專利名稱：一種糖鍵合硅膠固定相及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及色譜固定相，具體的說是一種糖鍵合硅膠固定相及其制備方法；其是采用click chemistry作為鍵合反應方法的鍵合糖固定相。
技術背景反相高效液相色譜(RP-HPLC)是目前使用最為廣泛的高效分離技術。 反相色譜最常用的固定相C18，是當前應用最為廣泛的高效液相色譜固定 相，能在反相色譜模式下分離絕大部分弱極性和中等極性有機化合物。但 是，反相液相色譜主要依靠單一的疏水作用力來實現(xiàn)對化合物的分離，因 此，其對強極性化合物(如寡糖，糖苷，強極性寡肽等)的保留很弱，甚 至不保留。為了對強極性化合物有較好的保留作用而達到分離的目的，使用極性固 定相是一種很好的途徑。親水作用液相色譜模式(HILIC)是近年來發(fā)展起 來的用于分離強極性化合物的色譜技術，類似于正相色譜，使用極性固定 相和極性相對較小的流動相，但與正相色譜不同的是其流動相中含水(水 含量一般小于40%) [Alpert， A. J. C/zra顧togr 1990,柳,177-196]。親水 作用色譜用于分離強極性化合物(如寡糖，寡肽和極性藥物分子等)已有 文獻報道[Strege， M.A. Anal. Chem. 1998， 70， 2439-2445; Strege, M. A. et al, Anal. Chem. 2000, 72, 4629-4633; Wang， X. D. et al， / C/zromatogr. A 2005, 1083, 58—62; Tolstikov, V. V. et al,爿"a/.傷oc/ze肌2002, 301, 298—307; Yoshida, T.細/, C/z環(huán).1997, 69, 3038—3043; Risley, D.S. et al,勘a/. C/ 復 2000， 72， 1736-1739; Dallet, P. et al, J C/zramatogr. 5 2000, 742， 447-452; Olsen, B. A.C/zrawatogr. J 2001, 913， 113-122]。但是，親水作用色譜的固 定相依然是使用正相固定相，主要是直接使用硅膠，氨基，氰基等作為固 定相[Guo, Y. et al, C/2調atogr J, 2005, 1074, 71-80; Garbis, S. D. et al， 2001, 73, 5358-5364]，存在著重現(xiàn)性差和使用壽命短的問題。目 前，專門為親水作用色譜開發(fā)的固定相剛剛起歩，主要是將含甲酰胺基， 羥基的聚合物鍵合到硅膠上作為親水固定相，商品化的親水作用色譜固定 相種類較少[Guo, Y. et al, / C/2畫,r A 2005, 1074, 71-80]。目前，對各 類親水作用固定相缺乏系統(tǒng)的比較研究，還沒有被廣泛使用和普遍接受的 親水作用色譜固定相[Guo, Y. et al,C/2rawatogr .A 2005, 1074, 71-80]。在 硅膠表面固載糖分子作為親水液相色譜分離材料未見文獻報道。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種糖鍵合硅膠固定相及其制備方法，其為一種新型親水液相色譜分離材料，本發(fā)明制得的色譜分離材料結構新穎，柱效和 分離選擇性高，在親水色譜模式下對強極性化合物有很好的保留和分離， 適合分析和分離強極性化合物。該分離材料制備方法簡單可靠，用途廣泛。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種糖鍵合硅膠固定相，其為高效液相色譜固定相，鍵合相為單糖、二 糖、或聚合度為3~10的寡糖，其結構如下其中，X為-OCH3或-OCH2CH3， Y為-OH或-NH2Ac， n=l~10。