且X-軸W分鐘計）。重疊顯示，與無中性共單體的 膜8和16或具有共單體DMAM的膜5相比，含有丙締酷胺的膜3的洗脫物具有更高百分數(shù)的聚 集體。該結(jié)果表明，丙締酷胺的存在改進對于聚集體的膜選擇性(從6-8.5分鐘的更大峰面 積)。
[00巧]圖10、11和12顯示，與不含丙締酷胺的膜5、6、7或8(表5，x-軸)相比，用2.5 % BAM、 1.0%或2.0%丙締酷胺改性的膜3和4(表5)提供病毒去除過濾器的更大保護（kg/m2,廠軸） (在pH7.0和5mS/cm，pH7.5和15mS/cmW及抑6.0和25mS/cm，更大的質(zhì)量通量）。在巧中 溶液條件下，含丙締酷胺的膜3和4還提供與病毒預(yù)過濾器(Viresolve ?預(yù)過濾器）（主要是 疏水性機制)類似的質(zhì)量通量，和比Viresolve ? Shield (CEX機制)好得多的通量。
[0030] 圖13顯示了膜(3)(表5和6)比來自表6的市售的預(yù)過濾器和未改性的膜在pH 6.0 和25 mS/cm提供病毒清除過濾器的更大保護化g/m2，y-軸）。
[0031] 圖14(表7)顯示了膜(3)與未預(yù)過濾的Vpro相比在降低壓力增加(y-軸）W降低渺 塞方面是有效的，并且在pH 7.0、4.2 mS/cm、15.3 g/L、0.22 mL/min (166 LMH)下提供 VPro對于含有0.8%聚集體(通過SEC-冊LC)的MAbO 1的更大的質(zhì)量通量(X-軸）。
[0032] 圖 15(表7)顯示了對于在抑 7.5、18 mS/cm、9.2 g/L、0.22 mL/min (166 LMH)下 對于MAb05,與未預(yù)過濾的VPro相比，膜(3)保護VProW通過降低壓力（其指示渺塞）（y-軸） 而使含有0.4%聚集體(通過SEC-冊LC)的MAb 05的質(zhì)量通量(X-軸)改進4倍。
[0033] 圖 16(表7)顯示了對于在pH 7.0、8 mS/cm、8 g/L、0.22 血/min (166 LMH)下對于 含有4%聚集體(通過SEC-HPLC)的MAb07，與未預(yù)過濾的VPro病毒過濾和用由聚酷胺構(gòu)成的 未改性的膜過濾器(5) W及商業(yè)除菌級膜過濾器(4)相比，膜(3)保護VProW通過降低壓力 增加(其指示渺塞）(y-軸)而提高質(zhì)量通量(X-軸，kg/m2)。
[0034] 詳述 為了易理解本文公開的實施方案，首先定義某些術(shù)語。其他定義在整個詳述中闡 述。
[0035] I.定義 本文中使用的術(shù)語"層析"是指在生物藥學(xué)制劑中將感興趣的產(chǎn)物(例如治療性蛋白或 抗體)與污染物和/或蛋白聚集體分離的任何種類的技術(shù)。
[0036] 本文中可互換使用的術(shù)語"流通方法"、"流通模式"和"流通層析"是指產(chǎn)物分離技 術(shù)，其中含有感興趣的產(chǎn)物的生物藥學(xué)制劑意欲流通過材料。在一些實施方案中，感興趣的 產(chǎn)物流通過材料，并且不期待的種類與材料結(jié)合。在本文描述的各個實施方案中，感興趣的 產(chǎn)物流通過含有丙締酷胺的材料。在一個具體實施方案中，所述材料含有包含丙締酷胺的 共聚物，其中所述材料在蛋白純化過程中的病毒過濾步驟前施用，即用作病毒過濾器。
[0037] 本文可互換使用的術(shù)語"污染物"、"雜質(zhì)"和"碎片"是指任何外源或者不適宜的分 子，包括生物大分子如DNA、RNA、一種或多種宿主細胞蛋白、內(nèi)毒素、脂質(zhì)和一種或多種添加 劑，所述添加劑可存在于含有待與一種或多種外源或者不適宜的分子分離的感興趣產(chǎn)物的 樣品中。此外，運種污染物可包括可在分離方法前進行的步驟中使用的任何試劑。在一個特 定實施方案中，本文所述的組合物和方法將蛋白聚集體與含有感興趣產(chǎn)物的樣品選擇性分 離。在一些實施方案中，本文描述的組合物和方法在病毒過濾步驟前使用，由此通過過濾器 去除渺塞病毒保留過濾器且對感興趣的蛋白的滲透率產(chǎn)生不利影響的蛋白聚集體和其他 雜質(zhì)。
[0038] 術(shù)語"免疫球蛋白"、"Ig"或"抗體"（本文可互換使用）是指具有基礎(chǔ)的四-多膚鏈 結(jié)構(gòu)的蛋白，該結(jié)構(gòu)由兩個重鏈和兩個輕鏈構(gòu)成，所述鏈例如通過鏈間的二硫鍵穩(wěn)定，該蛋 白具有特異性結(jié)合抗原的能力。術(shù)語"單鏈免疫球蛋白"或"單鏈抗體"（本文可互換使用)是 指具有二-多膚鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，該結(jié)構(gòu)由一個重鏈和一個輕鏈構(gòu)成，所述鏈例如通過鏈間的 膚接頭穩(wěn)定，該蛋白具有特異性結(jié)合抗原的能力。術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"是指包含膚環(huán)(例如包括3- 4個膚環(huán)）的重鏈或輕鏈多膚的球形區(qū)域，所述球形區(qū)域例如通過β-片層和/或鏈內(nèi)的二硫 鍵穩(wěn)定?；谠?恒定"結(jié)構(gòu)域的情況下各類成員的結(jié)構(gòu)域中相對缺少序列變化、或在"可 變"結(jié)構(gòu)域的情況下各類成員的結(jié)構(gòu)域中的明顯變化，在本文中將結(jié)構(gòu)域進一步稱為"恒定 腳'或"可變的"。抗體或多膚"結(jié)構(gòu)躁'通常在本領(lǐng)域中可互換地被稱為抗體或多膚"區(qū)躁'。 抗體輕鏈的"恒定"結(jié)構(gòu)域可互換地被稱為"輕鏈恒定區(qū)域"、"輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域"、乂L"區(qū)域 或乂L"結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的"恒定"結(jié)構(gòu)域可互換地稱為"重鏈恒定區(qū)域"、"重鏈恒定結(jié)構(gòu) 域"、"如'區(qū)域或"如'結(jié)構(gòu)域?？贵w輕鏈的呵變"結(jié)構(gòu)域可互換地稱為"輕鏈可變區(qū)域"、"輕 鏈可變結(jié)構(gòu)域"、"VL"區(qū)域或"VL"結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的"可變"結(jié)構(gòu)域可互換地稱為"重鏈可 變區(qū)域"、"重鏈可變結(jié)構(gòu)域"、"VH"區(qū)域或"VH"結(jié)構(gòu)域。
