專利名稱：親合分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從液體中離析和分離化合物的方法。本發(fā)明為一改進(jìn)的親合分離方法，該法特別適于離析生物活性化合物。
技術(shù)的發(fā)展已使迄今為止用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法來制備太復(fù)雜和太昂貴的治療用蛋白質(zhì)的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)成為可能。這種制備是通過培養(yǎng)生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)且能在控制條件下在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。所使用的技術(shù)涉及通過重組DNA技術(shù)改變的微生物的發(fā)酵或培養(yǎng)通過雜交技術(shù)業(yè)已改變的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞。將所說細(xì)胞懸浮于含鹽、糖、蛋白質(zhì)和維持特定的細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的各種成分的液體培養(yǎng)基中。所需要的蛋白質(zhì)可通過所說細(xì)胞分泌于所說液體培養(yǎng)基中或滯溜于該細(xì)胞體內(nèi)。
其它感興趣的蛋白質(zhì)可用另外的辦法來制備，例如通過基因改變動(dòng)物的種以得到能產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的動(dòng)物。例如，某些蛋白質(zhì)可用轉(zhuǎn)基因母牛來生產(chǎn)，從其奶中來獲取。
至少由于下述原因，業(yè)已證明從異源基因混合物中分離或純化這些蛋白質(zhì)是一件棘手的任務(wù)在總蛋白質(zhì)中所需蛋白質(zhì)的百分含量常低;要被制備的液體培養(yǎng)基或其他液體會(huì)含大量的細(xì)胞碎片和其他粒狀污染物;可能存在的熱原、病原體、毒素和其他污染物的濃度高且必須除去;且必須從所說異源基因蛋白質(zhì)溶液中分離出所要蛋白質(zhì)而使其不變性。
由于上述原因，為了大量生產(chǎn)純化的蛋白質(zhì)必須使用昂貴的后處理。這些后處理包括在生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)后要采取的許多工藝步驟，這包括如離心分離、細(xì)胞破碎、機(jī)械篩分、微量過濾、離子交換、交叉流過濾、親合分離、消毒、純化和包裝。在生物法生產(chǎn)蛋白質(zhì)中，主要花費(fèi)就在這些后處理工藝上。這樣，提供一種通過減少工藝步驟，有效達(dá)到高產(chǎn)率蛋白質(zhì)分離，且能在工業(yè)上使用的方法必將對(duì)生物技術(shù)的工業(yè)化成功起著促進(jìn)作用。
眾所周知，許多化合物與配基配合，這樣這些化合物便可用已知親合分離法的技術(shù)來離析。參見“Chromatography，Affinity”Kirk-othmerEncyclopediaofChemicalTechnology，6，35-54(JohnWiley&Sons:NewYork，1979)。此分離方法包括三相(1)吸附相，其中所需要的化合物，例如，來自異源基因混合物的蛋白質(zhì)，同化學(xué)官能團(tuán)，如-配基生成-配合物，結(jié)合到不溶性基質(zhì)上，所述基質(zhì)，例如，聚合物或玻璃珠，(2)洗滌相，其中大部分溶液同與所說不溶基質(zhì)結(jié)合不牢的污物一道被洗掉，和(3)洗脫階段，其中洗脫液破壞所要化合物同與所說不溶基質(zhì)相結(jié)合的配基間形成的配合物，從而使所需的化合物釋出?？蓪?duì)帶所說結(jié)合配基的不溶基質(zhì)，即指親合顆粒進(jìn)行洗滌并重復(fù)使用，此法可重復(fù)若干次。
一般根據(jù)單位質(zhì)量表面積來選擇親合顆粒。例如，雖然直徑100微米的無孔珠可提供0.06m2/g表面積的珠，而直徑為1微米的類似珠可提供6.0m2/g表面積的珠，直徑為0.1微米的珠提供60m2/g表面積的珠。很清楚，較小的親合顆?？商峁┹^大的單位重量表面積，這是更加希望的。在親合分離時(shí)，一般希望使用表面積約大于20m2/g的親合顆粒，這樣如果希望將無孔親合顆粒用于親合分離工藝，這種親合顆粒直徑必須是亞微米級(jí)的。
親合分離法用得最廣是親合色譜。親合色譜利用緊密裝填親合顆粒的柱子，含目的化合物，例如蛋白質(zhì)，的液體(例如料液流)在加壓下流經(jīng)此柱子。象這樣的填料和固定床的動(dòng)力學(xué)由Ergun方程決定。Chem.Eng.Prog，48(1952)。當(dāng)所說床經(jīng)歷液體層流時(shí)用此方程證明穿過床的壓力降同所說顆粒直徑的平方成反比。如果進(jìn)行計(jì)算，用亞微型親合顆粒體系的壓力降比裝填直徑為100微米顆粒的壓力降大100萬倍。因此，這種效果就不利于將這種小的親合顆粒用于親合分離。這樣，一般的床使用粒度約為100微米的親合顆粒來使壓力降維持在可接受的范圍內(nèi)。
為了提供單位重量的高表面積，業(yè)已進(jìn)行了種種努力來克服無孔親合顆粒所存在的各種問題。具體講，業(yè)已用多孔親合顆粒來代替無孔親合顆粒。在一般應(yīng)用時(shí)，在中等壓力降條件下，直徑約100微米的多孔珠提供的表面積約為每珠40m2/g。
然而，使用多孔親合顆粒又出現(xiàn)了無孔親合顆粒所未經(jīng)歷的其它問題。雖然原因還不完全了解，但是也許存在著堵塞和擴(kuò)散阻力的問題，但是對(duì)于要被分離的物質(zhì)而言，一般只能接近5%所說親合顆粒的孔的外部。這就導(dǎo)致了多孔親合顆粒的有效表面積要比理論上計(jì)算的總表面積小得多。雖然對(duì)料液流的預(yù)處理可以至少防止部分堵塞和多孔親合離子擴(kuò)散阻力，但是，對(duì)料液流的這種預(yù)處理涉及成本問題和一系列耗時(shí)步驟。而且，每增加一個(gè)處理步驟就會(huì)增加目的化合物的損失，產(chǎn)率也會(huì)降低。
而且由于多孔親合顆?？偙砻娣e的大部分是在親合顆粒表面內(nèi)部，傳質(zhì)有效地控制著分離工藝，因此，導(dǎo)致分離費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而且，親合顆粒的孔對(duì)不要的化合物和碎片起著捕集作用且還會(huì)污染所要的化合物。而且由于親合顆粒的孔逐漸堵塞，其效率也會(huì)雖著循環(huán)的進(jìn)行而降低。此外，由于孔的存在，親合顆粒機(jī)械強(qiáng)度會(huì)降低，這就導(dǎo)致耐磨性和機(jī)械性差及親合顆粒在高壓下萎陷。當(dāng)裝于床中時(shí)，有孔親合顆粒膨脹，需要對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)整。
為親合顆粒特有的柱技術(shù)要考慮的另一問題是，為了獲得高的流速，柱子的容量必須大。然而，高的柱子在其下部的壓力就高，以至于使親合顆粒變形和物料通過量降低。工業(yè)上企圖通過設(shè)計(jì)短而相當(dāng)粗的柱子來解決這一問題。然而，由于溝流和活塞式流動(dòng)的偏差使效率大大降低，所以這種折衷方案并不完全令人滿意。
