專利名稱：一種寡聚乙二醇鍵合硅膠固定相及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及色譜固定相，具體的說是一種寡聚乙二醇固定相及其制備方法;其是采用click chemistry作為鍵合反應(yīng)方法的寡聚乙二醇鍵合固定相。 技術(shù)背景高效液相色譜是現(xiàn)代科學(xué)研究中廣泛使用的分離分析和分離制備方 法，固定相是其核心技術(shù)之一。C18是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的高效液相色譜 固定相，能在反相色譜模式下分離絕大部分弱極性和中等極性有機化合物。 但是，C18固定相的分離主要依靠單一的疏水作用力，分離選擇性受到一 定的限制，例如對于位置異構(gòu)體等難分離物質(zhì)對的分離選擇性十分有限。 另外，現(xiàn)代生命科學(xué)，環(huán)境科學(xué)，材料科學(xué)等的發(fā)展，向色譜分離提出了 更高、更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，色譜分離所面對的對象已從簡單體系發(fā)展到復(fù)雜體 系。對于復(fù)雜體系的分離，受分離選擇性和色譜峰容量的限制， 一維分離 不可能實現(xiàn)復(fù)雜體系的高效分離，需要發(fā)展二維色譜分離技術(shù)。二維色譜 技術(shù)的關(guān)鍵就是柱系統(tǒng)在分離選擇性上的互補性。因此，研發(fā)新型高效液 相色譜固定相對于高效液相色譜的發(fā)展和滿足復(fù)雜體系的高效分離要求都 具有十分重要的意義。理想的新型高效液相色譜固定相除了具備高柱效， 峰對稱性好，重現(xiàn)性好，使用壽命長等基本的色譜分離要求以外，還應(yīng)該 滿足以下幾個方面的條件能在常用反相模式下和C18類似的廣譜分離選 擇性(即對大多數(shù)有機化合物都具有很好的分離選擇性)；同時能具有多重 作用力以實現(xiàn)對難分離物質(zhì)對的分離；與C18在分離選擇性上具有很好的 互補性。發(fā)展新型反相固定相受到了廣泛關(guān)注，發(fā)展了C8，苯基，酚基，氰基 等多種與C18有一定互補性的反相固定相。近年來，還出現(xiàn)了環(huán)境敏感的 分離材料，通過改變柱溫或者流動相pH等來調(diào)控固定相的疏水性，從而實 現(xiàn)分離。2002年，Supelco公司推出了 PEG固定相，是一種結(jié)構(gòu)新穎的新 型反相固定相。這些反相固定相在一定程度上能和C18有一定的互補性， 在某些化合物的分離上顯示出很好的分離效能。但是，還沒有得到廣泛認(rèn) 可與應(yīng)用并且能與C18相媲美的反相固定相。因此，發(fā)展新型反相色譜固 定相具有十分重要的意義和廣闊的前景。從分子結(jié)構(gòu)上看，最成功的C18固定相是一個長度適中的柔性疏水性 鏈狀分子。雖然疏水性是決定分離選擇性的主要因素，但是鏈的柔性、鏈 的長度可能對分離性能產(chǎn)生重要影響。從分子結(jié)構(gòu)類似性的角度設(shè)計和制 備新型反相色譜固定相未見文獻(xiàn)報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種寡聚乙二醇鍵合硅膠固定相及其制備方法，該固定相具有C18類似的柔性鏈狀結(jié)構(gòu)，并且鏈長度適中，同時具有較好 的疏水性和親水性。該固定相的制備方法簡單，用途廣泛。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種寡聚乙二醇鍵合硅膠固定相，其為高效液相色譜固定相，鍵合相 為聚合度2-10的寡聚乙二醇分子，其結(jié)構(gòu)如下其中，X為-OCH3或-OCH2CH3， n=2-10。聚合度2-10的寡聚乙二醇可以是單一化合物，如二聚乙二醇、三聚乙 二醇、四聚乙二醇、五聚乙二醇、六聚乙二醇、七聚乙二醇、八聚乙二醇、 九聚乙二醇、十聚乙二醇，也可以是它們的混合物，如平均分子量為200 的聚乙二醇(PEG200)，平均分子量為300的聚乙二醇(PEG300)，平均分 子量為400的聚乙二醇(PEG400)。