[0039] 免疫球蛋白或抗體可W是單克隆或多克隆的，并且W單體或多聚形式存在，例如 W五聚形式存在的IgM抗體和/或W單體、二聚或多聚形式存在的IgA抗體。術(shù)語"片段"是指 比完全或完整的抗體或抗體鏈包含更少的氨基酸殘基的抗體或抗體鏈的部分。片段可通過 對完全或完整抗體或抗體鏈的化學(xué)或酶處理而得到。片段還可通過重組方法得到。示例性 片段包括化bJab'、F(ab'）2、Fc和/或Fv片段。
[0040] 術(shù)語"抗原-結(jié)合片段"是指結(jié)合抗原或與完整抗體(即與它們來源于的完整抗體） 競爭抗原結(jié)合（即特異性結(jié)合）的免疫球蛋白或抗體的多膚部分。結(jié)合片段可通過重組DNA 技術(shù)、或通過完整的免疫球蛋白的酶或化學(xué)切割得到。結(jié)合片段包括化b Jab'、F(ab'）2、 Fv、單鏈和單鏈抗體。
[0041] 本文中使用的術(shù)語"樣品"是指任何含有待純化的目標蛋白的組合物或混合物。樣 品可衍生自生物或其他來源。生物來源包括真核和原核來源，如植物和動物細胞、組織和器 官。在一些實施方案中，樣品包括含有待純化的感興趣的蛋白的生物藥物制劑。在一個具體 實施方案中，所述樣品是含有待純化的蛋白的細胞培養(yǎng)物進料。樣品還可包括稀釋劑、緩沖 劑、洗涂劑和發(fā)現(xiàn)與目標蛋白或感興趣的蛋白混合的污染性種類、碎片等。樣品可W是"部 分純化的"（即已進行一種或多種純化步驟，如過濾步驟）、或可從產(chǎn)生目標分子的宿主細胞 或生物體直接得到(例如，樣品可包括收獲的細胞培養(yǎng)流體）。在一些實施方案中，進行本文 所述的流通純化方法的樣品是來自結(jié)合-洗脫層析步驟，例如蛋白A親和層析的洗脫物。
[0042] 術(shù)語"病毒膜堵塞種類"或"病毒膜堵塞雜質(zhì)"可指明顯促進經(jīng)設(shè)計W保留病毒顆 粒的多孔膜(即，病毒過濾膜或病毒保留膜)的孔阻塞或渺塞的溶液的任何可溶性或溶解的 組分。通常，運些種類的大小將大于感興趣的蛋白，并且在一些情況下，可W與意欲由病毒 膜保留的病毒顆粒的大小相當。
[0043] 在各個實施方案中，本文提供的組合物意欲捕獲運種病毒膜堵塞種類，并且在蛋 白純化過程期間的病毒保留膜前使用。在各個實施方案中，所述病毒膜堵塞種類包括蛋白 聚集體。
[0044] 本文可互換使用的術(shù)語"蛋白聚集體"或"蛋白聚集物"是指至少兩分子感興趣產(chǎn) 物(例如治療性蛋白或抗體）的締合。至少兩分子感興趣產(chǎn)物的締合可通過任何方式產(chǎn)生， 包括但不限于共價、非共價、二硫化或不可還原的交聯(lián)。
[0045] 使用大小排阻層析(SEC)測量蛋白樣品中的聚集體濃度，所述大小排阻層析是現(xiàn) 有技術(shù)中公知且廣為接受的方法（參見例如Gabrielson等人，/.化arm. Sci.，96， (2007)，268-279)。使用UV吸光度在流出物中測量各分子量種類的相對濃度，而通過按照 柱制造商的說明進行系統(tǒng)校正而測定級分的分子量。
[0046] 本文可互換使用的術(shù)語"二聚體"、"蛋白二聚體"或"蛋白二聚物"是指蛋白聚集體 的低階級分，其主要由含有兩個單體分子的聚集體構(gòu)成，但還可含有一些量的Ξ聚體和四 聚體。該級分通常觀察為在主單體峰之前不久的SEC色譜圖中的第一個可分辨的峰。
[0047] 本文可互換使用的術(shù)語"高分子量聚集體"或"HMW"是指蛋白聚集體的高階級分， 即五聚體及更高聚集體。該級分通常觀察為二聚體峰之前的SEC色譜圖中的一種或多種峰。
[0048] 本文中使用的術(shù)語"固體支持物"通常是指包括包含丙締酷胺和疏水性結(jié)合基團 的共聚物的任何材料(多孔或無孔的）。本文所述的方法和組合物中使用的固體支持物形式 的實例包括但不限于膜、多孔珠、翅狀纖維(winged fibers)、整料、層析樹脂、紡織布和無 紡布。
[0049] 本文中使用的術(shù)語"選擇性"是指;流動相和固定相之間的兩種種類的分配系數(shù)的 無量綱比值。分配系數(shù)化P)是比率Q/C，其中Q和C分別是結(jié)合蛋白濃度和游離蛋白濃度。
[0050] 本文中使用的術(shù)語"疏水性結(jié)合基團"是指能夠與另一疏水性表面分子間締合(其 被定義為疏水性相互作用）的非極性脂族或芳族有機"疏水性"殘基。示例性疏水性基團是 烷基、環(huán)烷基、面代烷基、氣烷基、芳基等。在一個具體實施方案中，疏水性結(jié)合基團是芐基 丙締酷胺。
[0051] 術(shù)語"中性至較高姐'是指從離子在水中的平衡巧為化〇+][0口 = 1.0 X 10-?4， 其中抑=-log陽30?)測定的0-14的刻度的6或更大的pH。
[0052] 術(shù)語"中度至高導(dǎo)電率"是指其中W毫西口子/厘米測量的離子電導(dǎo)率等于或通常 大于5 mS/cm的溶液條件。溶液導(dǎo)電率是通過測定由固定距離分開的兩個平面或圓柱形電 極之間的溶液的電阻而測量的具有電解質(zhì)的溶液的導(dǎo)電率。
[0053] 術(shù)語"病毒預(yù)過濾器"或"預(yù)過濾器"是指病毒過濾器或病毒保留過濾器上游使用 且用于通過去除過早堵塞病毒過濾器的雜質(zhì)（例如，蛋白聚集體)而提高病毒過濾器的通量 的正常流動過濾介質(zhì)、膜或裝置。
[0054] 術(shù)語"病毒過濾器"或"病毒保留過濾器"是指通過大小排阻機制保留20-100皿的 量級的病毒或病毒顆粒W便在蛋白純化過程期間提供病毒清除的膜或介質(zhì)。病毒保留過濾 器的實例包括Viresolve? P;ro、Viresolve? NFP和Virosolve? NFR。
[00巧]II.示例性的固體支持物 本文公開的實施方案提供包含共聚物的固體支持物，其中所述單體中的至少一種是丙 締酷胺。本文描述的固體支持物結(jié)合堵塞病毒過濾器的種類或雜質(zhì)，如蛋白聚集體，比結(jié)合 通常為感興趣產(chǎn)物的蛋白的單體形式更容易。不希望受任何理論束縛，考慮可W使用任何 合適的固體支持物。例如，固體支持物可W是多孔或非多孔的，或者它可W是連續(xù)的，如W 整料或膜的形式。固體支持物還可W是非連續(xù)的，如W顆粒、珠或纖維的形式。在任一種情 況(連續(xù)或非連續(xù)的）下，固體支持物的重要特征是它們具有高比表面積、機械完整性、含水 環(huán)境中的完整性和提供流體分布W確保可接近結(jié)合基團的能力。
[0056] 示例性的連續(xù)多孔固體支持物包括微孔膜，即孔徑在約0.05微米和10微米之間。 可用于根據(jù)本文公開的實施方案的組合物和方法中的多孔膜可分類為性質(zhì)上對稱或非對 稱的，其是指遍及膜厚度的孔徑均一性，或者對于空屯、纖維是遍及纖維的微孔壁的孔徑均 一性。本文中使用的術(shù)語"對稱性膜"是指遍及膜的橫截面具有基本均一的孔徑的膜。本文 中使用的術(shù)語"非對稱性膜"是指平均孔徑在膜橫截面上不恒定的膜。在一些實施方案中， 在非對稱性膜的情況下，孔徑可隨著整個膜橫截面的位置而均勻或不連續(xù)地變化。在一些 實施方案中，非對稱性的膜可具有一個外表面上的孔徑對相反外表面上的孔徑的比值，該 比率基本上大于1。
