專利名稱：：一種固定鈦離子親和色譜材料及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及磷酸肽的分離和富集，具體地說是一種固定鈦離子親和色譜材料及其制備和在磷酸化肽富集中的應(yīng)用，本發(fā)明應(yīng)用鈦離子與磷酸基團之間的強相互作用將鈦離子固定在磷酸改性的固相載體上形成固定鈦離子親和色譜材料。磷酸肽由于磷酸基團與固定的鈦離子之間的強相互作用而保留在固定鈦離子親和色譜材料，從而實現(xiàn)特異性地從復(fù)雜的蛋白酶解液中分離和富集磷酸肽。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)進入了功能基因組時代。人類基因組中大約有2%的基因編碼500多個蛋白激酶和100多個磷酸酯酶，對應(yīng)蛋白的磷酸化和去磷酸化。蛋白磷酸化是最常見、最重要的一種翻譯后修飾，在真核生物中，蛋白質(zhì)磷酸化是非常重要和普遍的現(xiàn)象，蛋白質(zhì)可逆磷酸化將胞外信息傳遞到核內(nèi)，因此在細胞生長、分裂、分化、代謝、癌癥的產(chǎn)生等生命活動過程中起著關(guān)鍵得作用；對眾多蛋白質(zhì)生物化學(xué)功能擔(dān)負開/關(guān)調(diào)控責(zé)任，是一種普遍的調(diào)控機制。據(jù)統(tǒng)計，在任一給定時刻，細胞內(nèi)約有三分之一的蛋白質(zhì)存在磷酸化形式(文獻l.Mann,M.;Jensen,0.N.,Proteomicanalysisofpost隱translationalmodifications,淑腸fec/mo/2003，21,(3),255-61.文獻2.M丄oyee,K.;T.Stults,J.;Amott,D.,MassSpectrometricContritutionstothePracticeofPhosphorylationSiteMappingthrough2003.Mo/.Ce〃.Profeow/cs2005，4,235-245.)。蛋白磷酸化修飾位點的鑒定是目前蛋白組學(xué)研究中的研究熱點和難點。最近，質(zhì)譜技術(shù)在蛋白磷酸化的定性中，已經(jīng)發(fā)展成為重要的工具之一(文獻3.Aebersold,R.;Mann,M.,Massspectrometry-basedproteomics.A^mm2003，422,(6928),198-207.)。然而，質(zhì)譜在鑒定磷酸化蛋白現(xiàn)在仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，其具體體現(xiàn)在第一，磷酸化蛋白在細胞內(nèi)中屬于低豐度蛋白；第二，磷酸化肽的負電性使其在質(zhì)譜檢測中難以質(zhì)子化；第三，酶解產(chǎn)物中存在的大量的非磷酸化肽的質(zhì)譜信號通常會抑制磷酸化肽的離子信號。因此，復(fù)雜蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的分離和富集是質(zhì)譜成功鑒定磷酸化最為重要的一步(文獻4.Reinders,J.;Sickmann,A.,State-of-the-artinphosphoproteomics.尸ra化麵b2005，5,(16),4052-61.文獻5.McLachlin,D.T.;Chait,B.T.,Analysisofphosphorylatedproteinsandpeptidesbymassspectrometry.C臟(9—.C/2泄腸/2001，5,(5),591-602.)。從磷酸化蛋白的酶解混合物中分離和富集磷酸化肽是目前進行磷酸化研究的比較理想的方法，也是成功實現(xiàn)質(zhì)譜分析最關(guān)鍵的一步。到目前為止，分離和富集磷酸肽最常用的是固定化金屬離子親和色譜(ImmobilizedMetalA伍nityChromatography,IMAC)。IMAC運用于磷酸肽的分離和富集是基于磷酸化肽上的磷酸基團與固定金屬離子之間的螯合作用。在IMAC技術(shù)中，最為廣泛使用的金屬離子是Fe"(文獻6.Nuhse,T.S.;Stensballe，A.;Jensen,O.N.;Peek,S.C.,Large-scaleanalysisofinvivophosphorylatedmembraneproteinsbyimmobilizedmetalionaffinitychromatographyandmassspectrometry.Mo/.Ce〃./Vo/eom/cs2003，2,(11)，1234-43.文獻7.Moser，K.;White,F.M.,PhosphoproteomicanalysisofratliverbyhighcapacityIMACandLC-MS/MS.乂Prafeo膨m006，5,(1),98-104.)I口Ga3+(文獻8.Posewitz,M.C.;Tempst,P.,Immobilizedgallium(III)affinitychromatographyofphosphopeptides.屈a/.C/e附1999，71,(14),2883-92.)，而廣泛使用的螯合基團主要是亞氨基二乙酸(IDA)(文獻9.Pan,C.;Ye,M.;Liu,Y.;Feng,S.;Jiang,X.;Han,G.;Zhu,J.;Zou,H.，EnrichmentofphosphopeptidesbyFe3+-immobilizedmesoporousnanoparticlesofMCM-41forMALDIand腿o-LC-MS/MSanalysis.乂細te謹(jǐn)e.T^2006，5,(11),3114-24.)禾口次氮基三乙酸(NTA)(文獻10.D醒，J.D.;Watson,J.T.;Bmening,M.L"DetectionofphosphopeptidesusingFe(III)陽nitrilotriacetatecomplexesimmobilizedonaMALDIplate.Jwa/.C77謹(jǐn)2006，78,(5),1574-80.)。IMAC的一個顯著的缺點是，一些帶有酸性氨基酸殘基的肽段同時也會被保留從而干擾磷酸肽的檢測。盡管將酸性谷氨酸和天冬氨酸殘基酸中的酸性偵B連酉旨化(文獻11.Ficarro,S.B.;McCleland,M.Stukenberg,RT.;Burke,D.J.;Ross,M.M.;Shabanowitz,J.;Hunt,D.F.;White,F.M.,PhosphoproteomeanalysisbymassspectrometryanditsapplicationtoSaccharomycescerevisiae.7VW,B/ofec/7"0/2002，20,(3),301-5.)，能減少酸性肽的非特異性吸附，但是通常反應(yīng)并不能完全進行，而且會增加樣品的復(fù)雜程度，從而干擾后續(xù)的質(zhì)譜分析。金屬氧化物(Zr02(文獻12.KweonH.K.;Hakansson,K.,Selectivezirconiumdioxide-basedenrichmentofphosphorylatedpeptidesformassspectrometricanalysis.Jwa/.CTze附2006，78,(6),1743-9.文獻13.Zhou,H.;Tian,R.;Ye,M.;Xu,S.;Feng,S.;Pan,C.;Jiang,X.;Li,X.;Zou,H.,Highlyspecificenrichmentofphosphopeptidesbyzirconiumdioxidenanoparticlesforphosphoproteomeanalysis.￡/e"r—o固.s2007，28,(13),2201-15.),Ti。2(文獻14.Cantin，G.T.;Shock,T.R.;Park,S.K.;Madhani,H.D.;Yates,J.R.,3rd，OptimizingTi02-basedphosphopeptideenrichmentforautomatedmultidimensionalliquidchromatographycoupledtotandemmassspectrometry.J腦/.C/z證2007,79，(12)，4666-73.