本發(fā)明涉及一種基于單域重鏈抗體(又稱納米抗體技術(shù))的免疫親和吸附材料，特別是針對(duì)黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料。
技術(shù)背景
黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌產(chǎn)生的劇毒次級(jí)代謝產(chǎn)物。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，為二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃曲霉毒素b1(afb1)、b2(afb2)、g1(afg1)、g2(afg1)和m1(afm1)等。在天然污染的食品和飼料中，afb1的污染最為常見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為ⅰ類致癌物。世界各國(guó)及地區(qū)指定了嚴(yán)格的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，例如歐盟嬰幼兒食品中afb1允許量≤0.10μg/kg。
現(xiàn)有的黃曲霉毒素檢測(cè)方法主要有儀器分析法、免疫分析法以及薄層層析法。其中儀器分析法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)于分析樣品前處理要求較高，需要盡量去除樣品中的雜質(zhì)以減少對(duì)后續(xù)檢測(cè)的干擾。傳統(tǒng)的前處理方法有液相萃取、固相萃取等，處理過程繁瑣且特異性不高。親和層析技術(shù)基于配基與待測(cè)物質(zhì)之間特異性的識(shí)別，可通過一步操作實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合樣品中待測(cè)物的分離純化。目前使用的黃曲霉毒素親和純化介質(zhì)一般采用多克隆抗體或單克隆抗體作為配基，存在不耐有機(jī)試劑、活性迅速降低的問題。因此，需要開發(fā)活性高、穩(wěn)定性好的新型配基替換傳統(tǒng)抗體。單域重鏈抗體是由羊駝重鏈抗體的可變區(qū)組成，又稱為納米抗體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產(chǎn)等特性，相較于傳統(tǒng)抗體具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料及其應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
針對(duì)黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料(基于特異識(shí)別afb1納米抗體的親和吸附材料)包括載體和配基，所述配基為單域重鏈抗體，具有seqidno.:1、seqidno.:3、seqidno.:5、seqidno.:7、seqidno.:9、seqidno.:11、seqidno.:13所示的氨基酸序列。該配基可特異性識(shí)別黃曲霉毒素。
所述配基還可以為在前述序列的單域重鏈抗體基礎(chǔ)上通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造所獲得的能與黃曲霉毒素特異性結(jié)合的抗體。
所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。
上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備方法，其特征為：
所述載體為磁珠時(shí)，制備方法為：取1mg羧基磁珠于離心管中，加入500～1000μl活化緩沖液(10mm，nah2po4，ph6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入1～5mg碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，渦旋混合后，靜置30min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗滌磁珠3遍，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室溫反應(yīng)2～6h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠；
所述載體為瓊脂糖凝膠微球時(shí)，制備方法為：將cnbr活化的干膠用0.1mhcl洗滌10～15次，每次平衡5～10min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗滌5～15次，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室溫反應(yīng)2～10h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料；
所述載體為硅膠微球時(shí)，制備方法為：將硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(pbs，10mm，ph6.0)交替洗滌5～10次，用pbs緩沖液懸浮硅膠微球，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度1～10mg/ml的碳二亞胺(edc)，迅速混勻，4℃攪拌反應(yīng)12～24h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
將上述免疫親和吸附材料(載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球)裝填至層析柱，即得到黃曲霉毒素免疫親和層析柱，方法為：根據(jù)層析柱容量，取適量上述免疫親和吸附材料于層析柱，加入5～10倍柱床體積的pbs(10mm，ph7.4)洗滌后，4℃，保存于20％乙醇溶液。
共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠無需裝柱，直接吸附后磁鐵分離。
本發(fā)明還涉及裝載有所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的親和層析柱。
上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的應(yīng)用，用所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，富集黃曲霉毒素(afb1、afb2、afg1或afg2)。黃曲霉毒素免疫親和吸附材料在去除黃曲霉毒素、凈化黃曲霉毒素污染物料中的應(yīng)用。這種處理不以疾病診斷治療為目的。當(dāng)免疫吸附材料的載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球時(shí)，方法為：首先用純水清洗免疫吸附材料，加入樣品提取液，然后用純水淋洗，再用甲醇洗脫特異性吸附的黃曲霉毒素，收集的洗脫液，即為凈化和富集后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測(cè)。當(dāng)載體為磁珠時(shí)，方法為：將免疫磁珠加入純水中，磁力架回收磁珠，重復(fù)清洗3～5次，然后將免疫磁珠加入樣品提取液中，混勻，磁力架回收磁珠，純水清洗1～3次后，甲醇洗脫特異性吸附的黃曲霉毒素，收集的洗脫液，即為凈化和富集后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測(cè)。
本發(fā)明針對(duì)黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體，具有seqidno.:1所示的氨基酸序列，該配基可特異性識(shí)別黃曲霉毒素。該單域重鏈抗體容易獲得，可以通過生物學(xué)方法大量培養(yǎng)生產(chǎn)配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產(chǎn)方法，大大降低了生產(chǎn)成本。生產(chǎn)過程無需接觸黃曲霉毒素，避免了對(duì)生產(chǎn)人員身體傷害。具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產(chǎn)等特性，這些特性對(duì)于黃曲霉毒素的低成本、可重復(fù)使用的免疫學(xué)檢測(cè)方法有重要的實(shí)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面通過黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，這些具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