[0057] 從各種材料制得的各種微孔膜可用于本文所述的組合物和方法中。運些材料的實 例包括多糖類、合成性和半合成性聚合物類、金屬類、金屬氧化物類、陶瓷類、玻璃及它們的 組合。
[0058] 可用于制造可用于本文所述的組合物和方法中的微孔膜的示例性聚合物包括但 不限于取代或未取代的聚丙締酷胺類、聚苯乙締類、聚甲基丙締酷胺類、聚酷亞胺類、聚丙 締酸醋類、聚碳酸醋類、聚甲基丙締酸醋類、聚乙締基親水性聚合物類、聚苯乙締類、聚諷 類、聚酸諷類、苯乙締和二乙締基苯的共聚物類、芳族聚諷類、聚四氣乙締類(PTFE)、全氣熱 塑性聚合物類、聚締控類、芳族聚酷胺類、脂族聚酷胺類、超高分子量聚乙締類、聚偏氣乙締 (PVW)、聚酸酸酬類(PE邸）、聚醋類及它們的組合。
[0059]示例性的市售微孔膜是購自EMD Millipore Co;rp. (Billerica, MA)的Durapore @和^1119〇的 E邱ress?;和購自化11 Co巧.（F*o;rt Washington, NY)的Supor?;和購 自Sartorius Stedim Biotech S.A. (Aubagne Cedex, France)的Sartopore? 和 Sartobran ?。
[0060] 其他示例性的連續(xù)性固體支持物是整料，例如購自ΒΙΑ Separations (Villach, Austria)的CIM?整體材料。
[0061] 示例性的非連續(xù)性的固體支持物包括多孔層析珠。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認識 到，層析珠可從各種各樣的聚合性和無機材料，如多糖類、丙締酸醋類、甲基丙締酸醋類、聚 苯乙締類、乙締基酸類、孔徑受控的玻璃、陶瓷類等制造。
[0062] 示例性的市售層析珠是來自EMD Millipore Corp.的CPG;來自GE Healthcare Life Sciences AB 的 Sepharose?;來自Tosoh Bioscience 的TOYOPEAI^L?;和來自Life Technologies的POROS?。
[0063] 其他示例性的固體支持物是機織和無紡的纖維材料，如纖維墊和拉、W及包裝入 合適的外殼的纖維，所述外殼例如層析柱、一次性塑料外殼等。示例性的固體支持物還包括 翅狀纖維。
[0064] III.示例性的結(jié)合基團 在本文描述的各個實施方案中，組合物包含丙締酷胺和結(jié)合基團的共聚物。
[0065] 各種各樣的結(jié)合基團或配體可與固體支持物連接，并用于從樣品有效去除蛋白聚 集體，如上所述。通常，結(jié)合基團應(yīng)能夠吸引并結(jié)合至溶液中的蛋白聚集體。蛋白與結(jié)合基 團的吸引可W是任何類型的，包括離子性（陽離子交換基團）、極性、色散性、疏水性、親和 性、金屬馨合性或范德華力性的。
[0066] 示例性的離子性結(jié)合基團包括但不限于硫酸醋、橫酸醋、憐酸醋、麟酸醋、簇酸醋； 伯胺、仲胺、叔胺和季錠;雜環(huán)胺，如化晚、喀晚、化晚鐵、贓嗦等。
[0067] 極性基團包括各種各樣的包含極性化合物鍵，例如C-0、C=0、C-N、C=N、C=N、N-H、0- H、C-F、C-C1、C-化、C-S、S-H、S-0、S=0、C-P、P-0、P=0、P-H 的化學(xué)實體。示例性的極性基團是 幾基、簇基、醇、硫醇、酷胺、面化物、胺、醋、酸、硫醋等。
[0068] 在本文描述的一些實施方案中，本文描述的組合物包括丙締酷胺和疏水性結(jié)合基 團的共聚物。疏水性結(jié)合基團能夠疏水性相互作用。示例性疏水性基團是烷基、環(huán)烷基、面 代烷基、氣烷基、芳基等。示例性芳基是芐基、苯基、糞基、甲苯基等。
[0069] 親和性結(jié)合基團是一致提供與目標蛋白的高特異性相互作用的幾種結(jié)合官能團 的排列。示例性的親和性結(jié)合基團包括蛋白A和蛋白G及它們的結(jié)構(gòu)域和變體。
[0070] 在一些實施方案中，優(yōu)選的結(jié)合基團是離子基團。在一個特定實施方案中，結(jié)合基 團是帶負電荷的橫酸醋基團。通常，帶負電荷的橫酸醋基團具有幾個優(yōu)點。例如，它們在溶 液中顯示出對結(jié)合帶正電荷的蛋白的寬應(yīng)用性;化學(xué)法成本低，并且是直接的，其中容易得 到許多合成制備方法;結(jié)合基團和蛋白之間的相互作用是公知的（參見例如Stein等人，J. 化rom. B，848 (2007) 151-158)，并且相互作用可通過改變?nèi)芤簵l件容易地控制，并且運 種相互作用可W與其他相互作用分離。
[0071] 在一些實施方案中，優(yōu)選的結(jié)合基團是疏水性基團。疏水性結(jié)合基團提供在較高 離子導(dǎo)電率的條件(其中離子結(jié)合基團不太有效)下結(jié)合溶液種類的優(yōu)點。在一個具體實施 方案中，結(jié)合基團是芳族控基，例如芐基，或者另外乙基、下基、己基、2-乙基己基、十二燒 基、硬脂基、徑丙基或苯基。
[0072] 除了結(jié)合基團W外，所述固體支持物還可含有中性基團（例如，丙締酷胺），其與結(jié) 合基團一起存在，并且充當W下中的任何一種或多種：將結(jié)合基團分離至彼此之間的最佳 距離，為多孔支持物提供水潤濕性，降低樣品和固體支持物之間的非特異性相互作用，控制 水吸收和含有結(jié)合基團的聚合物結(jié)構(gòu)的膨脹，為含有結(jié)合基團的聚合物結(jié)構(gòu)提供合適的機 械特性，改進聚合物結(jié)構(gòu)與固體支持物的粘附，提供增加能力和/或選擇性的與樣品的次級 相互作用。
[0073] 示例性中性基團是醇類、糖類、乙二醇類、酸類、酷胺類、臘類等。優(yōu)選的中性基團 是簡單的酷胺基，C(=0)-N出。
[0074] IV.將結(jié)合基團連接至固體支持物的方法 在本文所述的組合物和方法中，合適的結(jié)合基團（例如，離子或疏水性結(jié)合基團）連接 至固體支持物，W提供相對于感興趣產(chǎn)物更大的結(jié)合蛋白聚集體的能力。
[0075] 本文所述的組合物和方法基于W下出人意料且不可預(yù)見的發(fā)現(xiàn):組合物中丙締酷 胺的存在顯著增強固體支持物對于病毒膜堵塞種類(包括較大階蛋白聚集體)的選擇性。
[0076] 本文所述的組合物和方法在流通模式中去除低階蛋白聚集體，例如二聚體、Ξ聚 體和四聚體方面是特別有效的，與高階聚集體，例如五聚體及更高階聚集體相比，低階蛋白 聚集體通常較難W與蛋白的單體形式分離。