所用糖 可以是單一化合物，如葡萄糖，半乳糖，麥芽糖，纖維二糖，麥芽三糖， 纖維十糖；也可以是寡糖混合物，如聚合度為2 7的殼寡糖，聚合度為6 10 的菊粉寡糖。所述固定相使用click chemistry作為鍵合方法，鍵合修飾有炔基的糖分 子，包括如下步驟a. 硅膠表面引入疊氮基團在有機溶劑中加入硅烷偶聯(lián)劑、疊氮化鈉和催化劑，硅烷偶聯(lián)劑、疊氮 化鈉與催化劑的摩爾比為1 : 1.2-3 : 0.01-0.1，于60 130°C條件下反應 8~24小時，然后加入經160。C加熱6 18小時的微球型硅膠，每克硅膠所需 硅垸偶聯(lián)劑為2-8mmol;在60 130°C條件下繼續(xù)反應12 24小時，用砂芯 漏斗過濾，依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮洗滌，所得固體于真空干燥 箱中40 80。C條件下干燥6 12小時，即得(3-丙基)疊氮基硅膠；歩驟a所用硅垸偶聯(lián)劑有如下結構其中，X為-OCH3或-OCH2CH3， A為CT或Br-。所用有機溶劑為乙腈、甲苯或N,N-二甲基甲酰胺，每克硅膠所需有機 溶劑的量為5-30ml;催化劑為碘化鈉或者碘化鉀；球形硅膠是粒徑和孔徑 均勻的全多孔硅膠小球，粒徑為5 40um，孔徑為60 300A。b. click chemistry鍵合糖將上述制備的(3-丙基)疊氮基硅膠中加入體積比為1/10 10/1的水/ 甲醇或水/乙醇混合溶劑中，每克(3-丙基)疊氮基硅膠所需混合溶劑量為 10-50ml，再加入炔基糖、催化劑，炔基糖的摩爾劑量為硅膠上疊氮基摩爾 劑量的2 5倍，催化劑為硫酸銅和抗壞血酸鈉，所用摩爾劑量分別為炔基 糖摩爾劑量的1 10%和2 40%;在10 8(fC條件下反應24 72小時，用砂 芯漏斗過濾，依次用乙醇，水，重量濃度2-20。/。EDTA水溶液，水，丙酮洗滌，所得固體于真空干燥箱中40 8(TC條件下干燥6 12小時，即得鍵合糖 固定相。所用的炔基糖的摩爾比劑量為硅膠上疊氮的摩爾比劑量的2 5倍。所用 炔基糖可以是修飾有炔基的單一糖(如葡萄糖，半乳糖，麥芽糖，纖維二 糖，麥芽三糖，纖維十糖等)或修飾有炔基的寡糖混合物(如聚合度為2 7 的殼寡糖，聚合度為6 10的菊粉寡糖等)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1. 結構新穎。本發(fā)明首次提出以糖分子作為親水作用液相色譜鍵合固 定相。糖是水溶性很好的強極性分子，是一種理想的親水作用色譜固定相。 更重要的是，糖分子具有特異性的空間結構，可以表現(xiàn)出獨特的色譜行為 和分離能力。2. 應用范圍廣。本發(fā)明提供的鍵合糖固定相可作為親水作用色譜分離 材料，廣泛用于分離中藥強極性組分，強極性生物樣品等各類強極性化合3. 制備過程簡單可靠。click chemistry反應，反應條件溫和，在水溶液 中進行，而且十分容易放大到大量制備(公斤級)。


圖1為本發(fā)明實施例1制備的硅膠鍵合葡萄糖分離材料(Click Glucose) 用于親水模式的色譜圖；圖2為本發(fā)明實施例1制備的硅膠鍵合葡萄糖分離材料(Click Glucose)用于分離堿基和核苷的色譜圖；圖3為本發(fā)明實施例2制備的硅膠鍵合麥芽糖分離材料(ClickMaltose)用于分離堿基和核苷的色譜圖。
具體實施方式