柱子還存在著導(dǎo)致低的有效利用吸附劑的濃度波動(dòng)現(xiàn)象。特別是當(dāng)物料通過柱子時(shí)，由于進(jìn)入?yún)^(qū)已被目的化合物飽和，所以在特定時(shí)間范圍內(nèi)，只有親合顆粒的小部分區(qū)域被利用。如果在給定時(shí)刻僅是波面同吸附劑接觸，這就會(huì)導(dǎo)致濃度波動(dòng)現(xiàn)象。
為了克服固定床固有的缺點(diǎn)和其中使用多孔親合顆粒所帶來的問題，研究人員已把他們的注意力轉(zhuǎn)在了移動(dòng)床親合分離體系上。
流化床是移動(dòng)床親合分離體系中的一種類型。在這種床中，從柱底泵入料液，然而，使親合顆粒象液體一樣。這樣，在流化床中就不存在濃度波動(dòng)現(xiàn)象。然而，所有的親合顆粒將同時(shí)曝露于料液中。由于親合顆粒的有效利用和物料通過量的增加，所以同柱相比流化床的產(chǎn)量更高。同固定床體系相比，流化床還可接受更高水平的顆粒碎片，同時(shí)效率還相當(dāng)高。
然而，流化床的缺點(diǎn)是效率限制了用于該體系中的親合顆粒的粒度和密度，即密度必須最大、粒度必須最佳。這是因?yàn)榉蛛x方法的主要部分一般是受親合顆粒沉降速度的控制。這樣所用的親合顆粒的密度越大，親合顆粒沉降也就越快，因此能夠使用較高的流化速度。流化速度的增加將會(huì)導(dǎo)致較高的物料通過量，因此效率也較高，直至達(dá)到動(dòng)力學(xué)速度的上限。雖然動(dòng)力學(xué)速度會(huì)由于親合顆粒粒度的降低而增加(這樣就增加了總的有效表面積)，動(dòng)力學(xué)速度的增加也有著限制能獲得的流化速度的負(fù)效果，因此降低了效果。將這些權(quán)衡起來考慮對(duì)親合顆粒大小和密度就需要有一個(gè)折衷方案，這種方案就妨礙了這種類型的體系達(dá)到較高的效率。
稱作攪拌釜體系的另一種類型的移動(dòng)床體系較之固定床柱有著明顯的好處。在攪拌釜體系中，采用機(jī)械手段使親合顆粒在釜中處于懸浮狀態(tài)。這種混合作用使懸浮體象均勻流體一樣流動(dòng)，因此使所有顆粒同時(shí)曝露于目的化合物中。因此，將此法設(shè)計(jì)為一個(gè)封閉體系，產(chǎn)量大大提高。在這類體系中的親合顆粒優(yōu)選有足夠的浮力以便能穩(wěn)定的懸浮于該工藝液體中。由于在此體系中裝柱較少，所以親合顆粒的優(yōu)選直徑一般要比柱或流化床的小，這樣的直徑便于增加表面積。攪拌釜的主要的局限性在于由于粗的原料，用于洗滌和洗脫段的過濾器會(huì)堵塞。這樣，一般對(duì)料液流必須進(jìn)行預(yù)處理，從而要增加附加工藝步驟和降低整個(gè)體系的效率。
在上述和各慣常親合分離方法中，均涉及多個(gè)工藝步驟。雖然每一個(gè)工藝步驟具有80-90%效率或產(chǎn)率，但是，有幾個(gè)工藝步驟卻容易把整個(gè)體系效率和產(chǎn)率降低到50%或更低。整個(gè)體系的效率會(huì)隨著每一個(gè)附加工藝步驟的增加而進(jìn)一步降低。
因此，需要一種無現(xiàn)有親合分離方法中所固有的所說許多問題，且提供一種從液體中，例如，稀料液流中離析和分離化合物，例如蛋白質(zhì)等的一種更加有效的方法。本發(fā)明提供了這樣一種方法。本發(fā)明的方法涉及一種能在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的工藝步驟較少的且整個(gè)效率有所增加的親合分離方法以從液體中除去所需要的化合物。然而，本發(fā)明的方法克服了會(huì)對(duì)該體系的動(dòng)力學(xué)和流動(dòng)產(chǎn)生不良影響的親合顆粒和過濾介質(zhì)的堵塞問題，又不需要對(duì)含所需化合物的液體進(jìn)行預(yù)處理。而且各種密度和粒度的親合顆粒，例如單位重量表面積高的小的親合顆粒均可成功地用于本發(fā)明的親合分離方法，這將能使所確定的體系于特定最終用途獲得更高的效率。本發(fā)明的這些目的其他目的和優(yōu)點(diǎn)以及本發(fā)明的其它特點(diǎn)均不背離本說明書的精神。
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的親合分離方法，包括(a)在包括移動(dòng)裝置、有上游和下游面的過濾介質(zhì)、同所說過濾介質(zhì)上游面液體連接的入口和同所說過濾介質(zhì)下游面液體連接的濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中裝入親合顆粒和含有將分離的能吸附在所說親合顆粒上的目的化合物的液體，其中所說液體能通過所說過濾介質(zhì)，所說親合顆?；旧喜荒艽┻^所說過濾介質(zhì)(b)啟動(dòng)設(shè)有處于關(guān)閉位置足以使所說的目的化合物吸附在所說親合顆粒上的條件下的所說濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的移動(dòng)裝置;和(c)打開所說濾液出口以讓所說液體穿過所說動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的所說過濾介質(zhì)來從所說液體中分離所說親合顆粒。所說濾液中基本無目的化合物。如果想回收目的化合物和/或要重復(fù)使用所說親合顆粒，則從所說親合顆粒中洗脫去所說目的化合物。


圖1是用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的重要單元的方框圖。
圖2是本發(fā)明親合分離方法中用的優(yōu)選動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的簡(jiǎn)圖。
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的親合分離方法。特別是業(yè)已出乎意料的發(fā)現(xiàn)所說動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備可用于含目的化合物的液體和親合顆粒間的有效接觸;其后所說動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備可用于從其上吸附或配合有化合物的所說親合顆粒上分離去液體。這樣一種方法能使用直徑小的和單位重量親合顆粒有相當(dāng)大表面積的親合顆粒。
本發(fā)明的方法是一種改進(jìn)的親合分離方法，包括(a)在包括移動(dòng)裝置、有上游和下游面的過濾介質(zhì)、同所說過濾介質(zhì)上游面液體連接的入口和同所說過濾介質(zhì)下游面液體連接的濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中裝入親合顆粒和含有將分離的能吸附在所說親合顆粒上的目的化合物的液體，其中所說液體能通過所說過濾介質(zhì)，所說親合顆?；旧喜荒艽┻^所說過濾介質(zhì);(b)啟動(dòng)設(shè)有處于關(guān)閉位置足以使所說的目的化合物吸附在所說親合顆粒上的條件下的所說濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的移動(dòng)裝置;和(c)打開所說濾液出口以讓所說液體穿過所說動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的所說過濾介質(zhì)來從所說液體中分離所說親合顆粒。
在所說液體中基本無目的化合物。如果要回收目的化合物和/或重復(fù)使用親合顆粒，則對(duì)親合顆粒進(jìn)行洗滌并從親合顆粒中洗脫去目的化合物。