[0077] 本領(lǐng)域已知的各種方法和本文所述的方法可用于將結(jié)合基團與本文所述的方法 中使用的固體支持物連接。通常，成功連接的標準包括實現(xiàn)期望的結(jié)合基團密度和結(jié)合基 團的低脫離速率（即結(jié)合基團的低浸出）。結(jié)合基團可與固體支持物直接連接，或可并入聚 合分子，其進而可與固體支持物結(jié)合?；蛘撸Y(jié)合基團可并入施用于固體支持物上的交聯(lián)涂 層中，而在涂層和固體支持物之間不形成或形成化學(xué)鍵。
[007引本領(lǐng)域中已知許多方法用于將結(jié)合基團連接至固體支持物（參見例如， Ulbricht, Μ.， Advanced Functional Polymer Membranes， Polymer, 47， 2006， 2217- 2262)。運些方法包括但不限于通過合適的偶聯(lián)化學(xué)法，使用結(jié)合基團對固體支持物直接改 性；吸附和連接聚合分子。后者可通過接枝"至"（當聚合物在與表面反應(yīng)之前預(yù)制備時）或 接枝"自"（當使用表面基團開始聚合反應(yīng)時)而實現(xiàn)。
[0079] 單體的反應(yīng)性決定產(chǎn)生包含結(jié)合基團的聚合物中使用的單體的選擇。各種單體類 型的反應(yīng)性和對于聚合物組合物的效果已深入研究并公開(參見例如，化社ffler姑η孤ooA, 第Ξ版，John Wiley & Sons, 1989, P. II)。預(yù)測聚合物組成及其結(jié)構(gòu)的公認的單體參 數(shù)是單體的反應(yīng)性比率(參見例如Odian, /.，化inci如es o/ZW/fflerizaiion,第4版， John Wiley & Sons, 2004, P. 466)。
[0080] 將離子或疏水性結(jié)合基團連接至固體支持物的一種優(yōu)選方法是將結(jié)合基團并入 施用于固體支持物上的交聯(lián)涂層中的原位聚合反應(yīng)。該方法公開于美國專利4,944,879和 4,618,533、^及公開的美國專利公開1152009/208784中。該方法方便且經(jīng)濟?？捎糜诮档褪?水或帶電荷的結(jié)合配體密度的中性單體可選自一大群丙締酸、甲基丙締酸和丙締酷胺的單 體，例如丙締酷胺、丙締酸徑丙醋、丙締酸徑乙醋和甲基丙締酸徑乙醋。在本文所述的各個 實施方案中，所述中性單體是丙締酷胺。
[0081] 包被于固體支持物上的含有結(jié)合基團的聚合物的代表性化學(xué)結(jié)構(gòu)描繪于式A中。 為了包被聚合物，通常將其與其他聚合物交聯(lián)。在式A中，顯示聚合物結(jié)構(gòu)，其中Ri是含有疏 水性或陽離子交換基團的任何脂族或芳族有機殘基，所述基團例如，選自乙基、下基、己基、 2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、徑丙基、苯基和芐基的疏水性脂族或芳族有機基團，或選自 橫酸、硫酸醋、憐酸、麟酸或簇酸基團的陽離子交換基團；R2是任何兩個或更多個聚合物鏈 之間的任何不帶電荷的脂族或芳族有機接頭，例如丙締酸醋類、丙締酷胺類、甲基丙締酸醋 類、乙締基酸類和苯乙締類。
[0082] 在式A中繪制的聚合物結(jié)構(gòu)中，x、y和Z是該聚合物中的各單體的平均摩爾分數(shù)，且 獨立地范圍為約0.01至0.99;且m表示經(jīng)由接頭連接第二聚合物。
[0083] 接枝至固體支持物的含有結(jié)合基團的聚合物的代表性化學(xué)結(jié)構(gòu)描繪于式B中。在 式B中，顯示聚合物結(jié)構(gòu)，其中Ri是含有疏水性或陽離子交換基團的任何脂族或芳族有機殘 基，所述基團例如，選自乙基、下基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、徑丙基、苯基和節(jié) 基的疏水性脂族或芳族有機基團，或選自橫酸、硫酸醋、憐酸、麟酸或簇酸基團的陽離子交 換基團。
[0084] 在式B中繪制的聚合物結(jié)構(gòu)中，X和y是該聚合物中的各單體的平均摩爾分數(shù)，且獨 立地范圍為約0.01至0.99。
[0085] 在一些實施方案中，含有結(jié)合基團（例如，疏水性結(jié)合基團）的聚合物是嵌段共聚 物，運意味著其包括一種類型的單體的長串或長嵌段，隨后為不同類型的單體的長串或長 嵌段。
[0086] 在其他實施方案中，含有結(jié)合基團的共聚物W隨機順序含有單體。
[0087] 在還有其他實施方案中，含有結(jié)合基團的共聚物是交替共聚物，其中每個單體在 任一側(cè)總是鄰近于不同種類的兩種單體。
[0088] 在其他實施方案中，含有結(jié)合基團（例如，疏水性結(jié)合基團）的共聚合物W隨機順 序含有單體。
[0089] 在其他實施方案中，含有結(jié)合基團的共聚物是交替共聚物，而每個單體總是鄰近 于不同種類的兩種單體。
[0090] IV.滲入本文所述的組合物的裝置 在一些實施方案中，將本文所述的組合物滲入裝置中。固體支持物，例如微孔膜的合適 裝置包括過濾筒、膠囊狀件(capsules)和芙狀件(pods)。示例性的裝置還包括美國公開號 US20100288690 A1和US20080257814 A1 (通過引用并入本文）中公開的堆疊的平板過濾筒。 在運些裝置的情況下，固體支持物永久性地與聚合性外殼粘結(jié)，并且裝置具有液體入口、出 口和放空口，并且進一步使保留的液體體積最小化。其他示例性裝置包括折疊式過濾筒和 旋轉(zhuǎn)纏繞式過濾筒。另外的其他示例性裝置是層析柱。層析柱可從許多材料，如玻璃、金屬、 陶瓷和塑料制備。運些柱可由終端用戶用固體支持物裝填，或還可由制造商預(yù)裝填，并W裝 填狀態(tài)送至終端用戶。
[0091] V.使用本文所述的組合物和裝置的方法 含有本文所述的組合物的裝置可用于W流通模式去除蛋白聚集體。在應(yīng)用制備級的分 離之前，必須針對合適的溶液條件如pH和導(dǎo)電率開發(fā)并驗證所述方法，并且必須確定裝置 上的蛋白負載率的范圍。用于方法開發(fā)和驗證的方法是本領(lǐng)域中公知且常規(guī)實施的。
[0092] 通常在使用前用合適的緩沖溶液沖洗、消毒并平衡所述裝置。將蛋白溶液調(diào)整至 期待的導(dǎo)電率和抑，并且隨后在恒壓或恒流下累入通過裝置?？蒞收集流出物，并分析蛋白 得率和聚集體濃度。
[0093] 在一些實施方案中，本文所述的用于聚集體去除的裝置與例如美國專利7,118， 675(其整體通過引用并入本文)教導(dǎo)的病毒過濾裝置直接連接，該病毒過濾裝置被設(shè)計用 于確?；诖笮∪コ《绢w粒。
[0094]實施方案通過W下實施例進一步說明，其不應(yīng)理解為限制性的。本申請通篇引用 的所有參考文獻、專利和公開的專利申請W及附圖均通過引用并入本文。