實(shí)施例1：
抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體(即針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)免疫文庫的構(gòu)建
將黃曲霉毒素b1與匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)共價(jià)偶聯(lián)，得到黃曲霉毒素人工抗原afb1-klh，取300μgafb1-klh與弗氏完全佐劑乳化后，對(duì)羊駝(lamapacos)進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫。加強(qiáng)免疫采用150μgafb1-klh與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接elisa法測(cè)定血清效價(jià)，選擇血清效價(jià)最高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取rna。
rna的提取參照takara公司rnaiso試劑說明書進(jìn)行。以rna為模板，oligodt為引物，參照takara公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cdna第一鏈。
采用primestar高保真dna聚合酶，經(jīng)巢式pcr獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪pcr分別以引物alpvh-ld和ch2-r擴(kuò)增cdna，反應(yīng)條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
將第一輪pcr產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的dna片段，作為第二輪pcr的模板，分別用引物alpvh-sfii和alpvhhr1-noti，alpvh-sfii和alpvhhr2-noti，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，40s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)dna片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存?zhèn)溆?。將噬菌粒phen1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物分別用sfii、noti雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連接。
表1文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物
注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列
連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10μl無菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌tg1。取10μl電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×yt培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h，采用引物m13-r和phen-r進(jìn)行菌落pcr，計(jì)算庫容；其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×yt培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h。用10ml，2×yt培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15～30％甘油，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
根據(jù)計(jì)算的庫容量結(jié)果，接種10倍庫容量的活細(xì)胞于20ml的2×yt(含2％葡萄糖，100μg/ml氨芐青霉素)，30℃，220r/min培養(yǎng)至od600達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃，220r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50ml的2×yt(含100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素)重懸沉淀，30℃，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清，加入5×peg/nacl溶液，冰上放置1h或4℃過夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(pbs，0.01m，ph7.4)，即得到抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫，取10μl測(cè)定滴度，其余分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2：
抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的淘選與鑒定
采用固相親和淘選的方法從實(shí)施例1所得抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫文庫中淘選針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體。將afb1與卵清白蛋白(albumin，ova)共價(jià)偶聯(lián)，得到人工抗原afb1-ova。每孔加入100μl用pbs稀釋的人工抗原afb1-ova，4℃，包被過夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/ml；吸出包被液，pbs洗板3次，每孔加入300μl3％bsa-pbs，37℃，封閉2h；pbs洗板6次，加入100μl噬菌體抗體文庫(約含2×1011cfu)，37℃，孵育1.5h；吸出未結(jié)合的噬菌體，用pbst(含0.5％tween-20)洗板5次(逐輪增加5次)，再用pbs洗板10次(洗板次數(shù)逐輪增加5次)；以100μl洗脫液(甘氨酸-鹽酸，ph2.2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用50μltris-hcl(1mol/l，ph8.0)中和洗脫物，取10μl用于滴度測(cè)定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。第二輪和第三輪淘選采用競(jìng)爭(zhēng)洗脫，分別用50和25ng/ml的afb1溶液在37℃，孵育1h。
經(jīng)三輪淘選后，采用輔助噬菌體km13對(duì)隨機(jī)挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-elisa和間接競(jìng)爭(zhēng)phage-elisa測(cè)定噬菌體顆粒的結(jié)合活性和特異性，實(shí)驗(yàn)設(shè)定陰性對(duì)照及背景對(duì)照，具體加樣步驟見表2。
表2間接phage-elisa加樣表
將elisa陽性克隆送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到插入片段的dna序列，其編碼針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體，具體如下：
g8(seqidno.:2):