文獻15.Thingholm,T.E.;Jorgensen,T.J.;Jensen,O.N.;Larsen,M.R.,Highlyselectiveenrichmentofphosphorylatedpeptidesusingtitaniumdioxide.TVat尸rotoc2006，1,(4),1929-35.文獻16.Pocsfalvi，G.;Cuccur函，M.;Schlosser,G;Scacco，S.;Papa,S.;Malomi，A.,PhosphorylationofB14.5asubunitfrombovineheartcomplexIidentifiedbytitaniumdioxideselectiveenrichmentandshotgunproteomics.A/o/.Ce〃.尸roteow/cs2007，6,(2),231-7.))也被應(yīng)用于磷酸肽的分離和富集，并顯示出比一般IMAC對磷酸肽更高的特異性。Zr02、Ti02等金屬氧化物之所以能富集磷酸肽，是由于其中的鋯、鈦等離子與磷酸肽中的磷酸基團有很強的相互作用。雖然Zr02、Ti02等金屬氧化物對磷酸肽有較好的富集作用，但是由于空間位阻的原因，有些磷酸肽可能不容易被富集。而如果Ti"或者Zr"離子固定于色譜材料上，則由于存在間隔臂而使空間位阻減小，進而提高磷酸肽的富集效果。最近發(fā)展出了固定鋯離子的新IMAC方法(Zr4+-IMAC)(文獻17.Zhou,H.;Xu,S.;Ye，M.;Feng,S.;Pan,C.;Jiang,X.;Li，X.;Han,G.;Fu,Y.;Zou,H.,Zirconiumphosphonate-modifiedporoussiliconforhighlyspecificcaptureofphosphopeptidesandMALDI-TOFMSanalysis.,/Vo/eo附e.ies2006，5,(9),2431-7.文獻18.Feng,S.;Ye,M.;Zhou,H.;Jiang,X.;Jiang,X.;Zou,H.;Gong,B.,Immobilizedzirconiumionaffinitychromatographyforspecificenrichmentofphosphopeptidesinphosphoproteomeanalysis.Mo/.Ce〃.Prafeom/"2007，6,(9),1656-65.)，與常規(guī)IMAC相比，該方法對磷酸肽顯示出更好的特異性和選擇性。本發(fā)明提出制備固定鈦離子親和色譜(Ti4+-IMAC)材料的方法以及利用Ti4+-IMAC富集磷酸肽的方法。固定鈦離子親和色譜材料的制備和應(yīng)用，在此前都未見文獻報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種固定鈦離子親和色譜材料及其制備和應(yīng)用，固定鈦離子的親和色譜材料顯示出對磷酸肽高的特異性和選擇性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)蝗采用的技術(shù)方案為一種固定鈦離子親和色譜材料(Ti"-IMAC)，可按如下過程制備獲得，將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過磷酸配體固定在載體上，獲得固定鈦離子親和色譜材料(T產(chǎn)-IMAC)。所述含有磷酸基團的固相載體，磷酸基團與固相載體間為共價鍵合；其結(jié)構(gòu)如下，固定鈦離子親和色譜材料的制備方法將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過磷酸配體固定在載體上，獲得固定鈦離子親和色譜材料7^4+-1^1八。圖la.給出了固定鈦離子的示意圖。將磷酸改性的固相載體置于含鈦離子的溶液中攪拌或接觸一段時間，鈦離子通過與磷酸基團的強螯合作用而固定于色譜材料形成固定鈦離子親和色譜材料。所述鈦離子溶液可為硫酸鈦溶液；所述親和色譜材料可通過對現(xiàn)有的固相載體進行化學(xué)衍生，于其表面化學(xué)健合磷酸基團制備獲得；所述固相載體為常規(guī)色譜載體中的硅膠顆粒、有機聚合物小球或瓊脂糖顆粒，或者是整體柱材料、納米材料、介孔材料(如易于改性的介孔MCM-41)、磁珠、芯片材料或其它顆粒狀載體等固相載體?；瘜W(xué)衍生的過程是通過對固相載體表面改性后的氨基化，磷?；磻?yīng)得到含有磷酸基團的固相載體材料；也可以是其他如磷酯化反應(yīng)，或者可以衍生得到磷酸基團的反應(yīng)均可以使用。所述親和色譜材料可通過將含有磷酸基團的功能單體參與聚合形成的聚合物；所述聚合可為本體聚合、懸浮聚合、乳液聚合或溶液聚合等其他聚合反應(yīng)均可以使用；功能單體可為2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯或其他可以提供磷酸基團的單體均可以使用；所使用的交聯(lián)劑為亞甲基雙丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、二乙烯基苯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N，-二亞甲基二丙烯酰胺等。本發(fā)明提出的磷酸肽的富集方法，以固定鈦離子的親和色譜Ti4+-IMAC為分離材料分離和富集磷酸肽，磷酸肽由于(其上帶有的磷酸基團)與固定的鈦離子之間的強螯合作用而保留在固定鈦離子親和色譜材料上，從而實現(xiàn)特異性地從復(fù)雜的蛋白酶解液中分離和富集磷酸肽的目的。圖lb.給出了磷酸肽富集的示意圖，磷酸肽中的磷酸基團由于與固定的鈦離子之間的強螯合作用而獲得保留，而非磷酸肽則由于沒有磷酸基團而沒有保留，從而使磷酸肽從含大量非磷酸肽的肽的混合物中獲得分離。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:固定鈦離子的親和色譜材料顯示出對磷酸肽高的特異性和選擇性。同時，固定鈦離子的親和色譜材料顯示出對單磷酸化肽和多磷酸化肽的平等的富集能力。相對于金屬氧化1102和Zr02對磷酸化肽的富集，固定鈦離子親和色譜材料顯示出更高的特異性。圖1a.為制備固定鈦離子親和色譜材料的示意圖，圖1b.為利用固定鈦離子的親和色譜材料用于分離和富集磷酸肽的示意圖；圖2.固定鈦離子的聚合物親和材料對磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表1。圖3.固定鈦離子的聚合物親和材料對磷酸化蛋白(3-酪蛋白，卵清蛋白和標(biāo)準(zhǔn)的酪氨酸混合物中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表1。圖4.固定鈦離子的聚合物親和材料對半復(fù)雜樣品中磷酸化蛋白oc-酪蛋白和非磷酸化蛋白牛血清白蛋白(BSA)酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。(a)直接分析oc-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖5固定鈦離子的無機MCM-41材料對磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表l。圖6.固定鈦離子的無機MCM-41材料對磷酸化蛋白P-酪蛋白和標(biāo)準(zhǔn)的酪氨酸磷酸化肽混合物中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表1。圖7.固定鋯離子的聚合物親和材料對半復(fù)雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽;(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖8.