[00%]實施例1.含丙締酷胺的帶負電荷的過濾器的制備和與含二甲基丙締酷胺的過濾 器的比較 本實驗表明添加丙締酷胺作為共單體W制備用于去除雜質(zhì)如蛋白聚集體的吸附膜的 意料之外的益處。
[0096] 用結(jié)合基團制備一系列陽離子交換(CEX)表面改性的膜，在該情況下，所述結(jié)合基 團是帶負電荷的橫酸殘基。通過配制用于表面改性的反應(yīng)溶液的制劑來控制CEX密度。為了 評估用于實現(xiàn)較低CEX密度的不帶電荷的反應(yīng)性共單體的影響，W不同的量將不帶電荷的 反應(yīng)性單體丙締酷胺(AM)、N，N-二甲基丙締酷胺(DMAM)、甲基丙締酸節(jié)醋(BMA)或丙締酸 異辛醋（I0A)、N-(2-^丙基）甲基丙締酷胺化PMAM)添加至所述反應(yīng)溶液。選擇共單體W覆 蓋各種大小和疏水性或親水性程度。
[0097] 制備一系列水性溶液或水：乙臘(50:50)溶液，其含有范圍為1.5至2.5 % wt.的 CEX單體2-丙締酷氨基-2-甲基丙橫酸(AMPS),與41、0魁1、8魁、104或冊魁1和固定質(zhì)量百分 比的交聯(lián)劑N，Ν'-亞甲基雙丙締酷胺(0.8%wt.)和UV引發(fā)劑Irgacure 2959 (0.2%wt.)、 (2-?基-1-[4-(2-徑基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酬）。將0.10 μπι的孔徑額定值和0.100 mm的厚度的親水性聚偏二氣乙締(PVDF)膜切成14 cm X 14 cm的方形片，并將各片在溶液 之一中浸沒30秒W確保完全潤濕。去除過量溶液，并將膜暴露于UV福射。將該膜隨后用去離 子水沖洗并在空氣中干燥。表1列出制備W評估共單體的影響的CEX表面改性膜的變體。
[0098] 表1.病毒保留過濾器Viresolve Pro (VPro)的質(zhì)量通量。
[0099] 使用新吸附膜作為預(yù)過濾器。
[0100] 含丙締酷胺的帶負電荷的預(yù)過濾器和含其他共單體的預(yù)過濾器的評估通過確定 它們改進過濾過程中的下游病毒保留過濾器的通量的預(yù)過濾性能來完成。進料流含有多克 隆IgG聚集體，其通常迅速渺塞(foul)在過濾器的上游不具有病毒預(yù)過濾器的病毒過濾器。 因為所使用的結(jié)合基團是帶負電荷的，所WigG的強CEX溶液結(jié)合條件用于評估預(yù)過濾器的 性能。
[0101] 使用SeraCare Life Sciences 人 丫球蛋白粉末（目錄號 HS-470-90)(pH 4) W4.0 g/L IgG的濃度W及10 mM乙酸鋼在2.0 mS/cm新鮮制備用于測試病毒過濾器提供的保護的 多克隆IgG進料。使用10 Μ HC1、化OH或4 Μ化C1進行最終的抑和導(dǎo)電率調(diào)整，并在使用前 無菌過濾溶液。
[0102] 具有3.1 cm2的過濾面積的微濾裝置使用3層膜預(yù)模制，并與Viresolve? Pro Micro裝置(EMD Millipore Coloration, Billerica, ΜΑ)Wl:l面積比串聯(lián)放置。將兩種 裝置均預(yù)潤濕，并僅使用緩沖液(pH 4，10 mM乙酸鹽，2 mS/cm)排氣W去除空氣。在30 psi的恒定壓力下，通過測量經(jīng)20分鐘時段達到初始滲透率值的質(zhì)量而測定WmL緩沖液/分 鐘計的初始流量。在30 psi下將進料轉(zhuǎn)換至4 g/L多克隆IgG進料，并測量體積通量并針對 時間作圖，直到流量衰減至25%僅初始緩沖液的流量。多克隆IgG溶液的總通量在V75 WL/ m2測量，并轉(zhuǎn)換為kg多克隆IgG/m2膜。
[0103] 如從表1和圖2可見，與AMPS和共單體的其他組合相比，用1.8% AMPS、3.0%丙締酷 胺改性的膜3為病毒去除過濾器提供了更大的保護(更大的質(zhì)量通量）。與基膜對照膜2和非 預(yù)過濾的病毒膜1相比，含丙締酷胺的膜3還提供了更高的質(zhì)量通量。
[0104] 實施例2.響應(yīng)于溶液中蛋白的存在的滲透率變化表明含有丙締酷胺的表面涂層 的Ξ維性質(zhì) 本實施例表明使用丙締酷胺作為共單體制備的表面化學(xué)的性質(zhì)。使用含有4 g/L IgG 的進料溶液和無任何蛋白的相同緩沖溶液兩者測試實施例1中使用的裝置組合的滲透率。 據(jù)觀察，含有丙締酷胺作為共單體的裝置具有一些獨特特性，因為與其他預(yù)過濾器和未預(yù) 過濾的VPro(膜1)的情況下的滲透率相比，在IgG存在的情況下的系列（train)的滲透率增 加(表2,圖3和4)。不希望受理論束縛，假設(shè)在膜3中使用親水性小的共聚合的丙締酷胺與 CEX結(jié)合基團AMPS允許獨特的聚合物水凝膠（圖5)，當IgG形成離子交聯(lián)時，其可W容易收 縮，因此打開膜孔并導(dǎo)致滲透率的增加。
[0105] 表2中使用共單體BMA和DMAM的疏水性更高的制劑(膜4、5和9)對滲透率不具有相 同的效果(表2,圖3和4)。
[0106] 表2.各種預(yù)過濾器/VPro組合的緩沖液和蛋白溶液的滲透率。
[0107] 實施例3.作為導(dǎo)電率的函數(shù)的蛋白結(jié)合容量 本實施例通過測量在抑4.0和不同的溶液導(dǎo)電率的表3中的表面改性膜的靜態(tài)IgG結(jié) 合容量說明作為共單體的丙締酷胺的獨特效果。
[0108] 使用SeraCare Life Sciences人丫球蛋白粉末（目錄號HS-470-90)(pH 4)Wl.O g/L IgGW及10 mM乙酸鋼新鮮制備用于測量靜態(tài)結(jié)合容量的多克隆IgG進料。使用10 Μ 肥1、Na0H和NaCl實現(xiàn)最終抑4.0和表3中的導(dǎo)電率。在使用前將溶液無菌過濾。
[0109] 使用圓形沖模將膜樣品切成已知半徑。使用100微米的膜厚度計算膜體積(V = η r2h)。將膜圓盤樣品用水預(yù)潤濕，并根據(jù)表3交換為適當?shù)囊?.ο緩沖溶液。隨后將膜圓盤 制成1 g/L IgG(pH 4.0)的適當體積。目標負載率為約100 mg/ml(對于2 mS/cm)，50 mg/ml (對于 15和25 mS/cm)，和25 mg/mL(對于37和49 mS/cm)。
[0110] 將膜樣品和IgG溶液旋轉(zhuǎn)混合8小時，并通過UV280吸光度測量上清液的最終IgG濃 度?；谧罱K上清液濃度通過質(zhì)量平衡計算Wmg IgG/mL膜計的靜態(tài)IgG容量。表3和圖6中 的最終膜靜態(tài)IgG容量顯示，含有丙締酷胺的膜(即，膜3和17KW四（乙二醇)二丙締酸醋交 聯(lián)劑代替MBAM)，具有在pH4在直至25 mS/cm比測試的其他膜（即，基膜2)、具有更大數(shù)目的 結(jié)合基團（即，膜7和8)、無丙締酷胺的膜（即，膜8、16、18)和具有共單體DMAM的膜（即，膜7、 5、19)具有更高的靜態(tài)IgG容量。