本發(fā)明的方法為一種通過親合分離步驟從能被分離的化合物，例如，發(fā)酵稀溶液中的蛋白質(zhì)的稀溶液中十分有效的進(jìn)行分離的方法。本發(fā)明提供了一種較之已知的親合分離方法進(jìn)行親合分離需要較少分離步驟的設(shè)備，因此，提高了該分離方法的整個(gè)產(chǎn)率。在同親合顆粒接觸前，本發(fā)明的方法的確不需要對(duì)液體進(jìn)行預(yù)處理。同已知的親合分離方法比，本發(fā)明的方法所用的時(shí)間也相當(dāng)短。再者，由于本發(fā)明的方法優(yōu)選利用了無孔親合顆粒，所以本發(fā)明的方法避免了使用多孔親合顆粒所存在的種種問題，例如，親合顆粒的堵塞、容易破碎、膨脹和有效表面積低。此外，本發(fā)明的方法一般還避免了慣常親合分離方法所存在的溝流、濃度波動(dòng)現(xiàn)象和過濾介質(zhì)的堵塞問題。
本發(fā)明的方法包括將親合顆粒和要被處理的液體裝入動(dòng)態(tài)過濾裝置中，所說液體為含能吸附在所說親合顆粒上的將被分離的目的化合物的液體。這樣的動(dòng)態(tài)過濾裝置優(yōu)選包括移動(dòng)設(shè)備、有上下游面的過濾介質(zhì)、同所說過濾介質(zhì)上游面液體連接的入口和同所說的過濾介質(zhì)下游面液體連接的濾液出口。所說過濾介質(zhì)所具有的孔徑應(yīng)使被處理的液體全部或基本上全部通過過濾介質(zhì)，而親合顆粒基本上不通過過濾介質(zhì)。
在親合顆粒和要被處理的液體裝入動(dòng)態(tài)過濾裝置時(shí)，構(gòu)成的該裝置應(yīng)能防止任何液體通過此過濾介質(zhì)，例如，用適當(dāng)?shù)拈y來關(guān)閉濾液出口。然后啟動(dòng)移動(dòng)設(shè)備(或在裝入親合顆粒和要被處理的液體時(shí)啟動(dòng))，這樣來使被處理的液體中的目的化合物同親合顆?；旌?。此混合工藝持續(xù)足夠的時(shí)期，例如，直至親合顆粒吸附的目的化合物達(dá)到最高值或平衡。由于目的化合物和親合顆粒之間的相互作用是恒定的和可重復(fù)的，該混合工藝可使類似的批液間在離析目的化合物時(shí)要用的親合顆粒的量及含目的化合物的液體和親合珠間相互作用的時(shí)間十分精確。這樣，本發(fā)明的方法為一種快速循環(huán)方法，在長(zhǎng)期生產(chǎn)中既是有效的，又可節(jié)省使用親合顆粒，其中，類似的液體可按例常方式處理。
然后讓液體通過過濾介質(zhì)以從液體中分離去親合顆粒。例如，打開濾液出口即可實(shí)現(xiàn)這種分離，而移動(dòng)設(shè)備優(yōu)選仍按正常方式運(yùn)行。然后優(yōu)選用適宜的液體來洗滌親合顆粒，例如，用洗滌緩沖液來洗滌，這樣來除去任何殘存的液體。
對(duì)化合物進(jìn)行洗脫來從親合顆粒中回收目的化合物。可用任何適宜的技術(shù)來進(jìn)行這種洗脫，優(yōu)選將親合顆粒裝入適當(dāng)?shù)娜萜髦?，例如柱子中，再讓洗脫液，例如解吸劑，流?jīng)裝有親合顆粒的容器以從親合顆粒中除去目的化合物。為了使洗脫液的用量最少及增加回收化合物的濃度，在洗脫容器中裝的親合顆粒優(yōu)選盡可能密。在洗脫液中一般存在目的化合物的濃度至少約比未處理的液體中目的化合物的濃度，即同親合顆粒接觸前的液體中的目的化合物濃度大十倍，優(yōu)選至少約大約二十倍。最優(yōu)選的情況是，流過洗脫容器洗脫液的量約等于洗脫容器的空體積，或至少不大于其二或三倍空體積，例如，約為密實(shí)地裝添有基本上單分散球形親合顆粒柱的體積的一半。
在待處理的液體中最大的碎片的相對(duì)大小、過濾介質(zhì)的孔徑和親合珠的直徑在本發(fā)明親合分離方法的實(shí)際應(yīng)用中是重要的。理想的情況是過濾介質(zhì)能讓所有的液體通過(包括最大的碎片通過)，而又不讓任何親合顆粒通過。因此，過濾介質(zhì)的優(yōu)選孔徑至少比待處理的液體中最大的碎片大兩倍，優(yōu)選五倍或十倍，所說親合顆粒優(yōu)選至少比過濾介質(zhì)孔徑大兩倍，優(yōu)選五倍或十倍。例如，待處理的液體中最大的碎片為0.1-0.2微米，過濾介質(zhì)的孔徑優(yōu)選約1-3微米，而親合顆粒優(yōu)選約10-20微米。
一般而言，優(yōu)選用可接受的最小的親合顆粒，例如，直徑為60微米以下的，特別是直徑為20微米以下或更小的通過增加每單位重量同被處理的液體相互作用的親合顆粒的有效表面積來提高目的化合物的回收率。因此，由于對(duì)要被處理的液體進(jìn)行預(yù)處理的這一附加的工藝步驟會(huì)對(duì)目的化合物的回收率有不利的影響，所以對(duì)本發(fā)明方法而言一般不希望進(jìn)行預(yù)處理，例如，由于預(yù)處理和/或均化使液體中最大的碎片變小而帶來的回收率的損失要比致使能用每單位重量親合顆粒有更大表面積的較小親合顆粒的大。
參考本發(fā)明的附圖會(huì)對(duì)本發(fā)明有進(jìn)一步了解。圖1為用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案重要部件的方塊圖。在本發(fā)明方法開始時(shí)，將含從貯存的所說液體中待分離的目的化合物的待處理液體貯存于貯槽1中，親合顆粒貯于貯槽2中。將所說液體和親合顆粒送于緩沖液罐3中，在這里合并形成混合物，優(yōu)選進(jìn)行攪拌。雖然此流體和親合顆粒可不經(jīng)緩沖液罐3直接送到動(dòng)態(tài)過濾裝置4中，但是通過入口5把此混合物送入動(dòng)態(tài)過濾裝置4。采用如處于關(guān)閉狀態(tài)的濾液閥7一類機(jī)械對(duì)動(dòng)態(tài)過濾裝置4進(jìn)行攪拌，此時(shí)不讓任何液體通過此裝置4。
在適當(dāng)攪拌后或甚至在攪拌期間，在間歇或連續(xù)工藝中通過濃縮閥8將部分或全部混合物送到檢測(cè)箱9，在其中測(cè)定仍未同所說親合顆粒結(jié)合的液體中的目的化合物的濃度。如果需要，這種檢測(cè)可依據(jù)動(dòng)態(tài)過濾裝置4的連續(xù)或間歇操作方式來進(jìn)行。而且，在重復(fù)處理類似批液的定型生產(chǎn)工藝中，確定了流體的適宜的量、親合顆粒和動(dòng)態(tài)過濾裝置中的停留時(shí)間以后，不需要任何檢測(cè)設(shè)備，因?yàn)楸景l(fā)明的方法對(duì)目的化合物的回收是十分恒定的且重復(fù)性好的。然而可以這樣來使用檢測(cè)設(shè)備，優(yōu)選用以來控制濾液閥7、濃縮閥8和洗滌緩沖液閥11的關(guān)閉，這樣來控制混合物的流動(dòng)方向及動(dòng)態(tài)過濾裝置4中的過濾工藝的啟動(dòng)和停止。
如果使用單獨(dú)設(shè)置的檢查箱9，且液體中的未結(jié)合的目的化合物的濃度大于預(yù)選的水平，則通過緩沖液罐3及上述方法將混合物返回到動(dòng)態(tài)過濾裝置4。可重復(fù)此法直至液體中未結(jié)合的目的化合物的濃度低于預(yù)選水平，這表明親合顆粒上已吸附上了足夠量的目的化合物。
在不管用什么方法已經(jīng)確定了親合顆粒上已吸附上了足夠量的目的化合物后，打開濾液閥7以讓流體穿過動(dòng)態(tài)過濾裝置4的過濾介質(zhì)流入洗滌槽6，而讓親合珠留在過濾裝置4中。雖然其他液體也可通入動(dòng)態(tài)過濾裝置4同親合珠接觸，一般仍將過濾閥7關(guān)閉，特別是親合珠未被目的化合物飽和時(shí)更是如此。其他液體以連續(xù)或半連續(xù)的方式通入所說裝置4，而所說裝置4中的部分所說液體繼續(xù)穿過所說裝置4中的所說過濾介質(zhì)。