本發(fā)明所述的分離材料可有效地用于高效液相色譜分離各類強極性化 合物。下面結合實例和附圖，對本發(fā)明做進一步說明。實例僅限于說明本 發(fā)明，而非對本發(fā)明 的限定。所述炔基糖參照文獻[H. B. Mereyala and S. R. Gurrala， Cm^o/^. 1998, 307, 351-354; A. K. Pathak, et al， Car60/7y 2004, 339, 683-691]方法制備，簡要過程如下在乙酸酐溶液中加入糖，加熱回流2 4小時，冷卻至室溫，倒入冰水中 析出固體，即得乙酰糖；將全乙酰糖溶于二氯甲烷中，然后冰水浴中加入 丙炔醇和三氟化硼/乙醚，室溫下攪拌2 4小時，加入K2C03繼續(xù)攪拌30 分鐘，過濾除去固體，濃縮干燥濾液得固體產品，用二氯甲烷/正己垸重結 晶即得炔化乙酰糖；將炔化乙酰糖溶于甲醇溶液中，緩慢滴加甲胺醇溶液， 室溫攪拌12 24小時，濃縮干燥溶液得油狀固體，過硅膠柱色譜純化即得 炔基糖。實施例1在1000ml三口燒瓶中加入500ml無水DMF， 45mmol (約10ml) 3-氯 丙基三乙氧基硅烷，60mmol (約4.0g)疊氮化鈉，然后加入3.0mmol碘化 鈉(約0.5g)作為催化劑，80。C下反應24h，然后加入粒徑為5pm的球形 硅膠顆粒20g， 80。C下再反應24h，然后依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮 各洗滌兩次，每次200ml， 60。C真空干燥12小時即得(3-丙基)疊氮基硅 膠。在250ml燒瓶中加入80ml甲醇和80ml水，然后加入2.9g炔基葡萄糖， 3g (3-丙基)疊氮基硅膠，0.075gCuS04和0.24gNaAsc。在25°C條件下反 應24-72小時，用砂芯漏斗過濾，依次用甲醇，水，10。/。EDTA水溶液，水， 丙酮洗滌，所得固體于真空干燥箱中40°C條件下千燥12小時，即得鍵合 葡萄糖固定相，其結構為2與實施例1不同之處在于，采用麥芽糖代替葡萄糖，按實施例1的合成 步驟可得鍵合麥芽糖固定相，其結構為與實施例1不同之處在于，采用殼寡糖代替葡萄糖，按實施例1的合成 步驟可得鍵合可寡糖固定相，結構為其結構為NHAc/n其中n=2 7。 實施例4使用實施例1所制備的鍵合葡萄糖固定相，用勻漿法填裝4.6*150mm 不銹鋼色譜柱，在親水色譜模式下分離萘和三種強極性化合物(如圖1所 示)。圖1所用色譜條件為流動相A為lOmM醋酸銨水溶液，流動相B為 乙腈，流速lml/min;等度洗脫15%A;柱溫30°C;檢測波長254腿。 圖中1為萘，2為尿嘧啶，3為腺苷，4為鳥苷。實施例5使用實施例1所制備的鍵合葡萄糖固定相，用勻漿法填裝4.6*150mm不銹鋼色譜柱，在親水色譜模式下分離堿基和核苷類化合物(如圖2所示)。圖2所用色譜條件為流動相A為10mM醋酸銨水溶液，流動相B為 乙腈，流速lml/min;梯度條件為0-5min， 3%A; 5隱20min， 3%-20%A; 柱溫30°C;檢測波長270nm。圖中1為胸腺嘧啶，2為尿嘧啶，3為尿 苷，4為腺苷，5為腺嘌呤，6為胞嘧啶，7為胞苷，8為鳥苷。實施例6使用實施例2所制備的鍵合麥芽糖固定相，用勻漿法填裝4.6*150mm 不銹鋼色譜柱，在親水色譜模式下分離堿基和核苷類化合物(如圖3所示)。 圖3所用色譜條件為流動相A為10mM醋酸銨水溶液，流動相B為乙腈， 流速lml/min;梯度條件為0-20min， 10%-20%A;柱溫30°C;檢測波 長275nm。圖中1為胸腺嘧啶，2為尿嘧啶，3為尿苷，4為腺苷，5為腺 嘌呤，6為胞嘧啶，7為胞苷，8為鳥苷。
權利要求
1. 一種糖鍵合硅膠固定相，其特征在于鍵合相為單糖、二糖或聚合度為3～10的寡糖，其結構如下其中，X為-OCH3或-OCH2CH3，Y為-OH或-NH2Ac，n＝1～10。