基于GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC對半復(fù)雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物;(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽;(c〕a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖9.Fe3+-IMAC對半復(fù)雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,1:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白oc-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的ot-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(cja-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖10.Ti02對半復(fù)雜樣品中磷酸化蛋白oc-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,1:500)中的分離和富集得到的磷酸肽的MALDI質(zhì)譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(cja-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖11.Zr02對半復(fù)雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸肽的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽;(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。具體實施方式本發(fā)明固定鈦離子親和色譜(Ti4+-IMAC)材料，是利用金屬鈦離子與磷酸基團之間的強螯合作用將鈦離子固載在磷酸基團改性的固相載體上。所述的含鈦離子的溶液可以是硫酸鈦axso4:b:)溶液也可以是其它任何含鈦離子的溶液。將磷酸基團改性的固相載體置于含鈦離子的溶液中靜置或攪拌一段時間二鈦離子就被固定于載體表面形成固定鈦離子親和色譜材料，如圖l(a)所示。所述的磷酸基團改性的固相載體是指在表面帶有磷酸基團的固相載體。這種磷酸基團改性的固相載體主要可以通過兩種方法制備獲得一)通過對固相載體進行化學(xué)衍生接上磷酸基團。這里的固相載體可以是硅膠、聚合物小球、瓊脂糖顆粒等常規(guī)色譜載體，也可以是整體柱材料、納米材料、介孔材料、磁珠、芯片材料、其它顆粒狀載體等固相載體。利用這些固相載體表面的活性基團，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)將磷酸基團固定于固相載體。本發(fā)明以MCM-41介孔分子篩為例來說明通過化學(xué)衍生來制備磷酸基團改性的固相載體的方法，但本發(fā)明并不局限于介孔分子篩，其它任何可以被衍生為磷酸基團改性的固相載體均可以使用。二)直接通過含磷酸基團的單體經(jīng)聚合后形成帶磷酸基團的聚合物固相載體。本發(fā)明以2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯單體與亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑聚合反應(yīng)為例來說明帶磷酸基團的聚合物固相載體的制備。但含有磷酸基團的單體不局限于本發(fā)明中的2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯，其他可以提供磷酸基團和可供聚合的單體也可以使用。聚合材料中所使用的交聯(lián)劑并不局限于本發(fā)明中提供的亞甲基雙丙烯酰胺，其他的交聯(lián)劑如二甲基丙烯酸乙二醇酯，三丙烯酸季戊四醇酯，二乙烯基苯，三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯，N,N'-二亞甲基二丙烯酰胺等也可以使用。本發(fā)明提出的使用固定鈦離子親和色譜材料分離和富集磷酸肽。利用固定鈦離子親和色譜材料分離和富集磷酸肽的過程主要可以分為上樣、淋洗、洗脫三步含磷酸肽的肽混合物首先上樣到固定鈦離子親和色譜材料，磷酸肽由于與固定的鈦離子之間的強相互作用而被保留；上樣后，通過淋洗將不保留或以非特異性保留的非磷酸肽去除，最后將特異性保留的磷酸肽洗脫。肽的混合物一般用甲酸、三氟乙酸、乙酸等酸酸化后上樣；為了消除非磷酸肽與色譜材料之間由于疏水相互作用和靜電相互作用而引起的非特異性吸附，使用的淋洗溶液一般需要含有一定濃度的有機溶劑和有較強的離子強度，如使用200mMNaCl/50%乙腈(ACN)/6。/。三氟乙酸(TFA)的水溶液沖洗。洗脫磷酸肽一般需要在堿性條件下進行，如10%氨水。在固定鈦離子親合色譜材料的使用方式上，可以將其填充為色譜柱以色譜分離模式來富集磷酸肽，也可以通過填充在Tip頭里而使用，還可以直接使用，通過離心等其它方法將固定鈦離子親和色譜材料與溶液分離。以下以一種聚合物和一種介孔分子篩材料為固相載體來說明固定鈦離子親和色譜材料的制備，但本發(fā)明并不局限于這兩種材料。以下以上述制備的兩種固定鈦離子親和色譜材料為例說明利用固定鈦離子親和色譜材料分離和富集磷酸肽的方法，但本發(fā)明并不局限于這兩種材料。以下實施例中，如果沒有特殊說明，溶液的百分比濃度均為體積1:匕。實施例l.固定鈦離子的聚合物親和材料的制備通過利用帶磷酸基團的單體與交聯(lián)劑聚合反應(yīng)生成帶有磷酸基團的聚合物，該聚合物然后與鈦離子溶液反應(yīng)得到固定鈦離子的聚合物親和材料，進一步應(yīng)用于富集和純化磷酸肽。為了制備帶磷酸基團的聚合物材料，首先需要配制聚合物反應(yīng)液。單體和交聯(lián)劑是反應(yīng)液的主要成份，它們發(fā)生聚合反應(yīng)后形成聚合物骨架。為了調(diào)節(jié)聚合物的物理化學(xué)性質(zhì)，可以使用多種單體，但其中必須包括一種帶有磷酸基團的單體。多孔材料有更大的表面積，因此有更高的吸附容量。為了制備多孔的聚合物，需要在反應(yīng)液中加入一定比例的致孔劑，致孔劑是一些有機溶劑，它們不參與聚合反應(yīng)，在聚合反應(yīng)發(fā)生后它們所占據(jù)的空間將形成孔。通過調(diào)節(jié)致孔劑在反應(yīng)液中的比例可以很方便的調(diào)節(jié)聚合物中孔的大小和機械強度。此外，一般還需要加入少量的引發(fā)劑來引發(fā)聚合反應(yīng)。帶磷酸基團的聚合物制備得到后，與鈦離子溶液反應(yīng)得到固定鈦離子的聚合物親和材料。本例采用單體2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯與交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺聚合反應(yīng)生成的帶磷酸基團的聚合物。該聚合物具有很好的親水性，因此非特異性很小，是親和色譜良好的載體。聚合物擁有極強的耐酸堿性，耐壓和耐熱性和良好的親水性,以至能夠完全滿足于磷酸化肽離和富集所需要的強酸上樣，強堿洗脫的嚴(yán)格的基質(zhì)條件。聚合物然后與鈦離子(如Ti(S04)2)溶液)反應(yīng)，鈦離子與聚合物上的磷酸基團有強離子和配位相互作用而固定在聚合物材料上，得到固定化鈦離子的親和聚合物材料，因而具有簡單、方便的特點(如圖la所示)。通過固定的鈦離子與磷酸肽中的磷酸基團的強的相互作用來實現(xiàn)特異性的分離和富集磷酸肽。固定在聚合物材料上一的鈦離子可以用于從復(fù)雜的蛋白質(zhì)酶解液中分離和富集磷酸肽(如圖lb所示)。(1)帶磷酸基團聚合物親和材料的制備以2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯為功能單體，亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，十二醇(400^L)，二甲基亞砜(540pL)和N,N-二甲基甲酰胺(100pL)為致孔劑，單體、交聯(lián)劑、致孔劑按質(zhì)量百分比分別為13%、10%和77%均勻混合置于20mL的離心管中，接著加入為功能單體質(zhì)量用量的1%的引發(fā)劑偶氮二異丁氰，然后將混合液超聲振蕩20min后，再通入N2脫氧10min，將離心管密塞并浸于60°C水浴中反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，研磨成均一性的微米級顆粒后，用甲醇浸泡除去致孔劑、殘留反應(yīng)試劑以及反應(yīng)產(chǎn)生的一些低聚合度物質(zhì)，離心濾去甲醇，得到的聚合物材料然后置于真空干燥箱中干燥后備用。