所說裝置4中將液體加完及所說裝置4中的所說液體穿過所說過濾介質(zhì)后，打開洗滌緩沖液閥11讓箱10中的洗滌緩沖液進(jìn)入裝置4。讓洗滌緩沖液同親合顆?；旌线m當(dāng)?shù)臅r(shí)期，然后再打開濾液閥7以便讓洗滌緩沖液進(jìn)入洗滌槽6。為確保被處理的所說液體(結(jié)合到親合顆粒上的目的化合物除外)已從所說裝置4中去除，一般這種洗滌循環(huán)要進(jìn)行若干次。
然后通過濃縮閥8把親合顆粒送入洗脫槽13。這可按如下方式來實(shí)現(xiàn)，用洗滌緩沖液箱10中的洗滌緩沖液把親合顆粒送入洗滌槽13中，在此槽中，優(yōu)選將其裝填密實(shí)。打開洗脫液閥14讓洗脫液箱15中的洗脫液進(jìn)入洗脫槽13以從親合顆粒中除去目的化合物并讓目的化合物流經(jīng)槽13以進(jìn)行搜集。當(dāng)流出液流離開槽13時(shí)，優(yōu)選使其通過流出液檢測(cè)設(shè)備16，以檢測(cè)流出液流中目的化合物的濃度，如果目的化合物的濃度達(dá)到預(yù)先確定的水平，例如，約為0時(shí)，關(guān)閉洗脫液閥14。
然后重復(fù)使用其上不再結(jié)合有所說目的化合物的親合顆粒。優(yōu)選從懸浮緩沖液箱12把懸浮緩沖液送入槽13，這樣把槽13中的親合顆粒送入貯槽2以重復(fù)使用。
通過準(zhǔn)確計(jì)算動(dòng)態(tài)過濾裝置4的運(yùn)行時(shí)間及槽13中對(duì)化合物的洗脫時(shí)間，即可同時(shí)操作此兩裝置，這樣把間歇式操作變成半連續(xù)操作。圖1僅為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的簡(jiǎn)要說明，本發(fā)明其他實(shí)施方案的實(shí)際設(shè)備的配置會(huì)有相當(dāng)大的變化。例如可將檢測(cè)設(shè)備9和裝置4分開設(shè)置或?qū)⒃O(shè)備9設(shè)置于裝置4上這樣就不需將混合物送入裝置4或從其中送出。同樣檢測(cè)設(shè)備16和槽13既可分開設(shè)置，也可將設(shè)備16設(shè)置于槽13上，對(duì)來自親合顆粒的目的化合物的洗脫既可在槽13中進(jìn)行也可在任何其它適宜的設(shè)備中進(jìn)行。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以進(jìn)行種種變化。同樣，為了清楚起見，所涉及的普通元件例如管道和閥門在圖1中未示出，上述討論中也未提及。將這樣的元件用于本發(fā)明是相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員力所能及的。
親合顆粒任何適宜的親合顆粒均可用于本發(fā)明。親合顆粒包括基材和其表面上的能同液體中的目的化合物結(jié)合的配體，所說的這種結(jié)合能夠從所說液體中分離去目的化合物，而目的化合物又能從親合顆粒上出去。適宜的親合顆粒包括本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的適宜的基材和配體。慣常親合分離方法中所用的許多親合顆粒均適宜或更適宜于本發(fā)明的方法。當(dāng)然，用于從特定的液體中分離特定的化合物的親合顆粒的種類會(huì)有一些變化，特別是同所說親合顆?；谋砻娼Y(jié)合的配體更是如此。對(duì)配體的選擇的原則是應(yīng)確保所說目的化合物有選擇性地并可逆地同所說親合顆粒相結(jié)合或吸附于其上，例如與所說親合顆粒配合或吸附于其上。
親合顆粒優(yōu)選表面的光滑的無孔(即孔徑約小于2000埃的或在10000x倍掃描電子顯微鏡下無可見孔)的，這種顆粒是親水的(即臨界濕表面張力至少約72達(dá)因/厘米)且不易受結(jié)合的蛋白質(zhì)影響的(即僅僅通過吸附的配體結(jié)合的)。為了使本發(fā)明的方法有穩(wěn)定的和可預(yù)計(jì)的親合分離結(jié)果，親合顆粒其間也優(yōu)選均質(zhì)的，特別是吸附于其上的配體的量更是如此。
任何適宜形狀的親合顆粒均可使用，但是優(yōu)選基本上為球形的。然而優(yōu)選基本上為單分散性直徑的。大小類似的球形親合顆粒為本發(fā)明的分離方法提供了最有效的操作，特別是對(duì)親合顆粒的處理更是這樣。這樣的親合顆粒產(chǎn)生流動(dòng)涉及的問題的可能性最小且使洗脫容器的大小和從親合顆粒上除去所說目的化合物所用的洗脫液的量均最小，這樣用此種親合顆粒來進(jìn)行裝填時(shí)可以更加均勻和密實(shí)。
可以使用任何適宜大小的親合顆粒。其平均直徑一般小于100微米，更優(yōu)選約60微米的。親合顆粒的直徑優(yōu)選平均約小于20微米，更優(yōu)選約小于10微米的。在很多場(chǎng)合可方便地使用直徑約為1-5微米的親合顆粒。如上所述，由于最小顆粒的直徑是用最大顆粒的直徑來劃分的，所以親合顆粒優(yōu)選基本上是單分散性直徑的，直徑的范圍優(yōu)選不會(huì)約相差50%，更優(yōu)選不超過約25%的，最優(yōu)選不超過約10%。親合顆粒的直徑可用已知方法來測(cè)定，例如用掃描電子顯微鏡來測(cè)定。
在任何情況下，均希望所有親合顆?；静煌ㄟ^所說過濾介質(zhì)，因?yàn)檫@會(huì)帶來親合顆粒的損失及目的化合物回收率的降低，當(dāng)然在目的化合物同親合顆粒結(jié)合后這種通過就可以了。為了避免親合顆粒的這種損失，優(yōu)選在進(jìn)一步處理前，將親合顆粒放于待用的處在動(dòng)態(tài)過濾裝置中的過濾介質(zhì)內(nèi)。在將同目的化合物結(jié)合的配體吸附前，用這種辦法來除去穿過過濾介質(zhì)的基材顆粒。確保帶結(jié)合目的化合物親合顆粒的幾乎全部回收和對(duì)于改進(jìn)處理的親合顆粒的粒度分布窄即可提高整個(gè)親合分離的工作效率。這樣得到的親合顆粒的粒度分布還可通過將過濾介質(zhì)改為一種較大孔徑的和再把親合顆粒放于動(dòng)態(tài)過濾中處理即可得到進(jìn)一步改善。在此第二次通過中流經(jīng)過濾介質(zhì)的回收的基材顆粒的粒度分布甚至更窄(基本上限制在第一次過濾介質(zhì)孔徑的下限及基本上限制在第二次過濾介質(zhì)孔徑的上限)。雖然對(duì)基材顆粒孔徑的控制優(yōu)選在其上吸附配體前進(jìn)行，當(dāng)然這種技術(shù)也可以用于選擇親合顆粒的粒度(即配體吸附到基材顆粒上以后)。
親合顆粒可具有任何適宜密度。親合顆粒的平均密度范圍可有利地為0.5克/立方厘米-3.0克/立方厘米左右，優(yōu)選1克/立方厘米-2克/立方厘米左右，最優(yōu)選1克/立方厘米左右以確保處理介質(zhì)期間有適當(dāng)浮力。
基材顆粒任何適宜的基材均可用于制備所說親合顆粒。如上所述，親合顆粒的表面優(yōu)選光滑的、無孔的和親水的且不易受吸附的化合物，特別是蛋白質(zhì)的影響的。基材可是均質(zhì)的材料，優(yōu)選滿足上述優(yōu)選特征的材料，或可以包括一種以上的材料(例如涂覆有另一種材料的芯材)、優(yōu)選滿足上述優(yōu)選特征的表面層。例如所說的基材可以包括均質(zhì)無孔材料、涂覆有無孔聚合材料的多孔芯材，或甚至于涂覆有無孔聚合材料的無孔芯材。雖然所說基材可包括如均質(zhì)多孔材料或甚至涂覆有多孔材料的芯材，但這種基材顆粒并不優(yōu)選用于本發(fā)明的方法。