[0111] 膜3和17中小的、中性和親水性的丙締酷胺與CEX結(jié)合基團AMI^的存在得到獨特的 聚合物水凝膠，其提供更大的靜態(tài)IgG容量。
[0112] 表3.各種CEX表面改性膜對于IgG的靜態(tài)結(jié)合容量。膜17-19W四（乙二醇)二丙締 酸醋交聯(lián)劑替代膜3、5和16中的N，Ν'-亞甲基雙丙締酷胺。
[0113] 實施例4.含丙締酷胺的膜對蛋白聚集體的選擇性，如通過從CEX動態(tài)結(jié)合的洗脫 的SEC測量所評價 本實施例表明含丙締酷胺的膜對IgG聚集體的選擇性。
[0114] 對于表3中的膜測量動態(tài)CEX聚集體容量W定量所述膜的聚集體選擇性差異。使用 含有聚集體的多克隆IgG進料W提供在結(jié)合條件下對表3中的膜的等效動態(tài)CEX負載率。使 用等效負載后的CEX洗脫W測定表4中的膜的IgG容量、通過分析型大小排阻色譜(SEC)的聚 集體選擇性和聚集體容量。
[0115] 使用Sera化re Life Sciences人 丫球蛋白粉末（目錄號HS-470-90) (pH 4) W10.0 g/L IgGW及10 mM乙酸鋼在2.0 mS/cm(使用化Cl)新鮮制備進料。使用10 Μ HC1、化OH或4 Μ NaCl進行最終的抑和電導(dǎo)率調(diào)整，并在使用前無菌過濾溶液。
[0116] 使用3層膜預(yù)模制具有3.1 cm2的過濾面積的微濾裝置。將裝置預(yù)潤濕，并用20 mL 緩沖溶液(pH 4)、10 ml乙酸鹽(2 mS/cm)沖洗，然后使40血10 g/L IgG (4.0 kg/L或1.3 kg/m2的負載率似0.2 mL/min (2 CV/min)流過各裝置。將裝置用2 mL (20 CV)緩沖液洗 涂，并用2 mL (20 CV) pH 4，0.5 Μ NaCl洗脫。
[0117] 使用分析型大小排阻色譜(SEC)分析洗脫物的分子量種類。使用從SEC色譜的積分 測定的聚集體百分比和IgG結(jié)合容量(來自UV280洗脫濃度)來計算表4W及圖7和8中的膜的 聚集體容量。
[011引圖9是包括來自表4的膜3、16、5和8的進料負載溶液和洗脫物的歸一化的SEC-HPLC 覆蓋的代表性色譜圖。重疊顯示，與無中性共單體的膜8和16或具有共單體DMAM的膜5相比， 含有丙締酷胺的膜3的洗脫物具有更高百分數(shù)的聚集體。該結(jié)果表明，丙締酷胺的存在改進 對于聚集體的膜選擇性。
[0119] 表4W及圖7和8中的聚集體容量對于含丙締酷胺的膜3和17(W四（乙二醇)二丙締 酸醋交聯(lián)劑替代MBAM)是最高的。與基膜2、具有更高數(shù)目的結(jié)合基團的膜(膜8和7)、無丙締 酷胺的膜(膜8、16、18)^及具有0141的膜(膜7、5、19)相比，含丙締酷胺的膜具有更高的聚 集體容量。
[0120] 圖8表明，具有更高聚集體容量的膜傾向于提供更好的Viresolve ? Pro保護，由 此使用實施例1中的方法得到更高的IgG質(zhì)量通量。
[0121] 表4.各種CEX表面改性膜對于IgG的聚集體結(jié)合容量。
[0122] 實施例5.含丙締酷胺的疏水性預(yù)過濾器(與無丙締酷胺的預(yù)過濾器相比）的制備 和測試 本實施例表明使用丙締酷胺作為共單體與疏水性結(jié)合基團對于在疏水性結(jié)合條件（中 性至較高抑和中度至高導(dǎo)電率)下保護病毒過濾器的益處。
[0123] 疏水性單體N-芐基丙締酷胺2.5 % wt (Alfa Aesar L11450)用作結(jié)合基團，并與 2.0 wt %丙締酷胺和交聯(lián)劑N，Ν'-亞甲基雙丙締酷胺(0.8% wt.)共聚。將單體溶解于50: 50水:MPD ((±) - 2-甲基-2,4-戊二醇），將0.22微米額定的親水性聚酸諷(PES)膜的 14x14 cm薄片在溶液中浸泡30秒，并去除過量溶液。使用電子束(2.5 MRad @ 170 kV)起始 聚合，并將膜隨后用去離子水沖洗并在空氣中干燥。評估具有疏水性結(jié)合基團且具有和不 具有丙締酷胺共單體的預(yù)過濾膜的改進下游病毒過濾器的通量的預(yù)過濾性能。進料流含有 多克隆IgG聚集體，其通常迅速渺塞(foul)未預(yù)過濾的病毒過濾器(實施例1)。由于結(jié)合基 團是疏水性的，所W在中性至較高pH和中度至高導(dǎo)電率的溶液條件(其通常增強抗體的疏 水相互作用)下評估具有和不具有丙締酷胺的效果。
[0124] W0.5或2.0 g/L IgG SeraCare Life Sciences人 丫球蛋白粉末（目錄號冊-470- 90)(pH 7.0,5 mS/cm，pH 7.5,15 mS/cmW及pH 6.0,25 mS/cm)使用Tris緩沖液和化Cl新 鮮制備多克隆IgG進料(表5)。使用10 Μ肥l、NaOH或4 Μ NaCl進行最終的抑和電導(dǎo)率調(diào)整， 并在使用前無菌過濾溶液。
[01巧]具有過濾面積3.1 cm2的微濾裝置使用3層膜預(yù)模制，并與Viresolve? Pro Micro裝置(EMD Millipore Coloration, Billerica, ΜΑ)Wl:l面積比串聯(lián)放置。將兩種 裝置均預(yù)潤濕，并使用緩沖溶液排氣W去除空氣。在30 psi的恒定壓力下，通過經(jīng)20分鐘時 段的質(zhì)量測量WmL/min計的初始流量W測定初始恒定流量值。在30 psi下將進料轉(zhuǎn)換至多 克隆IgG溶液，并測量體積通量并針對時間作圖，直到流量衰減至25%初始緩沖液流量。多克 隆IgG溶液的總通量在V75WL/V測量，并轉(zhuǎn)換為kg多克隆IgG/m2膜。如從表5W及圖10、11 和12可見，與不含丙締酷胺的膜5、6、7或8相比，用2.5 % BAM、1.0%或2.0%丙締酷胺改性的 膜3和4提供病毒去除過濾器的更大保護(更大的質(zhì)量通量）。在巧巾溶液條件下，含丙締酷胺 的膜3和4還提供與Viresolve ?預(yù)過濾器（主要是疏水性機制）類似的質(zhì)量通量，和比 Viresolve?化ield (CEX機制)好得多的通量。
[0126] 表5.含丙締酷胺的疏水性預(yù)過濾器(與目前可得的商業(yè)預(yù)過濾器和無丙締酷胺 的預(yù)過濾器相比）的配制和性能。
[0127] 實施例6.含丙締酷胺的疏水性預(yù)過濾器與商業(yè)預(yù)過濾器和使用多克隆IgG的未 改性的基礎(chǔ)膜的比較 本實施例表明，來自實施例5(表5)的具有疏水性結(jié)合配體N-芐基丙締酷胺(BAM)和丙 締酷胺(AM)的表面改性化學(xué)的膜(3)在疏水性結(jié)合條件（中性至較高抑和中度至高導(dǎo)電率） 下保護病毒過濾器。如觀察，膜(3)比市售的預(yù)過濾器和未改性的基礎(chǔ)聚合物膜更好地改進 下游病毒過濾器(Viresolve? Pro, EMD Millipore Corp., Billerica, MA)的多克隆 IgG質(zhì)量通量。