(2)固定鈦離子的聚合物親和材料的制備稱取10mg的聚合物材料，與10mL，100mM的Ti(S04)2溶液室溫下攪拌過夜得到固定鈦離子的親和聚合物材料。得到的固定鈦離子的親和聚合物材料用二次蒸餾水清洗，除去殘留的Ti(S04)2溶液和雜質(zhì)，將清洗過的聚合物顆粒重新分散于體積濃度30%ACN/0.1%TFA溶液中備用。利用制備的固定鈦離子聚合物親合材料的分離和富集磷酸肽見實施例3-1。實施例2.固定鈦離子的無機親和材料的制備MCM-41是一種利用水熱分子自組織方法，即利用一定濃度的有機導(dǎo)向(表面活性劑)與無機物種(單體或者齊聚物)相互作用形成的六方相液晶織態(tài)結(jié)構(gòu)的無機介孔硅材料。當(dāng)通過熱處理或化學(xué)手段除去有機導(dǎo)向劑后，所得到的固體稱為MCM-41介孔分子篩。MCM-41介孔分子篩呈現(xiàn)多層次有序結(jié)構(gòu)，可以在多個尺度(例如納米級，微米級或宏觀尺度)層次上具有特定有序結(jié)構(gòu)或形貌。納米量級上，MCM-41呈有序的"蜂巢狀"多孔結(jié)構(gòu)，即有-一維線性孔道或呈六方密堆的陣列，其孔徑可以在1.5-30nm范圍內(nèi)調(diào)解，最典型的孔徑約為4nm，且具有很高的比表面積(通?？蛇_1200m2/g)。MCM-41分子篩的優(yōu)越性在于它具有均一且可調(diào)控的中孔孔徑，穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)，具有一定壁厚且易于摻雜的無定型骨架組成和比表面積大且可修飾的內(nèi)表面。MCM-41的應(yīng)用主要是以MCM-41中孔分子篩及其改性產(chǎn)物為主。MCM-41中孔分子篩本身可用作催化劑，吸附劑或催化劑載體等。但是改性MCM-41以滿足不同的需要仍然是MCM-41的一個研究熱點。本例中，無機MCM-41材料通過水熱晶化法合成得到，得到的MCM-41材料按照前面的方法(文獻17)，依次通過酸化引入硅羥基，進一步通過硅烷化反應(yīng)引入氨基，最后通過磷?；磻?yīng)，將內(nèi)壁引入磷酸基團。含有磷酸基團的無機MCM-41材料與鈦離子反應(yīng)，鈦離子通過與磷酸基團的強烈的離子和配位相互作用，得到固定鈦離子的無機MCM-41材料。通過固定的鈦離子與磷酸肽中的磷酸基團的強烈的相互作用來實現(xiàn)特異性的分離和富集磷酸肽。固定在無機MCM-41材料的鈦離子可以用于從復(fù)雜的蛋白質(zhì)酶解液中分離和富集磷酸肽(如圖lb所示)。(1)帶磷酸基團的無機MCM-41材料的制備制備無機MCM-41材料合成無機MCM-41材料按照前面的描述的方法(文獻9)。簡之，取2g的十六烷基三甲基溴化銨溶解到205mL的氨水(質(zhì)量濃度為25%)和270mL的二次蒸餾水中，加熱攪拌均勻后立即加入10mL的四乙氧基硅烷，反應(yīng)兩個小時后，然后將產(chǎn)物過濾，并用二次蒸餾水洗滌，然后置于真空干燥箱中干燥。將干燥后的產(chǎn)物加入到450mL的乙醇和6mL的鹽酸中，在室溫下攪拌6h，然后過濾，將得到的產(chǎn)物分別用無水乙醇和水清洗，產(chǎn)品在120。C下真空干燥，得到無機的MCM-41材料。無機材料MCM-41的活化取1.0gMCM-41分散于20mL、6M鹽酸中，輕微攪拌5h。抽濾，濾餅用二次蒸餾水洗滌多次，直到溶液顯中性，再用無水乙醇淋洗一遍，產(chǎn)品在12(TC下真空干燥。無機材料MCM-41的氨基化取0.5g的活化后的MCM-41放入三頸瓶中，抽真空，在Ar氣保護下，加入25mL重蒸過的無水甲苯，再加入1.5mL3-氨丙基甲氧基硅垸，先常溫攪拌5h，再升溫至ll(TC回流16h。抽濾，濾餅用甲苯洗滌多次，再用乙醇沖洗，在11(TC下真空干燥。磷酸基團衍生的無機MCM-41材料取0.2g的氨基化的MCM-41分散于15mL的無水甲苯中，再加入0.5mL無水吡啶，0.5mL重蒸過的三氯氧磷，室溫下攪拌18h。抽濾，濾餅先用甲苯清洗，再用二次蒸餾水清洗，最后置于三乙胺水溶液中浸泡20min,用二次蒸餾水清洗，再用乙醇清洗，在6(TC下真空干燥。(2)固定鈦離子的無機MCM-41材料的制備稱取10mg的磷酸酯衍生的無機MCM-41材料，與10mL，100mM的Ti(S04)2溶液室溫下攪拌過夜得到固定的鈦離子的MCM-41材料。得到的固定的T產(chǎn)的MCM-41材料用二次蒸餾水清洗，除去殘留的Ti(S04)2溶液和雜質(zhì)，將清洗過的MCM-41重新分散于30%ACN/0.1%TFA溶液中備用。利用制備的固定鈦離子無機MCM-41親和材料分離富集磷酸肽見實施例3-2。實施例3.固定鈦離子親和色譜材料用于磷酸肽的選擇性富集樣品溶液的制備lmg的ot-酪蛋白和l3-酪蛋白的分別溶解在lmL的50mM的碳酸氫銨溶液中(pH8.2)，按照與胰蛋白酶的質(zhì)量比40:1的比例加入胰蛋白酶進行酶解反應(yīng)，反應(yīng)時間為16h,酶解溫度控制在37。C。獲得的蛋白酶解溶液置于-3(TC冰箱中保存?zhèn)溆谩?.6mg的牛血清白蛋白和4.5mg的卵清蛋白分別溶解在lmL的還原性溶液中(pH8.2,8M尿素，50mM的碳酸氫銨溶液)，室溫下放置4h,然后向每管溶液中分別加入25pL，1M的DTT溶液，37。C下還原2h，再向每管溶液中加入50pL，1M的IAA溶液，室溫下暗處靜置30min，再用50mM的碳酸氫銨溶液稀釋十倍，再以胰蛋白酶和蛋白的比例按照l:40(w/w)加入，在37。C水浴下酶解16h。獲得的卵清蛋白酶解液置于-30'C冰箱中保存?zhèn)溆?。獲得的牛血清白蛋白溶液分裝凍干后置于-3(TC冰箱中保存?zhèn)溆?。實施?-1固定鈦離子的聚合物親和材料用于磷酸肽的富集(1).樣品1:(X-酪蛋白酶解液1的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pL")溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5pL固定的T產(chǎn)的聚合物親和材料(10mg.mU1)室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30的200mMNaCl/80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10pL，10%NH3.H20(質(zhì)量濃度)洗脫結(jié)合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干。富集的磷酸肽用2含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質(zhì)溶液重新溶解，然后取0.5點靶，用MALDI-TOFMS分析。所有的MALDI-TOF質(zhì)譜分析在布魯克Autoflex飛行時間質(zhì)譜儀上(Bruker,Bremen,Germany)完成，質(zhì)譜儀上裝有延時離子萃取裝置，脈沖激光的波長為337nm。實驗中得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)都在線性正離子檢測模式中進行。質(zhì)譜分子量的校正采用外標(biāo)法.，從標(biāo)準(zhǔn)物血管緊縮素II和胰島素鏈B的離子信號對質(zhì)譜校正。實驗中，每個質(zhì)譜是30個激光點的累加。分析結(jié)果由圖2可以看出來自a-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽能夠特異性的被固定鈦離子的聚合物親和材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質(zhì)譜檢測。(2).