基材顆粒優(yōu)選下述材料制備的，玻璃、氧化鋁、鋼(特別是不銹鋼等)、氧化硅、SiAL、硅藻土，或優(yōu)選聚合材料，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、纖維素、纖維素酯、聚碳酸酯、丙烯腈-丁二烯苯乙烯、聚苯氧聚合物、聚硅氧烷和乳膠。所說基材的曝露面必須有利于結(jié)合適宜的配體，在進(jìn)一步處理期間此配體將不變成不結(jié)合的。所說基材應(yīng)具有機(jī)械穩(wěn)定性、不膨脹的和曝露于待處理的液體中時(shí)又應(yīng)是不反應(yīng)的，基材的其它特性視待處理的特定液體和待從其分離的目的化合物而定。例如，所選定的基材應(yīng)使得所說親合顆粒具有所要求的浮力。特別適宜于親合分離蛋白質(zhì)的基材包括從Quantum Chemical商購的Microthene系列產(chǎn)品高低密聚乙烯(比重0.92-0.96;表面積＜1m2/g;平均粒度約20微米，其中約10%的顆粒超過50微米，這種顆?？蓮闹蟹蛛x出去)和從Dupont商購的PTFE-30(平均粒度約0.1-0.5微米)。
對(duì)所說基材應(yīng)涂覆到這樣一種情況，該基材應(yīng)是光滑的、無孔的、親水的和/或不易受結(jié)合的蛋白質(zhì)影響的，任何聚合物均可用作所說涂覆材料，但是，對(duì)用于分離所說目的化合物而言，適宜的配體應(yīng)能吸附于其上。任何適宜的將聚合物材料附于芯材上的方法均可使用。例如單體輻射接枝(尤其是電子束接枝)和聚合物溶液涂覆均是適合的。
改性纖維和纖維衍生物，例如醋酸纖維為生物相容性聚合物，這種聚合物一般特別適宜于本發(fā)明的方法。這類改性的纖維衍生物包括通過共價(jià)鍵使生物相容表面?zhèn)然w維基材聚合物相連接來改性的纖維聚合物表面，這樣其表面具有更好的生物相容性。雖然許多適宜的表面基團(tuán)是本領(lǐng)域眾所周知的，但是清蛋白特別適宜作這種改性基團(tuán)。涂覆芯材表面的適宜聚合物包括用各種單體制備的均聚合物和共聚物。例如，特別適宜輻射接枝的單體包括丙烯酸和甲基丙烯酸(特別是丙烯酸羥烷基酯和甲基丙烯酸羥烷基酯，例如丙烯酸羥乙酯，丙烯酸羥丙酯和甲基丙烯酸羥丁酯)和烯丙醇。特別適宜于溶液涂覆的聚合物包括羥基官能團(tuán)聚合物，例如烯丙醇，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，乙烯基縮水甘油基醚和烯丙基縮水甘油基醚。當(dāng)然許多其它的單體和聚合物均可用于制備用于本發(fā)明的親合顆粒。
無論是均質(zhì)的還是涂覆芯型基材的基材表面均優(yōu)選都應(yīng)該對(duì)被處理的液體中的目的化合物具有小的親合性或無親合性。這樣的表面確保了目的化合物將可逆地配合或吸附到基材顆粒表面上的配體上，而不是基材顆粒的表面上，對(duì)基材顆粒的這種吸附太強(qiáng)或太弱均會(huì)在進(jìn)一步處理中帶來損失或不能回收。為了確保親合顆粒和被處理的液體間接觸好和能很好的從被處理的液體中回收目的化合物，基材表面也優(yōu)選能為被處理的液體自發(fā)濕潤的。然而，為了使在所說親合顆粒表面上除吸附的配體上的目的化合物之外的其他物質(zhì)的吸附最小和易于對(duì)親合顆粒的凈化，所說基材的表面優(yōu)選光滑的。所說基材優(yōu)選能重復(fù)使用多次的，應(yīng)是化學(xué)穩(wěn)定的，這樣不會(huì)分解或不存在污染問題。
配體配體可以是能吸附在基材顆粒上的在隨后的處理中不被除去的且有選擇性地結(jié)合目的化合物，如抗體、抗原、蛋白質(zhì)、核酸、補(bǔ)體化合物、激素、維生素等的任何化學(xué)官能體。一般通過有所需官能體的特定化合物同基材顆粒反應(yīng)來提供所說配體，但也可以是整體的基材顆粒;例如芯材上有聚合物涂料的整體。
配體吸附到基材顆粒上的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。適宜的吸附方法包括共價(jià)自發(fā)吸附、對(duì)末端官能團(tuán)的化學(xué)活化和偶合劑吸附。
某些配體共價(jià)自發(fā)吸附到聚合物載體表面是通過從所說聚合物載體上伸出的化學(xué)活性官能團(tuán)來進(jìn)行的。例如從所說聚合物載體伸出的醛和環(huán)氧一類的活性官能團(tuán)容易同含可利用的羥基、氨基或硫醇基的配體偶合。在所說聚合物載體上的游離醛基也可通過乙縮醛鍵同含羥基的化合物偶合和通過酰亞胺鍵同含氨基的化合物偶合。此外，如游離肟基也可以通過烷基胺、醚和硫醚鍵分別同含胺、羥基和硫基的化合物偶合。關(guān)于這些反應(yīng)的更進(jìn)一步的討論如可參見Chen等人“ChemicalProceduresforEnzymeImmobilizationofPorousCelluloseBeeds，”BiotechnologyandBioengineering，XIX，1463-1473(1977)和“EpoxyActivatedSepharose，”PharmaciaFineChemicals(AffinityChromitography)，6B，27-32(1979)。
可通過對(duì)聚合物末端成分進(jìn)行改性的方法來活化其表面官能團(tuán)的辦法來實(shí)現(xiàn)對(duì)末端官能團(tuán)的化學(xué)活化。例如用高碘酸把末端環(huán)氧官能團(tuán)氧化形成活化醛基，還可參見Svec等人“ImmobilizationofAmyloglucosidoseonPoly[(GlycidylMethacrylate)Co(EthyleneDimethacrylate)]CarrierandItsDerivatives，”BiotechnologyandBioengineering，XX，1319-1328(1978)。可按上述方法來固定配體。游離羧基和氨基間的縮合反應(yīng)可通過羧基的碳化二亞胺的活化作用來實(shí)現(xiàn)，如參見Hoffman等人“NewApproachestoNon-ThrombogenicMaterials，”Coagulation-CurrentResearchandClinica，Applications.(AcademicPress，NewYork1973)。通過所述聚合物或配體羧基的碳化二亞胺的活化作用及同游離胺的縮合形成穩(wěn)定的肽鍵來固定所述的配體。配體的最終取向一般是使用含胺或含羧基聚合物所考慮的一個(gè)因素。
可使用各種偶合劑來在聚合物和配體間形成共價(jià)鍵的方法實(shí)現(xiàn)偶合劑的吸附。含游離羥基和含胺聚合物和配體間的共價(jià)偶合可通過溴化氰、二異氰酸鹽、二醛和三氯代-s-三嗪來實(shí)現(xiàn)。關(guān)于此法的進(jìn)一步討論參見上述所引的Chen等人的文章。
所說配體的活性結(jié)合部分子的位置及能共價(jià)結(jié)合的所說配體特定官能團(tuán)和聚合物基材在給定情形下一般指出了在聚合物基材上固定配體的優(yōu)選辦法。例如，如果含末端羥基官能團(tuán)的基材，用溴化氰的堿溶液(例如，10-20%w/v)處理進(jìn)行活化對(duì)本發(fā)明而言是優(yōu)選的。一般將此混合物的溫度保持在室溫(20-25℃)約30分鐘。加入堿性物質(zhì)例如氫氧化鉀和氫氧化鈉來把溶液的PH維持在10-12左右。然后用生理鹽水(0.9gm%)對(duì)所說聚合物進(jìn)行充分洗滌并在2-8℃下用溶解在弱堿緩沖溶液中的純配體溶液培養(yǎng)12-16小時(shí)。用生理鹽水對(duì)所說聚合物進(jìn)行充分漂洗以除去未結(jié)合的或結(jié)合不牢的配體。
同樣優(yōu)選通過醚、硫醚或烷基胺鍵使配體固定到含縮水甘油基聚合物上。于室溫下用中性緩沖水溶液對(duì)環(huán)氧聚合物基材進(jìn)行漂洗和膨脹。于4-30℃下用縮水甘油基聚合物基材對(duì)純化的配體、溶解的硼酸鹽、碳酸鹽或磷酸鹽緩沖溶液培養(yǎng)12-20小時(shí)。用鹽、醋酸(0.2-1.0M)和磷酸鹽緩沖的(PH7.2+/-0.2)鹽水溶液對(duì)所說聚合物進(jìn)行漂洗來除去過量的和結(jié)合不牢的配體。用溶解于水溶性碳化二亞胺的弱酸(PH4.5-6.5)緩沖溶液中的純配體進(jìn)行處理來活化含胺和羧基的聚合物。于2-8℃下培養(yǎng)所說基材、配體和碳化二亞胺12-16小時(shí)來使所說配體同聚合物基材共價(jià)偶合。先用酸后用堿交替對(duì)聚合物-配體共軛物進(jìn)行洗滌直至漂洗液無配體和碳化二亞胺反應(yīng)劑。