2. —種權利要求1所述固定相的制備方法，其特征在于使用dickchemistry作為鍵合方法，鍵合修飾有炔基的糖分子，包括如下歩驟a. 硅膠表面引入疊氮基團在有機溶劑中加入硅烷偶聯(lián)劑、疊氮化鈉和催化劑，硅烷偶聯(lián)劑、疊氮 化鈉與催化劑的摩爾比為1 : 1.2-3 : 0.01-0.1，于60 130°C條件下反應 8 24小時，然后加入經160°C加熱6 18小時的微球型硅膠，每克硅膠所需 硅烷偶聯(lián)劑為2-8mmol;在60 130°C條件下繼續(xù)反應12~24小時，用砂芯 漏斗過濾，依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮洗滌，所得固體于真空干燥 箱中40 80。C條件下干燥6 12小時，即得(3-丙基)疊氮基硅膠；所用硅垸偶聯(lián)劑有如下結構<formula>formula see original document page 2</formula>其中，X為-OCH3或-OCH2CH3， A為Cr或Br、b. click chemistry鍵合糖固定相將上述制備的(3-丙基)疊氮基硅膠加入到體積比為1/10 10/1的水/ 甲醇或水/乙醇混合溶劑中，每克(3-丙基)疊氮基硅膠所需混合溶劑量為 10-50ml，再加入炔基糖、催化劑，催化劑為硫酸銅和抗壞血酸鈉，所用摩 爾劑量分別為炔基糖的摩爾劑量的1 10%和2~40%;在10 80°C條件下反 應24 72小時，用砂芯漏斗過濾，依次用乙醇，水，質量濃度2-20%EDTA 水溶液，水，丙酮洗滌，所得固體于真空干燥箱中40 80°C條件下干燥6~12 小時，即得鍵合糖固定相。
3. 按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟a所用的有機 溶劑為乙腈，甲苯或N, N-二甲基甲酰胺；每克硅膠所需有機溶劑的量為 5-30ml。
4. 按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟a所用的催化 劑為碘化鈉或者碘化鉀。
5. 按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟a所用的球形 硅膠是粒徑和孔徑均勻的全多孔硅膠小球，粒徑為5 40ym，孔徑為 60~300A。
6. 按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所用炔基糖可以是修飾了炔基的單一糖分子或修飾了有炔基的寡糖混合物。
7.按照權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所用的炔基糖的摩爾比劑量為硅膠上疊氮的摩爾比劑量的2~5倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及液相色譜固定相，鍵合相為單糖，二糖，或寡糖(聚合度為3-10)，其結構為其中，X為-OCH₃或-OCH₂CH₃，Y為-OH或-NH₂Ac，n＝1～10。首先在硅膠表面引入疊氮基團，制備疊氮基硅膠中間體；然后通過疊氮基與炔基的1，3-環(huán)加成反應，即click chemistry，在水溶液中20～80℃的條件下反應24～72小時，將炔基糖分子鍵合到疊氮基硅膠表面。本發(fā)明提供的色譜分離材料結構新穎，柱效和分離選擇性高。該固定相用作液相色譜分離材料能在親水色譜模式下對強極性化合物有很好的保留和分離的效果，特別適合用于分離和分析強極性化合物。
文檔編號B01J20/286GK101274271SQ200710010808
公開日2008年10月1日 申請日期2007年3月30日 優(yōu)先權日2007年3月30日
發(fā)明者豐加濤, 張永平, 青 徐, 梁鑫淼, 郭志謀, 雷愛文 申請人:中國科學院大連化學物理研究所