樣品2:標(biāo)準(zhǔn)磷酸化P-酪蛋白，卵清蛋白的酶解液和標(biāo)準(zhǔn)的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽1的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化P-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和標(biāo)準(zhǔn)的模型酪氨酸磷酸化肽(RRLIEDAEpYAARG,MW1599.00)的混合肽(1pmol.^iL—"溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5fiL固定鈦離子的聚合物親和材料(10mg.mL—1)室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H2O洗脫結(jié)合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL—"的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果由圖3可以看出來自P-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和標(biāo)準(zhǔn)的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽的7個磷酸化肽能夠特異性的被固定鈦離子的聚合物親和材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質(zhì)譜檢測。同時，酪氨酸磷酸化肽同樣能被有效的富集。因此，卵清蛋白酶解過程中引入的DTT,IAA，尿素以及酶解液中的糖基化肽段都不會干擾磷酸化肽的分離和富集。(3)樣品3:半復(fù)雜樣品的酶解混合物1^L的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.(aL")分別與1|iL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^L")混合得到半復(fù)雜的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5固定化Ti"的聚合物親和材料(10mg.mL—"室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30jiL的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10jiL，10%NH3.H2O洗脫結(jié)合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2iiL含P/。H3P04的DHB(25mg.mL")的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5點耙，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果由圖4可以看出，磷酸肽在高豐度的非磷酸化肽的背景干擾下C非磷酸化蛋白酶解液的干擾比例高達100倍和500倍)，圖4(a)可以看出，當(dāng)BSA酶解液與a-酪蛋白酶解液比例在100:1時，大量的非磷酸化肽的峰主導(dǎo)MALDI質(zhì)譜圖。圖4(c)和(d)可以看出，非磷酸化蛋白酶解液干擾比例在100倍和500倍的情況下，磷酸化肽仍然能被固定鈦離子的聚合物親和材料特異性的分離和富集，而得到的MALDI質(zhì)譜圖，13個磷酸肽的質(zhì)譜峰清晰可見，而非磷酸肽沒有任何保留，所獲得的磷酸肽與直接富集單獨的(x-酪蛋白酶解液(圖4(a))中的磷酸肽的質(zhì)譜圖很好的匹配。實施例3-2固定鈦離子的無機MCM-41材料用于磷酸肽的富集(1).樣品Ol-酪蛋白酶解液1JliL的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化(x-酪蛋白酶解液(1pmol.)iL")溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5(iL固定化鈦離子的MCM-41(10mg.mL")室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30的80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H2O洗脫結(jié)合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2pL含l。/。H3P04的DHB(25mg.mL")的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果由圖5可以看出來自(x-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽能夠特異性的被固定鈦離子的無機MCM-41材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質(zhì)譜檢測。(2).樣品2:標(biāo)準(zhǔn)磷酸化P-酪蛋白的酶解液和標(biāo)準(zhǔn)的模型酪氨酸磷酸化肽的肽混合物1的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化卩-酪蛋白和標(biāo)準(zhǔn)的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽(lpmol.^L—J)溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5固定化鈦離子的MCM-41(10mg.mL—1)室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30pL的80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H20洗脫結(jié)合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2)iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果由圖6可以看出來自(3-酪蛋白和標(biāo)準(zhǔn)的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽的5個磷酸肽能夠特異性的被固定鈦離子的無機MCM-41材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質(zhì)譜檢測。同時，酪氨酸磷酸化肽同樣能被有效的富集。比較例1.與固定鋯離子親和色譜應(yīng)用于分離和富集磷酸肽的比較比較例1-1聚合物親和材料作為基質(zhì)(1)固定鋯離子聚合物親和材料固定鋯離子的聚合物材料與實施例3.1中的帶磷酸基團材料完全一樣。稱取10mg的聚合物材料，與10mL，100mM的ZrOCl2溶液室溫下攪拌過夜得到固定鋯離子的親和聚合物材料。得到的固定鋯離子的親和聚合物材料用二次蒸餾水清洗，除去殘留的ZrOCl2溶液和雜質(zhì)，將清洗過的聚合物顆粒重新分散于30%ACN/0.1%TFA溶液中備用。(2)固定鋯離子聚合物親和材料應(yīng)用于半復(fù)雜樣品分離和富集磷酸化肽1pL的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pL")分別與1pL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol^L")混合得到半復(fù)雜的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5|iL固定鋯離子的聚合物親和材料(10mg.mL")室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10|aL，10%NH3.H20洗脫結(jié)合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果圖7(a)是直接分析(x-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質(zhì)譜圖，可以看出，大量的非磷酸肽主導(dǎo)MALDI質(zhì)譜圖。