配體結(jié)合到基材顆粒表面的方法的其他例子參見5077210號(hào)美國專利。硅烷同基材結(jié)合并在配體的一個(gè)官能團(tuán)上同異雙官能交聯(lián)劑偶聯(lián)，這樣就有可自由的結(jié)合目的化合物例如蛋白質(zhì)的不同官能團(tuán)。硅烷優(yōu)選有同基材的羥基反應(yīng)的官能團(tuán)和同含隨后同目的化合物(例如蛋白質(zhì))的氨基反應(yīng)的琥珀酰亞胺反應(yīng)的異雙官能交聯(lián)劑的能團(tuán)反應(yīng)的硫醇末端基團(tuán)。
4357331號(hào)美國專利中公開了將抗體結(jié)合到基材顆粒表面上的方法。該方法包括通過三氯-三嗪共價(jià)結(jié)合抗體產(chǎn)生親合顆粒?！銭nzymeTechnorogy′(NoyesDataCorporation1983)中(特別在38-59頁上)公開了許多將酶固定到基材顆粒表面上的方法。
間隔團(tuán)也可用于制備用于本發(fā)明親合分離方法的親合顆粒。間隔團(tuán)一般為至少有兩個(gè)相同或不同的活性官能團(tuán)的(位于分子的相反末端的)分子，間隔團(tuán)用于連接基材顆粒和配體。間隔團(tuán)可用于促進(jìn)配體吸附在基材顆粒上并用于確保足以能控制配體遠(yuǎn)離基材顆粒，這樣對(duì)被處理的液體，特別是對(duì)目的化合物的接觸更加有效。其中的活性官能團(tuán)相同的適宜的間隔團(tuán)包括例如6-二氨基已烷、二乙烯亞砜、戊二醛、1，4-環(huán)已烷二甲酸、乙二胺四乙酸、三亞乙二甘醇、1，4-丁二醇二縮水甘油醚、二異氰酸亞甲基-對(duì)-苯酯和琥珀酸酐。其中的活性官能團(tuán)不同的適宜間隔團(tuán)包括，如6-氨基已二酸、對(duì)-硝基苯甲酰氯、1，2-環(huán)氧-3(對(duì)-硝基苯氧)丙烷、氨基丙基三乙氧基硅烷和高胱氨酸硫代內(nèi)脂。例如，清蛋白，一種低親合蛋白質(zhì)業(yè)已成功地用作間隔團(tuán)，清蛋白和其他天然蛋白質(zhì)也使親合顆粒具有更好的生物適應(yīng)性。
動(dòng)態(tài)過濾裝置動(dòng)態(tài)過濾裝置可以是任何適宜的動(dòng)態(tài)過濾裝置。該裝置的操作原則是不能因從過濾介質(zhì)排除的顆粒物質(zhì)和同過濾介質(zhì)相鄰的形成的濾餅層的破壞而使過濾介質(zhì)堵塞。這可用下述方法來實(shí)現(xiàn)，使液體流相對(duì)于所說過濾介質(zhì)的移動(dòng)要足夠快以產(chǎn)生高的剪切速度，及在顆粒上產(chǎn)生高的提升力，雖然諸如振動(dòng)式和往復(fù)式一類的設(shè)備同樣可獲得類似的效果，但在動(dòng)態(tài)過濾裝置中優(yōu)選使用對(duì)被處理的液體起作用的轉(zhuǎn)動(dòng)式設(shè)備來獲得上述效果。同切線或交叉流過濾技術(shù)(由于吸附的化合物引起的過濾器過早的堵塞和有同沿過濾器長(zhǎng)的方向上高的切線速度有關(guān)的化合物的吸附及大的和不均勻的壓力降、可能由于過濾介質(zhì)而引起的回流和過濾作用的降低等問題)相反，在動(dòng)態(tài)過濾工藝中的流體過濾介質(zhì)界面間的剪切幾乎同任何交叉流流體速度無關(guān)。
本發(fā)明中的動(dòng)態(tài)過濾有著許多的性能優(yōu)點(diǎn)。在動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中產(chǎn)生的極高的剪切速度為保證親合顆粒同被處理的液體間能充分的接觸來提高目的化合物的回收速度提供了一個(gè)優(yōu)異的手段。然而，由于業(yè)已觀察到滲透通量速率的增加在某些體系中同剪切速度的增加幾乎成線性關(guān)系，所以，同其它過濾設(shè)備相比，從親合顆粒中有效的除去被處理的液體所需要的過濾面積大大減少了。
動(dòng)態(tài)過濾裝置一般包括不可滲透的外殼和包含相對(duì)于液體移動(dòng)的過濾介質(zhì)的內(nèi)部元件。各種適宜的移動(dòng)設(shè)備均可用于進(jìn)行這種相對(duì)移動(dòng)，例如，旋轉(zhuǎn)式的、振動(dòng)式的或往復(fù)式的。在下述美國專利中披露了適宜的圓柱型動(dòng)態(tài)過濾體系US3797662、4066554、4093552、4427552、4900440和4956102。在美國專利US3997447、4956102和5037562及在1991年12月24日提交的No.07/812123號(hào)美國專利申請(qǐng)中公開了適宜的轉(zhuǎn)動(dòng)盤式動(dòng)態(tài)過濾體系。在US4952317中公開了其它適宜的動(dòng)態(tài)過濾體系。從市場(chǎng)上可以買到的其它的適宜的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備包括ASEABrowBoveryrotaryCROT、NEWLogicV-SEP和Murkes討論的過濾設(shè)備“FundamentalsofCrossflowFiltration”SeparationandPurificationMethods，19(1)，1-29(1990)。動(dòng)態(tài)過濾裝置的其它適宜結(jié)構(gòu)也可用于本發(fā)明。本發(fā)明的動(dòng)態(tài)過濾裝置優(yōu)選其剪切速率至少約為5，000/秒的，更優(yōu)選至少10，000/秒的。
用于動(dòng)態(tài)過濾裝置中的過濾介質(zhì)可使用任何適宜的過濾介質(zhì)，一般優(yōu)選多孔膜、優(yōu)選微孔聚合物膜。雖然，過濾介質(zhì)可以有任何適宜的孔徑，例如，20微米和20微米以下的、約10微米和10微米以下的、約5微米和5微米以下的，或甚至于1微米和1微米以下的，但過濾介質(zhì)優(yōu)選能讓全部或至少基本上全部被處理的液體通過過濾介質(zhì)的而不能讓全部或至少基本不能讓全部親合顆粒通過的。過濾介質(zhì)的孔徑在很大程度上取決于親合顆粒的粒度和被處理的液體中最大碎片(即非目的化合物)的尺寸。
圖2概述了用于本發(fā)明親合分離方法的優(yōu)選動(dòng)態(tài)過濾裝置。該裝置包括有進(jìn)料口21的殼20，濃縮物出口22和濾液出口23。在殼20內(nèi)沿過濾介質(zhì)25設(shè)有轉(zhuǎn)動(dòng)設(shè)備24。料液出口21和濃縮物出口22同過濾介質(zhì)上游面液體連接，而濾液出口23同過濾介質(zhì)25的下游面液體連接。液體能通過過濾介質(zhì)25，而親合顆?；静荒芡ㄟ^過濾介質(zhì)25。洗脫容器26同過濾介質(zhì)25的上游面液體連接并借助能控制親合顆粒和液體流入洗脫容器26頂部的洗脫容器入口閥27同殼20連接。洗脫容器26的底部有一出口閥28來控制液體流入和流出該容器26。
使用時(shí)通過料液入口21將含目的化合物的液體同親合顆粒的混合物送入殼20。啟動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)設(shè)備24使之有足夠的時(shí)間使所說目的化合物同設(shè)有濃縮液出口22和處于關(guān)閉狀態(tài)不讓任何混合物穿過所說過濾介質(zhì)25的濾液出口23的所說動(dòng)態(tài)過濾裝置中的所說親合顆粒結(jié)合。