[0128] 評估表6中的預(yù)過濾器的改進下游病毒過濾器的多克隆IgG質(zhì)量通量的預(yù)過濾性 能。膜樣品（1)是Viresolve? Shield,具有基于CEX機制的表面改性的膜過濾器 (VPMSIQTNB9，EMD Millipore Co巧oration, Billerica, MA)。樣品（2)是OptiScale-40 Viresolve ?預(yù)過濾器，具有5 cm2的過濾面積的基于疏水性機制的深度過濾器 (SSPVA40NM9, EMD Millipore Co巧oration， Billerica, MA)。
[0129] 膜(4)是具有110 μπι的厚度的親水的聚酸諷(PES) 0.2 μπι膜(快速除菌級，GEPP， EMD Millipore Coloration, Billerica, ΜΑ)。膜巧）是具有170 μηι的厚度的親水的尼龍 (聚酷胺）0.20 ym膜(GNWP, EMD Millipore Coloration, Billerica, ΜΑ)。膜（6)是具 有 110 μL?的厚度的未改性的聚酸諷(PES) 0.2 μπι膜(G邸P, EMD Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ)〇
[0130] 進料流含有多克隆IgG聚集體，其迅速渺塞(foul)未預(yù)過濾的病毒過濾器(實施例 1)。由于膜(3)的結(jié)合基團是疏水性的，所W在通常增強抗體的疏水性相互作用的溶液條件 (中性至較高抑和中度至高導(dǎo)電率)下評估其預(yù)過濾性能。
[0131] W2.0 g/L IgG SeraCare Life Sciences人 丫球蛋白粉末（目錄號HS-470-90) (pH 6.0,25 mS/cm)使用乙酸鹽緩沖液和化Cl新鮮制備多克隆IgG進料。使用10 Μ肥1、 NaOH或4 Μ NaCl進行最終的抑和電導(dǎo)率調(diào)整，并在使用前無菌過濾溶液。
[0132] 具有3.1 cm2的過濾面積的微濾裝置使用2或3層膜預(yù)模制W得到等效厚度或總體 積，并與病毒過濾裝置Viresolve? Pro Micro 化MD Millipore Co;rporation, Billerica, ΜΑ) :1面積比串聯(lián)放置。將兩種裝置均預(yù)潤濕，并使用緩沖溶液排氣W去除 空氣。在30 psi的恒定壓力下，通過經(jīng)20分鐘時段的質(zhì)量測量WmL/min計的僅緩沖液的初 始流量W測定初始恒定流量值。在30 psi下將進料轉(zhuǎn)換至含多克隆IgG的緩沖溶液，并測量 體積通量并針對時間作圖，直到流量衰減至25 %和10%初始緩沖液流量。多克隆IgG溶液的 總通量在V75和V9〇WL/m2測量，并轉(zhuǎn)換為kg多克隆IgG/m2膜。
[0133] 如表6和圖13中可見，與商業(yè)膜過濾器（1)和(4) W及未改性的基礎(chǔ)聚合物膜(5)和 (6)相比，用2.5 % BAM、2.0%丙締酷胺、0.8% MBAM改性的膜(3)提供病毒去除過濾器的更大 保護（多克隆IgG的更大質(zhì)量通量）。運表明，與商業(yè)膜過濾器（1)、CEX機制和(4)、親水化的 PESW及由聚酷胺巧)和聚酸諷(6)構(gòu)成的未改性的膜相比，使用疏水性配體BAM共聚物與丙 締酷胺的表面改性在典型疏水性結(jié)合條件（pH 6, 25 mS/cm)下更好地保護。當針對3.1 cm2歸一化時，膜（3)比樣品（2)Viresolve ? 預(yù)過濾器化MD Millipore Corp. , Billerica, ΜΑ)(已知其主要通過疏水性機制吸附蛋白）提供更大的質(zhì)量通量。
[0134] 表6.含丙締酷胺的疏水性預(yù)過濾器與目前可得的商業(yè)預(yù)過濾器和未改性的基礎(chǔ) 膜的比較。
[0。引實施例7.含丙締酷胺的疏水性預(yù)過濾器對于單克隆抗體的性能 本實施例表明，來自實施例6(表6)的具有疏水性結(jié)合配體Ν-芐基丙締酷胺(ΒΑΜ)與丙 締酷胺(AM)的表面改性化學(xué)的膜(3)在疏水性結(jié)合條件下保護病毒過濾器(Viresolve? Pro, EMD Millipore Corp., Billerica, ΜΑ)，W 改進單克隆抗體(MAbs)的質(zhì)量通量。運 些實施例表明，與無預(yù)過濾的過濾、使用由聚酷胺(5)或親水的PES膜(4)構(gòu)成的未改性的膜 預(yù)過濾器相比，用膜(3)預(yù)過濾病毒過濾器表現(xiàn)更好。
[0136] 評估表7中的膜預(yù)過濾器（3)、（4)和（5)用下游病毒過濾器(Viresolve? Pro, EMD Millipore Co巧.，Billerica, ΜΑ)在疏水性結(jié)合條件（中性至較高抑和中度至高導(dǎo) 電率)下改進單克隆抗體(Mb)的質(zhì)量通量的預(yù)過濾性能。
[0137] 膜(4)是具有110 μπι的厚度的親水的聚酸諷(PES) 0.2 μπι膜(快速除菌級，GEPP， EMD Millipore Corp.，Billerica, ΜΑ)。膜(5)是具有170 μL?的厚度的親水的尼龍(聚酷 胺）0.20 ym膜（GNWP, EMD Millipore Co巧.，Billerica, ΜΑ)。
[0138] MAb進料流Mb 01、05和07的詳情W及過濾容量實驗條件和結(jié)果詳述于表7,圖14- 16。將Ξ種MAb都純化至至少蛋白A洗脫后的狀態(tài)，并且將溶液條件使用10 Μ HC1、化0H或4 Μ NaCl調(diào)解至表7條件。
[0139] 具有0.8 cm2的過濾面積的不誘鋼Swinney 13 mm直徑過濾器托架（XX3001200, EMDMillipore Corp.，Billerica, M)使用2層或3層預(yù)過濾膜(3)、（4)和（5)組裝W得到 等效厚度或總體積，并且使用相同托架與2層Viresolve ? Pro病毒過濾膜化MD Millipore Co巧.，Billerica, Μ)Wl:l面積比串聯(lián)放置。
[0140] 預(yù)過濾器和病毒膜裝置在30 psi下用緩沖液預(yù)潤濕，并轉(zhuǎn)移至單克隆抗體進料用 于測試。容量實驗W166 LMH化/m2.虹)的恒定流速運行，并在過濾的上游側(cè)監(jiān)測壓力W檢 測過濾系列的堵塞。Mb溶液的總通量W體積測量，并轉(zhuǎn)換為kg Mb/m2病毒膜。