圖7(b)顯示了來自于oc-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽的MALDI質(zhì)譜圖。圖7(c)和(d)可以看出，非磷酸化蛋白酶解液干擾比例在100倍時，來自于(x-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽能被固定鋯離子的聚合物親和材料特異性的分離和富集，當(dāng)干擾物比例在500倍時得到的MALDI質(zhì)譜圖，12個磷酸肽的質(zhì)譜峰清晰可見，非磷酸肽沒有任何保留。盡管Zr"-IMAC對磷酸肽同樣顯示出高的特異性。然而，Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC顯示出對不同磷酸肽的偏愛。從圖4c和4d可以看出，單磷酸化肽(a6,YKVPQLEIVPNpSAEER)在所有的磷酸肽的峰里面，顯示出最強的質(zhì)譜信號。從圖7c和7d可以看出，二磷酸化肽(a7,DIGpSEpSTEDQAMEDIK)顯示出最強的質(zhì)譜信號。因此，Ti"-IMAC顯示出對單磷酸化肽更強的富集能力，而Zr4+-IMAC顯示出對多磷酸化肽更強的富集能力。比較例1-2GMA-EDMA微球作為基質(zhì)(1)基于GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC的制備本比較例中使用的GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC為前面非專利文獻18作者所提供。詳細的制備方法見文獻18。(2)基于GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC應(yīng)用于半復(fù)雜樣品中分離和富集磷酸化肽1|iL的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.^L—"分別與1(iL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^iL")混合得到半復(fù)雜的酶解液，再分別與10Zr4+-IMAC(10mg.mU1分散在100%ACN溶液)混合，再加入10%HAC溶液至總體積為100jiL室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用100|iL的200mMNaCl/10%HAC;10%HAC的溶液振蕩淋洗10min，最后加入10(iL，10%NH3.H2O洗脫結(jié)合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.ml/')的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果圖8(a)是直接分析ot-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質(zhì)譜圖，可以看出，大量的非磷酸化肽主導(dǎo)MALDI質(zhì)譜圖。圖8何顯示了來自于cx-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽的MALDI質(zhì)譜圖。圖S(c)是非磷酸化蛋白酶解液干擾比例在100倍時，來自于ot-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽能被Zr"-IMAC特異性的分離和富集，當(dāng)千擾物比例在500倍時得到的MALDI質(zhì)譜圖(圖8(d),10個磷酸化肽的質(zhì)譜峰清晰可見，非磷酸化肽沒有任何保留，而且磷酸化肽的峰強度明顯弱于相同量的ot-酪蛋白酶解液分離和富集得到的磷酸化肽的峰。盡管基于GMA-EDMA的Zr4+-IMAC對磷酸肽同樣顯示出高的特異性，由于化學(xué)反應(yīng)的不完全性以至得到的磷酸基團的數(shù)量有限，因此，基于GMA-EDMA的Zr4+-IMAC的表面含有相對少的活性磷酸基團而導(dǎo)致更少的磷酸肽的結(jié)合位點。圖8c和8d可以看出，磷酸肽的質(zhì)譜信號幾乎比用T嚴(yán)-IMAC富集方法得到的質(zhì)譜信號(圖4c和4d)兒乎要低一倍。從圖8c-d和圖4c-d的比較可以看出，與聚合物基質(zhì)相同的是基于GMA-EDMA的Zr4+-IMAC顯示出多磷酸化肽的更強的富集能力，Ti4+-IMAC顯示出對單磷酸化肽更強的富集能力。比較例2.與固定化金屬離子(F^+)親和色譜應(yīng)用于分離和富集磷酸肽的比較(1)固定化金屬離子(F^+)親和色譜的活化Fe3+-IMAC(Porous20MCbeads)活化按照推薦的方法活化。稱取10mg的粒子，先分別用50mMEDTA，1MNaCl清洗兩遍，接著用二次蒸餾水清洗三遍，然后將清洗過的粒子分散于100mMFeCl3溶液中培育30min,此步重復(fù)三次。螯合Fe3+-IMAC粒子然后依次用0.1%HAC,500mMNaCl，ddH20清洗，最后分散于1mL二次蒸餾水中備用。(2)固定化金屬離子(F^+)親和色譜從半復(fù)雜樣品中分離和富集磷酸化肽一分別取10的活化過的Fe3+-IMAC用上樣緩沖液50%ACN,0.1%TFA活化30min,然后離心除去溶液，余下的Fe3+-IMAC粒子分別與半復(fù)雜的酶解液(組成為1的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pi;1)分別與1^L，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^iL")混合溶解在50。/。ACN/0.1。/。TFA溶液中)室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用100|iL的50%ACN/0.1%TFA;75%ACN/10%CH3OH/10%HAC;100|iL的10%HAC的溶液振蕩淋洗10min，最后加入用10|aL，10%NH3.H2O洗脫結(jié)合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2pL含l%H3POj9DHB(25mg.mL—^的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5點耙，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果圖9(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質(zhì)譜圖，可以看出，大量的非磷酸化肽主導(dǎo)MALDI質(zhì)譜圖。圖9(b)顯示了來自于a-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽的MALDI質(zhì)譜圖。圖9(c)和圖9(d)是非磷酸化蛋白酶解液干擾比例在100倍和500倍時，僅僅有來自于a-酪蛋白酶解液中的5個多磷酸肽能被Fe3+-IMAC特異性的分離和富集，同時伴隨有大量的非磷酸肽被保留。因此，F(xiàn)e3+-IMAC相比與Ti4+-IMAC禾t]Zr4+-IMAC，顯示出更差的特異性。比較例3.