然后打開濾液出口23，讓流體從動(dòng)態(tài)過濾裝置中除去來使混合物通過過濾介質(zhì)25來進(jìn)行過濾。通過進(jìn)料口21將洗脫緩沖液送入動(dòng)態(tài)過濾裝置以從該裝置中除去任何未結(jié)合的物質(zhì)，然后讓洗脫緩沖液穿過濾液出口23。如需要的話，可采用同樣的辦法進(jìn)行多次洗滌步驟。然后通過洗脫容器入口閥27將親合顆粒送入容器26，優(yōu)選在動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中送入少量洗脫緩沖液。為了確保動(dòng)態(tài)裝置的整個(gè)死體積完全而有效排空進(jìn)入洗脫容器26，優(yōu)選使動(dòng)態(tài)過濾裝置稍稍偏離設(shè)在動(dòng)態(tài)過濾裝置下部的洗脫容器水平位置例如5-10度。
通過料液入口21和洗脫容器入口閥27將洗脫液送入洗脫容器26以從親合顆粒中除去目的化合物，經(jīng)洗脫容器出口閥28將洗脫液從該容器26中排出。從親合顆粒上除去目的化合物并對(duì)其進(jìn)行回收后，然后通過洗脫容器出口閥28把懸浮緩沖液送入洗脫容器26，再經(jīng)洗脫容器進(jìn)口閥27使親合顆粒返回到動(dòng)態(tài)過濾裝置以重復(fù)使用。如需要的話可通過濾液出口23除去懸浮緩沖液，也可用含目的物的其他流體重復(fù)此法。
當(dāng)然，圖2僅為一實(shí)用于本發(fā)明裝置優(yōu)選實(shí)施方案的簡(jiǎn)要說明，用于本發(fā)明的實(shí)際設(shè)備的各種特定情形會(huì)有相當(dāng)大的變化。例如檢測(cè)設(shè)備可位于動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備內(nèi)來測(cè)定未結(jié)合的目的化合物的量。同樣檢測(cè)設(shè)備既可以同洗脫容器分開設(shè)置也可設(shè)置于該容器中來測(cè)定從親合顆粒上洗脫的目的化合物的量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以進(jìn)行種種變化。同樣為清楚起見，所設(shè)計(jì)的普通元件，例如管道和泵已從圖2中刪去了，上述討論中也未提出。將這些元件用于本發(fā)明，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。
使用說明本發(fā)明的方法可用于從任何液體中分離或離析任何化合物，當(dāng)然所說化合物和液體應(yīng)適合親合分離。例如，本發(fā)明的方法可用于從發(fā)酵產(chǎn)物牛奶和全血或血清等一類液體中離析蛋白質(zhì)和抗體。本發(fā)明的方法也可用于從外消旋混合物中分離特定的立體異構(gòu)體。
本發(fā)明的方法特別適用于從含蛋白質(zhì)的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。離析或分離蛋白質(zhì)，因此本發(fā)明的方法不需要對(duì)所說液體培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理來除去不要的污染物、例如細(xì)胞碎片、熱原、病原體、或毒物。
配體和目的化合物的其它各種結(jié)合關(guān)系列于下表配體目的化合物抑制劑;輔助因子;酶;朊輔基酶輔基;
聚合物基材酶聚合物抑制劑核酸(單鏈)核酸(互補(bǔ)鏈)半原;抗原抗體抗體蛋白質(zhì);多糖單糖;外源凝聚素;受體多糖外源凝聚素糖蛋白;受體小的目的化合物結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)小的目的化合物其它配體-目的化合物的相互關(guān)系是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所眾所周知的且可用于本發(fā)明的親合顆粒分離方法。
本說明書中所列的全部參考文獻(xiàn)包括公開文獻(xiàn)、專利、和專利說明書以參見的形式列入其中。
雖然用所強(qiáng)調(diào)的優(yōu)選實(shí)施方案來描述的本發(fā)明，很明顯，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用各種優(yōu)選實(shí)施方案實(shí)施時(shí)也可以對(duì)其中所述方案進(jìn)行中中修改。因此，本發(fā)明包括下述權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變體。
權(quán)利要求
1.一種親合分離方法，包括(a)在包括移動(dòng)裝置、有上游和下游面的過濾介質(zhì)、同所說過濾介質(zhì)上游面液體連接的入口和同過濾介質(zhì)下游面液體連接的濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中裝入親合顆粒和含有待分離的能吸附在親合顆粒上的目的化合物的液體，其中液體能通過過濾介質(zhì)，親合顆?；旧喜荒艽┻^過濾介質(zhì)；(b)啟動(dòng)設(shè)有處于關(guān)閉位置足以使所的目的化合物吸附在親合顆粒上的條件下液體不能通過過濾介質(zhì)的濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的移動(dòng)裝置；和(c)打開所說濾液出口以讓液體穿過動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的過濾介質(zhì)來從液體中分離親合顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在所說液體中未吸附在所說親合顆粒上的目的化合物的濃度降到預(yù)先確定的水平時(shí)進(jìn)行所說的分離步驟(c)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，所說方法還包括(d)洗滌所說親合顆粒，和(e)從所說親合顆粒上洗脫所說目的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中將其上吸附有所說目的化合物的所說親合顆粒從所說動(dòng)態(tài)過濾裝置中轉(zhuǎn)移到洗脫容器中并使洗脫液流經(jīng)所說洗脫容器以除去所說目的化合物來從所說親合顆粒上洗脫所說目的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中在所說洗脫液中的所說目的化合物的濃度比同所說親合顆粒接觸前所說液體中的所說目的化合物的濃度至少約大10倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中通過所說洗脫容器的洗脫液的量約等于所說洗脫容器的自由空體積。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中將所說的經(jīng)洗脫的親合顆粒返回到所說動(dòng)態(tài)過濾裝置并重復(fù)所說方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所說洗脫容器同所說動(dòng)態(tài)過濾裝置中的所說過濾介質(zhì)的上游面液體連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中使所說的動(dòng)態(tài)過濾裝置運(yùn)行能至少達(dá)到約5，000/秒剪切速度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中使所說的動(dòng)態(tài)過濾裝置運(yùn)行能至少達(dá)到約10，000/秒剪切速度。