[0141] 使用Ξ種不同的MAb的Ξ個實例都在更有利的疏水性結(jié)合條件（中性至較高pH和 中度至高導(dǎo)電率)下，所述條件接近MAb的等電點和/或中度溶液導(dǎo)電率。
[0142] 圖14顯示，與未預(yù)過濾的VPro相比，膜(3)在降低壓力增加方面是有效的。圖15顯 示，與未預(yù)過濾的VPro相比，膜(3)保護化roW便使MAb 05的質(zhì)量通量改進4倍。圖16顯示， 對于MAb 07,與無預(yù)過濾的VPro病毒過濾和由聚酷胺(5)構(gòu)成的未改性的膜預(yù)過濾器W及 商業(yè)除菌級膜過濾器(4)相比，膜(3)表現(xiàn)更好。
[0143] 表7.使用含丙締酷胺的疏水性預(yù)過濾器(3)與商業(yè)膜相比的單克隆抗體病毒過 濾性能 總之，新發(fā)現(xiàn)的膜化學(xué)法能夠顯著改善預(yù)過濾器用于保護病毒過濾器的性能。
[0144] 鑒于本說明書中引用的參考文獻(通過引用并入本文）的教導(dǎo)而最徹底地理解本 說明書。本說明書中的實施方案提供實施方案的說明，并且不應(yīng)理解為限制其范圍。本領(lǐng)域 技術(shù)人員可容易地認識到本公開包括許多其他實施方案。所有出版物和參考文獻材料W其 整體通過引用并入。在通過引用并入的材料與本說明書相矛盾或不一致的程度上，本說明 書將替代任何運種材料。本文對任何參考文獻的引用并不承認運種參考文獻是現(xiàn)有技術(shù)。
[0145] 除非另有指出，本說明書(包括權(quán)利要求）中使用的表示成分、細胞培養(yǎng)物、處理條 件等數(shù)量的所有數(shù)字在所有情況下均應(yīng)理解為由術(shù)語"約"修飾。因此，除非另有相反指出， 數(shù)值參數(shù)是近似值，并且可根據(jù)本文公開的實施方案尋求得到的所需性質(zhì)而改變。除非另 有指出，在一系列要素之前的術(shù)語"至少"應(yīng)理解為是指該系列中的每一要素。本領(lǐng)域技術(shù) 人員將認識到或能夠僅僅使用常規(guī)實驗來確定本文所述的具體實施方案的許多等同方案。 該等同方案意圖包括于W下權(quán)利要求中。
[0146]在不偏離本文公開的實施方案的精神和范圍下，可W對其進行多種修改和改變， 運對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。本文描述的具體實施方案僅W實例的方式提 供，并不意欲W任何方式限制本發(fā)明。本說明書和實施例應(yīng)被認為是僅僅示例性的，本公開 的真正范圍和精神由W下權(quán)利要求表明。
【主權(quán)項】
1. 包含W下化學(xué)結(jié)構(gòu)的聚合物：其中Ri代表選自乙基、下基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、徑丙基、苯基和芐基 的疏水性脂族或芳族有機基團； R2代表兩種聚合物之間的衍生自選自丙締酸醋類、丙締酷胺類、甲基丙締酸醋類、乙締 基酸類和苯乙締類的可聚合的單體的有機接頭； x、y和Z是該聚合物中的各單體的平均摩爾分數(shù)，且獨立地范圍為約0.01至0.99;且m表 示經(jīng)由接頭連接第二聚合物。2. 將感興趣的單體蛋白與樣品中的蛋白聚集體分離的方法，所述方法包括使所述樣品 與包含芐基丙締酷胺和丙締酷胺的共聚物的多孔固體支持物接觸，其中所述固體支持物選 擇性結(jié)合蛋白聚集體，由此將感興趣的單體蛋白與蛋白聚集體分離。3. 權(quán)利要求2的方法，其中在6或更大的中性至較高pH下進行所述方法。4. 權(quán)利要求2的方法，其中在5 mS/cm或更大的中度至高導(dǎo)電率的溶液中進行所述方 法。5. 權(quán)利要求2的方法，其中所述固體支持物選自層析樹脂、膜、多孔珠、多孔整料、翅狀 纖維、紡織布和無紡布。6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白聚集體是低階蛋白聚集體。7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述低階蛋白聚集體選自二聚體、Ξ聚體和四聚體。8. 權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白聚集體是高分子量蛋白聚集體。9. 權(quán)利要求8的方法，其中較高分子量聚集體是五聚體和更高聚體。10. 權(quán)利要求2的方法，其中感興趣的單體蛋白是抗體。11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。12. 權(quán)利要求2的方法，其中感興趣的單體蛋白是重組蛋白。13. 權(quán)利要求2的方法，其中感興趣的單體蛋白是多克隆抗體。14. 權(quán)利要求2的方法，其中感興趣的單體蛋白進一步經(jīng)受通過病毒保留性過濾器的過 濾。15. 提高感興趣的蛋白的純化過程中的病毒過濾器的過濾容量的方法，其包括使包含 所述感興趣的蛋白的樣品在通過所述病毒過濾器前經(jīng)受預(yù)過濾步驟，所述預(yù)過濾步驟包括 使所述樣品與包含含有至少兩種單體的共聚物的多孔固體支持物接觸，其中所述單體中的 至少一種包含丙締酷胺，且至少第二單體包含疏水性結(jié)合基團。16. 權(quán)利要求15的方法，其中在高于約6的pH和高于約5 mS/cm的導(dǎo)電率下使所述樣品 與所述多孔固體支持物接觸。17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述固體支持物選自層析樹脂、膜、多孔珠、多孔整料、翅 狀纖維、紡織布和無紡布。18. 用于純化感興趣的蛋白的過濾系列，其包含病毒過濾器和預(yù)過濾器，所述預(yù)過濾器 包含多孔固體支持物，所述多孔固體支持物包含含有至少兩種單體的共聚物，其中所述單 體中的至少一種包含丙締酷胺且至少第二單體包含疏水性結(jié)合基團。19. 權(quán)利要求18的過濾系列，其進一步包含層析介質(zhì)。20. 權(quán)利要求18的過濾系列，其中所述多孔固體支持物選自層析樹脂、膜、多孔珠、多孔 整料、翅狀纖維、紡織布和無紡布。21. 包含W下結(jié)構(gòu)的聚合物：其中Ri代表選自乙基、下基、己基、2-乙基己基、十二烷基、硬脂基、徑丙基、苯基和芐基 的疏水性脂族或芳族有機基團； x、y和Z是所述聚合物中的各單體的平均摩爾分數(shù)，且獨立地范圍為約0.01至0.99; 且其中所述聚合物經(jīng)由共價鍵接枝至顯示為矩形的固體支持物上。
【文檔編號】C07K1/14GK105980047SQ201480067562
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年11月6日
【發(fā)明人】M.科茲洛夫, W.卡塔爾多, J.卡倫
【申請人】Emd密理博公司