與二氧化鈦(Ti02)應(yīng)用于半復(fù)雜樣品中分離和富集磷酸化肽的比較1|iL的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmoLpL")分別與1pL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.pL")混合得到半復(fù)雜的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5pLTi02(GLsciencesInc.Tokyo,Japan)(10mg.mL-1分散在30%ACN/0.1%TFA溶液中)室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10pL，10%NH3.H2O洗脫結(jié)合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2iiL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5(iL點耙，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果圖lO(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質(zhì)譜圖，可以看出，大量的非磷酸肽主導(dǎo)MALDI質(zhì)譜圖。圖lO(b)顯示了來自于a-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽的MALDI質(zhì)譜圖。圖10(c)是非磷酸化蛋白酶解液干擾比例在100倍時，來自于CC-酪蛋白酶解液中的7個磷酸肽能被Z/+-IMAC特異性的分離和富集，當(dāng)干擾物比例在500倍時得到的MALDI質(zhì)譜圖(圖10(d)，4個磷酸肽的質(zhì)譜峰清晰可見，非磷酸化肽沒有任何保留，而且磷酸肽的峰強度明顯弱于相同量的a-酪蛋白酶解液分離和富集得到的磷酸肽的峰。因此，Ti02用于半復(fù)雜樣品中磷酸肽的分離和富集，其特異性和容量明顯低于Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC。比較例4.與二氧化鋯(ZK)2)應(yīng)用于半復(fù)雜樣品中分離和富集磷酸化肽的比較Zr02的制備和用于分離和富集磷酸化肽按照非專利文獻13的方法。1pL的標(biāo)準(zhǔn)磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.^iL力分別與1^L，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.pL")混合得到半復(fù)雜的肽段混合物溶解在50%ACN/10%HAC溶液中與5[xLZr02粒子(10mg.mL-1分散在50%ACN/10%HAC溶液中)室溫下振蕩培育30min,然后依次分別用30pL的50%ACN/10%HAC;50%ACN的溶液振蕩淋洗10min，再用10jiL，10%NH3.H2O洗脫結(jié)合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍干燥機中凍干，加入2jiL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質(zhì)溶液，重新分散純化的磷酸肽，然后取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結(jié)果圖ll(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質(zhì)譜圖，可以看出，大量的非磷酸化肽主導(dǎo)MALDI質(zhì)譜圖。圖ll(b)顯示了來自于(x-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽的MALDI質(zhì)譜圖。圖11(c)是非磷酸化蛋白酶解液干擾比例在100倍時，來自于ct-酪蛋白酶解液中的8個磷酸肽能被Zr4+-IMAC特異性的分離和富集，當(dāng)干擾物比例在500倍時得到的MALDI質(zhì)譜圖(圖ll(d))，2個單磷酸化肽的質(zhì)譜峰清晰可見，伴隨著少量的非磷酸肽被保留。因此，Zr02用于半復(fù)雜樣品中磷酸肽的分離和富集，其特異性和容量明顯低于Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC。表1.固定鈦離子聚合物親和材料從模型磷酸化a-酪蛋白|3-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和標(biāo)準(zhǔn)的模型酪氨酸磷酸化肽分離和富集所得到的磷酸肽的分子量，序列和磷酸化位點<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>磷酸化肽SEQUENCELISTING<110>中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所<120>—種固定鈦離子親和色譜材料及其制備和應(yīng)用〈130>〈160〉20<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>10〈212〉PRT<213>artificial<220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(I)..(IO)<223〉〈400〉1ThrValAspMetGluSerThrGluValPhe1510<210>2〈211〉12〈212>PRT<213>artificial<220>〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(12)<223><400>2ThrValAspMetGluSerThrGluValPheThi'Lys1510磷酸化肽〈210〉3<211〉12<212〉PRT<213>artificial〈220><221>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(12)<223><400>3GluGlnLeuSerThrSerGluGluAsnSerLysLys1510<210〉4<211>14<212〉PRT<213〉artificial<220〉〈221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(14)<223>〈400〉4ValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg1510〈210〉5<211〉15<212〉PRT〈213>artificial<220>〈221>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(15)〈223〉<400>5磷酸化肽TyrLeuGlvGluTyrLeulieValProAsnSerAlaGluGluArg1.51015<210>6〈211〉16〈212〉PRT<213〉artificial〈220〉〈221>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(16)〈223〉<400〉6AsplieGlvSerGluSerThrGluAspGinAlaMetGluAsplieLys151015〈210〉7<211〉16<212>PRT<213>artificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION<222>(1)..(16)<223〉<400>7TyrLvsValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg1.51015〈210〉8〈211>19<212>PRT<213〉artificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(19)〈223〉磷酸化肽〈400〉8LysLysTvrLysValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGlu151015GluArgLeu<210〉9<211〉21<212〉PRT〈213〉artificial〈220〉〈221>PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(21)〈223〉<400〉9AsnThrMetGluHisValSerSerProSerGluGluSerlielieSer151015GinGluThrTvrLys<210〉10〈211〉24<212〉PRT<213〉artificial〈220〉<221〉PHOSPHORYLATION<222>(1)..