本發(fā)明還提供了上述固定相的制備方法，包括如下步驟a.硅膠表面引入疊氮基團在有機溶劑中加入硅烷偶聯(lián)劑、疊氮化鈉和催化劑，硅烷偶聯(lián)劑、疊 氮化鈉與催化劑的摩爾比為1 : 1.2-3 : 0.01-0.1，于60 130°C條件下反 應(yīng)8 24小時，然后加入經(jīng)160°C加熱6 18小時的微球型硅膠，每克硅膠 所需硅垸偶聯(lián)劑為2-8mmol;在60~130°C條件下繼續(xù)反應(yīng)12 24小時， 用砂芯漏斗過濾，依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮洗滌，所得固體于真 空干燥箱中40 80。C條件下干燥6 12小時，即得(3-丙基)疊氮基硅膠；步驟a所用硅烷偶聯(lián)劑有如下結(jié)構(gòu)其中，X為-OCH3或-OCH2CH3， A為Cr或Br-。所用有機溶劑為乙腈、甲苯或N,N-二甲基甲酰胺，每克硅膠所需有機 溶劑的量為5-30ml;催化劑為碘化鈉或者碘化鉀；球形硅膠是粒徑和孔徑 均勻的全多孔硅膠小球，粒徑為5 40Pm，孔徑為60 300A。b.寡聚乙二醇分子修飾炔基在干燥的四氫呋喃中加入四聚乙二醇，冷卻至-10 5。C，攪拌條件下加 入氫化鈉，-10 5°C下反應(yīng)10-30分鐘，然后加入丙炔溴的甲苯溶液，-10~5°C 反應(yīng)]-6小時，升至室溫繼續(xù)反應(yīng)l-6小時。反應(yīng)體系經(jīng)過濾、濃縮等簡 單后處理，過硅膠柱色譜，即得單-O-炔丙基-寡聚乙二醇。步驟b所得單-O-炔丙基-寡聚乙二醇的結(jié)構(gòu)可表示為其中，n=2-10。寡聚乙二醇可以是單一化合物，如二聚乙二醇，三聚乙二醇，四聚乙二醇，……，十聚乙二醇，也可以是一定分子量范圍的聚乙二醇混合物，如平均分子量為200的聚乙二醇(PEG200)，平均分子量 為300的聚乙二醇(PEG300)，平均分子量為400的聚乙二醇(PEG400)。 c. click chemistry鍵合寡聚乙二醇固定相將上述制備的(3-丙基)疊氮基硅膠中加入體積比為1/10 10/1的水/ 甲醇或水/乙醇混合溶劑中，每克(3-丙基)疊氮基硅膠所需混合溶劑量為 10-50ml，再加入單-O-炔丙基-寡聚乙二醇、催化劑，單-O-炔丙基-寡聚乙二 醇的摩爾劑量為硅膠上疊氮的摩爾劑量的1 10倍，催化劑為硫酸銅和抗壞 血酸鈉，所用摩爾劑量分別為單-O-炔丙基-寡聚乙二醇的化合物摩爾劑量的 1 10%和2 40%;在10 80°C條件下反應(yīng)24 72小時，用砂芯漏斗過濾， 依次用乙醇，水，質(zhì)量濃度2-20。/。EDTA水溶液，水，丙酮洗滌，所得固體 于真空干燥箱中40 80°C條件下干燥6 12小時，即得寡聚乙二醇固定相。該鍵合反應(yīng)可表示為本發(fā)明具有如下優(yōu)點1. 結(jié)構(gòu)新穎。本發(fā)明首次提出以寡聚乙二醇作為高效液相色譜固定相，其分子結(jié)構(gòu)為與C18類似的長度適中的柔性鏈狀分子。但是，與C18不同， 寡聚乙二醇固定相分子中每間隔兩個碳原子的位置插入了一個氧原子。這 種結(jié)構(gòu)新穎的固定相具有疏水性的同時又具有一定的親水性。這種兩親性 的柔性鏈狀結(jié)構(gòu)保證了該固定相的優(yōu)異的分離性能，而且其分離選擇性與 C18具有很好的正交性。2. 應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明提供的寡聚乙二醇固定相是一種普適型反相色 譜固定相，對絕大部分有機化合物都具有很好的分離選擇性，可廣泛用于 各類樣品分離。另外，作為一種與C18互補的普適性的反相分離材料，寡 聚乙二醇固定相特別適合用于2D-HPLC。3. 制備過程簡單可靠，有利于實現(xiàn)商品化。click chemistry反應(yīng)，反應(yīng) 條件溫和，在水溶液中進(jìn)行，而且十分容易放大到大量制備(公斤級)。4. 特別適合用于生物分子分離。