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說親合顆粒是無孔的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說親合顆?；緸榍蛐蔚摹?br> 13.根據(jù)權(quán)利要求1-12項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說親合顆?；臼菃畏稚⒅睆降摹?br> 14.根據(jù)權(quán)利要求1-13項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說親合顆粒的直徑比所說過濾介質(zhì)的孔徑至少約大2倍。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說親合顆粒的直徑比所說過濾介質(zhì)的孔徑至少約大5倍。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說親合顆粒的平均直徑約為60微米或60微米以下。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所說親合顆粒的平均直徑約為20微米或20微米以下。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所說親合顆粒的平均直徑至少約1微米。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說過濾介質(zhì)的孔徑比所說液體中最大碎片的尺寸至少約大兩倍。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所說過濾介質(zhì)的孔徑比所說液體中最大碎片的尺寸至少約大5倍。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說過濾介質(zhì)的孔徑約小于5微米。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所說過濾介質(zhì)是一種孔徑約小于1微米的微孔膜。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)未吸附所說親合顆粒上的所說液體中的所說目的化合物的濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說目的化合物是生物活性化合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-23項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說目的化合物是蛋白質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-23項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說目的化合物是抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說液體是發(fā)酵產(chǎn)品。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-26項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說液體是牛奶。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-26項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說液體是全血或血清。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-23項(xiàng)任一項(xiàng)的方法，其中所說目的化合物是立體異構(gòu)體，而所說液體是外消旋混合物。
31.裝填親合顆粒的方法，方法包括(a)在包括移動(dòng)裝置、有上游和下游面的過濾介質(zhì)、同所說過濾介質(zhì)上游面液體連接的入口和同所說過濾介質(zhì)下游面液體連接的濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中裝入親合顆粒和含有待分離的能吸附在所說親合顆粒上的目的化合物的液體，其中所說液體能通過所說過濾介質(zhì)，所說親合顆?；旧喜荒艽┻^所說過濾介質(zhì);(b)啟動(dòng)帶處于開啟位置以讓直徑基本上比所說過濾介質(zhì)孔徑小的所說任何基材顆粒穿過所說動(dòng)態(tài)過濾介質(zhì)的所說濾液出口的所說動(dòng)態(tài)過濾裝置的所說移動(dòng)設(shè)備，和(c)從所說動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中回收未穿過所說過濾介質(zhì)的所說基材顆粒。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中用所說的回收的基材顆粒、具有較大孔徑的過濾介質(zhì)和回收的穿過所說過濾介質(zhì)的所說基材顆粒重復(fù)所說方法。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的方法，其中配體基本吸附到所說回收的基材顆粒上以形成親合顆粒。
34.包括基材和吸附于其上的配體的親合顆粒，所說基材包括芯材、無孔材料和涂覆于其上的無孔的親水聚合物涂料。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的親合顆粒，其中所說聚合物涂料包括輻射接枝單體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的親合顆粒，其中所說單體是從由丙烯酸和甲基丙烯酸組成的一組物質(zhì)中選出的。
37.根據(jù)權(quán)利要求34-36項(xiàng)任一項(xiàng)的親合顆粒，其中所說芯材是多孔的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一親合分離法a在含移動(dòng)裝置、有上和下游面的過濾介質(zhì)、同過濾介質(zhì)上游面液體連接的入口和同過濾介質(zhì)下游面液體連接的液濾出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備中裝入親合顆粒和含有待分離的能吸附在親合顆粒上的目的化合物的液化，其中液體能通過過濾介質(zhì)，親合顆?；旧喜荒艽┻^過濾介質(zhì)；b啟動(dòng)設(shè)有處于關(guān)閉位置足以使目的化合物吸附在親合顆粒上的條件下液體不能通過過濾介質(zhì)的濾液出口的動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的移動(dòng)裝置；c打開濾液出口以讓液體穿過動(dòng)態(tài)過濾設(shè)備的過濾介質(zhì)來從液體中分離親合顆粒。然后洗滌親合顆粒和從親合顆粒中洗脫目的化合物。
文檔編號(hào)B01D29/01GK1107748SQ9411920
公開日1995年9月6日 申請(qǐng)日期1994年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月23日
發(fā)明者P·J·迪根, T·阿列克斯, R·F·沙利納羅 申請(qǐng)人:帕爾公司