cagttgcagctcgtggagtcagggggaggattggtgcaggctggggactctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcgactctttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccacgtattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
g4(seqidno.:4)：
caggtgcagctcgtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctacgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttgattactactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
d7：(seqidno.:6)：
cagttgcagctcgtggagtccggtggaggcttggtgcaggttggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcaactatttggtggactgttggtgctccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgccaagaacacggtatatctgcaaatgaatagcctgaaagttgaggacacggccatttattactgtgcattagataaccgccgcagttatgttaattactactcctcaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
c6:(seqidno.:8)：
caggtgcagctcgtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
h4:(seqidno.:10)：
cagttgcagctcgtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtacagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccactccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
h8：(seqidno.:12)：
caggtgcagctcgtggagtcggggggaggagcggtgcaggctgggggctctttgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccggcacaatctatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgttgcgactatttggtggacttttgatgccccatactatgcagactccgtgaagggtcgattcaccatctctagagacaacgacaagaacacggtgtatctacaaatgaacaacctgagccctgaggacacggccatttattactgtgcattagataatcgccgcagttatgttgattaccgctccgtaagtgagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
e12:(seqidno.:14)：
cagttgcagctcgtggagtcggggggaggcttggtgcagcctggggggtctctcacactctcctgtgcagcctctggacgcaccttcacaacgtatggcatgggctggttccgcgaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcaactatgtggtggactgttggtgccccatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatcactagagacagcgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcgttagatacccgccgcagttatgttgattaccgctcctcaagtgagtatgattactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca
依據(jù)dna測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得相應(yīng)的針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體的氨基酸序列：
g8(seqidno.:1)：
qlqlvesggglvqagdslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatlwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtatyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss
g4(seqidno.:3)：
qvqlvesggglvqaggstrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyysvseydywgqgtqvtvss
d7：(seqidno.:5)：
qlqlvesggglvqvggslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkvedtaiyycaldnrrsyvnyyssseydywgqgtqvtvss
c6:(seqidno.:7)：
qvqlvesggglvqaggslrlsctasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss
h4:(seqidno.:9)：
qlqlvesggglvqaggslrlsctasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtvgapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnslkpedtaiyycaldnrrsyvdyhsvseydywgqgtqvtvss
h8:(seqidno.:11)：
qvqlvesgggavqaggslrlscaasgrtgtiygmgwfreapgkerefvatiwwtfdapyyadsvkgrftisrdndkntvylqmnnlspedtaiyycaldnrrsyvdyrsvseydywgqgtqvtvss
e12:(seqidno.:13)：
qlqlvesggglvqpggsltlscaasgrtfttygmgwfreapgkerefvatmwwtvgapyyadsvkgrftitrdsakntvylqmnslkpedtavyycaldtrrsyvdyrssseydywgqgtqvtvss
采用間接競(jìng)爭(zhēng)phage-elisa法對(duì)陽性克隆與幾種不同黃曲霉毒素亞型的交叉反應(yīng)率進(jìn)行測(cè)定，將afb1、afb2、afg1、afg2和afm1五種標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至12個(gè)不同的工作濃度，在同樣的條件下進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)phage-elisa測(cè)定，分別繪制競(jìng)爭(zhēng)elisa曲線，計(jì)算抑制率為50％時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ic50)，按照公式：交叉反應(yīng)率(％)＝(afb1ic50/類似物ic50)×100％，所述類似物為afb2、afg1、afg2或afm1，得到本發(fā)明陽性克隆(針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)對(duì)于afb1的50％抑制濃度。結(jié)果表明，本發(fā)明陽性克隆(針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體)對(duì)于afb1具有較好的特異性，對(duì)afg1和afg2也有一定的結(jié)合能力。
實(shí)施例3：
抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的規(guī)模制備