(24)〈223>〈400〉10GinMetGluAlaGluProSerlieSerSerSerGluGlulieValPro151015AsnProAsnSerValGluGinLys20'〈210〉11<211>26磷酸化肽〈212〉POT〈213〉artificial<220>〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(26)<223〉<400〉11GluLysValAsnGluLeuSerLysAsplieGlvSerGluProSerThr1'51015GluAspGinAlaMetGluAsplieLvsGin202^〈210〉12<211>25<212>PRT<213>artificial<220><221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(25)<223〉〈400>12AsnAlaAsnGluGluGluTyrSerlieGlvSerSerSerGluGluSer151015AlaGluValAlaThrGluGluValL、's20〈210>13〈211>25〈212>PRT<213〉artificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(25)〈223>磷酸化肽〈400>13AsnAlaAsriGluGluGluTvrSerlieGlvSerSerSerGluGluSer151015AlaGluValAlaThrGluGluValLys2025〈210〉14〈211〉15〈212>PRT〈213〉artificial<220>〈221〉PHOSPHORYLATION<222〉(1)..(15)<223〉<400>14PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinLys1510lb<210>15〈211>19<212>PRT〈213〉artificial<220><221>PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(19)<223><400>15lieGluLysPheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeu151015GinAspLys〈210>16〈211〉20〈212〉PRT<213>artificial磷酸化肽〈220><221>PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(20)<223〉<柳〉16PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinAspLvs151015lieHisProPhe20<210〉17<211>25〈212〉PRT〈213〉artificial<220〉〈221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(25)<223><400>17ArgGluLeuGluGluLeuAsnValProGlvGlulieValGluSerLeu151015SerSerSerGluGluSerlieThrArg2025<210>18〈211〉20<212〉PRT<213〉artificial〈220>〈221〉PHOSPHORYLATION〈222>(1).(20)〈223〉〈400〉18GluValValGlySei'AlaGluAlaGlyValAspAlaAlaSerValSer磷酸化肽151015GluGluPheArg20<210>19<211〉26〈212〉PRT<213〉artificial〈220><221〉PHOSPHORYLATION<222〉(1)..(26)<223〉<400〉19PheAspLysLeuProGlyPheGlyAspSerlieGluAlaGinCvsGly1510化'ThrSerValAsnValHisSerSerLeuArg2025〈210>20<211〉13<212>PRT<213>artificial<220><221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(13)<223><400〉20ArgArgLeulieGluAspAlaGluTvrAlaAlaArgGlv1510權(quán)利要求1.一種固定鈦離子親和色譜材料，其特征在于其可按如下過程制備獲得，將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過磷酸配體固載在載體上，獲得固定鈦離子親和色譜材料Ti4+-IMAC。2.按照權(quán)利要求l所述的固定鈦離子親和色譜材料，其特征在于所述含有磷酸基團的固相載體，磷酸基團與固相載體間為共價鍵合;;結(jié)構(gòu)如下，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.—種權(quán)利要求1所述固定鈦離子親和色譜材料的制備方法，其特征在于將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過固載在載體上的磷酸配體，獲得固定鈦離子親和色譜材料T,-IMAC。4.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述鈦離子溶液為硫酸鈦溶液。5.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述親和色譜材料可通過對現(xiàn)有的固相載體進行化學(xué)衍生，于其表面化學(xué)健合磷酸基團制備獲得。6.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述固相載體為常規(guī)色譜載體中的硅膠顆粒、有機聚合物小球或瓊脂糖顆粒，或者是整體柱材料、納米材料、介孔材料、磁珠或芯片材料。7.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述親和色譜材料可通過將含有磷酸基團的功能單體參與聚合形成的聚合物。8.按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述功能單體為2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯；所使用的交聯(lián)劑為亞甲基雙丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、二乙烯基苯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N，-二亞甲基二丙烯酰胺；所述聚合可為本體聚合、懸浮聚合、乳液聚合或溶液聚合。9.一種權(quán)利要求1所述固定鈦離子親和色譜材料的應(yīng)用，其特征在于:以固定鈦離子的親和色譜Ti4+-IMAC為分離材料分離和富集磷酸肽，磷酸肽由于與固定的鈦離子之間的強螯合作用而保留在固定鈦離子親和色譜材料上，從而實現(xiàn)特異性地從復(fù)雜的蛋白酶解液中分離和富集磷酸肽的目的。全文摘要本發(fā)明提供了一種固定鈦離子親和色譜材料及其制備和應(yīng)用，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用而將鈦離子固定于載體上。本發(fā)明使用固定鈦離子親合色譜材料富集磷酸肽，磷酸肽由于與固定的鈦離子之間的強螯合作用而保留在親和色譜材料上使其獲得分離。文檔編號B01J20/286GK101396650SQ20071001296公開日2009年4月1日申請日期2007年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日發(fā)明者葉明亮,周厚江,鄒漢法申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所