編碼抗afb1單域重鏈抗體的dna片段的獲?。?.采用限制性內(nèi)切酶sfii/noti，雙酶切噬菌粒phen-抗afb1單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗afb1單域重鏈抗體基因；2.直接將抗afb1單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行化學(xué)合成；3.設(shè)計(jì)特異性引物，通過pcr技術(shù)從羊駝(lamapacos)來源的cdna庫中擴(kuò)增。
將得到的抗afb1單域重鏈抗體基因片段克隆至表達(dá)載體pet25，經(jīng)pcr和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗afb1單域重鏈抗體的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。
將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21，挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單菌落接入4mllba(luria-bertanibrothwith100μg/mlampicillin)液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)12h；以1％培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mllba液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)至od600達(dá)到0.5(約需2.5～3h)，加入終濃度0.1mm的iptg，30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)物8000r/min離心，在細(xì)胞沉淀中加入20ml磷酸緩沖液(ph7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細(xì)胞沉淀；在細(xì)胞沉淀中加入10ml相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細(xì)胞破碎處理，超聲破碎條件為200w，破碎2s，間歇3s，共240個(gè)循環(huán)，在4℃下對(duì)細(xì)胞破碎物12000r/min離心20min，取上清進(jìn)行親和層析純化和sds-page電泳分析，或在上清中加入終濃度30％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。
通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件(如宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間、溫度以及iptg濃度等)，可以進(jìn)一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達(dá)量，為大量制備抗afb1單域重鏈抗體提供了途徑。
實(shí)施例4黃曲霉毒素免疫親和磁珠的小量制備
采用納米磁珠作為載體，偶聯(lián)抗黃曲霉單域重鏈抗體后，得到黃曲霉毒素免疫磁珠，具體制備方法如下：
取1mg羧基修飾的磁珠(購自無錫百運(yùn)納米科技有限公司，羧基磁珠300nm)于離心管中，加入500μl活化緩沖液(10mm，nah2po4，ph6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入2mg碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，渦旋混合后，靜置30min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗滌磁珠3遍，加入溶于偶聯(lián)緩沖液的抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體1mg，室溫反應(yīng)3h，用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠3次，加入500μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)或1％(w/v)卵清蛋白(ova)的偶聯(lián)緩沖液封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)，室溫反應(yīng)30min。用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠3次，pbs溶液(10mm，ph7.4，0.02％w/v，na3n)重懸后保存于4℃。
實(shí)施例5黃曲霉毒素免疫親和吸附材料及親和柱的制備
采用瓊脂糖微球作為載體，偶聯(lián)抗黃曲霉單域重鏈抗體，具體制備方法如下：
將cnbr活化的干膠用0.1mhcl洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗滌10次，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球)，室溫反應(yīng)4h，使抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體與cnbr活化的瓊脂糖凝膠微球共價(jià)偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗滌2次后，加入封閉液室溫反應(yīng)2h以封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)。用5被膠體積的磷酸緩沖液(10mm，ph7.4)和醋酸緩沖液(0.1m，ph4.0)交替洗滌3次，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，5～10倍柱床體積的pbs(10mm，ph7.4)洗滌后，加入20％乙醇溶液，4℃保存。
實(shí)施例6黃曲霉毒素免疫親和吸附材料及親和柱的制備
采用硅膠微球作為載體，偶聯(lián)抗黃曲霉單域重鏈抗體，具體制備方法如下：
取2g硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(pbs，10mm，ph6.0)交替洗滌5～10次，用10mlpbs緩沖液懸浮硅膠微球，加入5mg抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度5mg/ml的碳二亞胺(edc)，迅速混勻，4℃攪拌反應(yīng)12～24h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，5～10倍柱床體積的pbs(10mm，ph6)洗滌后，加入含0.02％(w/v)na3n的pbs(10mm，ph6)，4℃保存。
實(shí)施例7黃曲霉毒素免疫親和柱柱容量、加標(biāo)回收率、重復(fù)使用測(cè)定
將實(shí)施例5或?qū)嵤├?制備的親和層析柱用5mlpbs(10mm，ph7.4)洗滌，加入5ml濃度為100ng/ml的afb1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，10ml純水淋洗，用1ml甲醇洗脫，收集洗脫液用高效液相色譜檢測(cè)洗脫液中afb1的含量，計(jì)算得出親和層析柱的容量為650～800ng。
取5g粉碎的花生、玉米樣品(不含黃曲霉毒素)，分別加入50ng、100ng和200ng的afb1或afg1標(biāo)準(zhǔn)品，用60％(v/v)甲醇-水溶液提取樣品，渦旋振蕩15min，快速定性濾紙過濾，取5ml濾液，加pbs(10mm，ph7.4)稀釋。
將實(shí)施例5或?qū)嵤├?制備的親和層析柱用5mlpbs(10mm，ph7.4)洗滌，加入10ml樣品提取稀釋液，10ml純水淋洗，用1ml甲醇洗脫，收集洗脫液用高效液相色譜檢測(cè)afb1或afg1的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示制備的親和柱對(duì)afb1或afg1的平均回收率分別為85～101％，80～97％。重復(fù)使用10次后，親和柱對(duì)afb1或afg1的平均回收率>80％。
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<110>南昌大學(xué)
<120>基于特異識(shí)別afb1納米抗體的親和吸附材料
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