寡聚乙二醇分子是一種具有親水性的 柔性鏈狀分子，有很好的生物相容性，可以有效避免C18等反相固定相造 成的生物分子變性的問題?？傊?，本發(fā)明制得的固定相結(jié)構(gòu)新穎，分離選擇性高，并且和常規(guī)反 相固定相(如ODS等)具有很好的互補性。該固定相用作液相色譜分離材 料能在反相色譜模式下分離絕大部分有機化合物，特別適合作為常規(guī)反相固定相(如ODS等)的補充，用于分離難分離物質(zhì)對和二維液相色譜。另外，該固定相具有很好的生物相容性，可以有效避免C18等反相固定相造 成的生物分子變性的問題，特別適合用于分離蛋白質(zhì)等生物分子。


圖1為本發(fā)明實施例1制備的四聚乙二醇固定相(OEG-4)用于分離 苯系化合物的色譜圖；圖2為本發(fā)明實施例1制備的四聚乙二醇固定相(OEG-4)用于分離 苯二酚位置異構(gòu)體的色譜圖；圖3為本發(fā)明實施例1制備的四聚乙二醇固定相(OEG-4)用于分離 甲基苯乙酮位置異構(gòu)體的色譜圖。
具體實施方式
本發(fā)明所述的固定相可有效地用于高效液相色譜分離各類有機化合 物。下面結(jié)合實例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實例僅限于說明本發(fā) 明，而非對本發(fā)明的限定。實施例1在1000ml三口燒瓶中加入500ml無水DMF， 45mmo1 (約10ml) 3-氯 丙基三乙氧基硅烷，60mmo1 (約4.0g)疊氮化鈉，然后加入3.0mmo1碘化 鈉(約0.5g)作為催化劑，80。C下反應(yīng)24h，然后加入粒徑為5pm的球形 硅膠顆粒20g， 80。C下再反應(yīng)24h，然后依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮 各洗滌兩次，每次200ml， 60°C真空干燥12小時即得(3-丙基)疊氮基硅 膠。在250ml三口燒瓶中加入100ml干燥的THF和10g四聚乙二醇，冷卻 至-5。C，攪拌條件下加入1.5g氫化鈉，-5~0°C下反應(yīng)15分鐘，然后加入 5.6ml體積濃度為80%丙炔溴的甲苯溶液，-5 0°(3反應(yīng)2小時，升至室溫繼 續(xù)反應(yīng)2小時。反應(yīng)體系經(jīng)過濾、濃縮等簡單后處理，過硅膠柱色譜，用 乙酸乙酯洗脫，即得單-O-炔丙基-四聚乙二醇。在250ml燒瓶中加入80ml甲醇和80ml水，然后加入1.4g單-O-炔丙基 -四聚乙二醇，3g (3-丙基)疊氮基硅膠，0.075gCuS04和0.24gNaAsc。在 25。C條件下反應(yīng)24 72小時，用砂芯漏斗過濾，依次用甲醇，水，10%EDTA 水溶液，水，丙酮洗滌，所得固體于真空干燥箱中60°C條件下干燥10小 時，即得四聚乙二醇固定相(OEG-4)。<formula>formula see original document page 7</formula>實施例2與實施例1不同之處在于，采用三聚乙二醇代替四聚乙二醇，按實施 例1的合成步驟可得另一種寡聚乙二醇固定相(OEG-3)，結(jié)構(gòu)為其結(jié)構(gòu)為<formula>formula see original document page 8</formula>與實施例1不同之處在丁、采用平均分子量為400聚乙二醇代替四聚 乙二醇，按實施例1的合成步驟可得另一種寡聚乙二醇固定相(OEG400), 結(jié)構(gòu)為其結(jié)構(gòu)為其中n=8 9。 實施例4使用實施例1所制備四聚乙二醇固定相(OEG-4)，用勻漿法填裝 4.6*150mm不銹鋼色譜柱，在反相色譜模式下分離一系列苯系化合物，以 乙腈/水體系作為流動相，混合苯系化合物得到了分離(如圖l所示)。圖1所用色譜條件為流動相A為0.3%的乙酸水溶液，流動相B為 含0.3%乙酸的乙腈，流速lml/min;流動相組成為10%B;柱溫30°C; 檢測波長270nm。圖中1為對苯二酚，2為鄰苯二酚，3為苯酚，4為苯， 5為苯乙酮，6為硝基苯，7為2-硝基酚，8為甲苯，9為鄰二硝基苯。實施例5使用實施例1所制備四聚乙二醇固定相(OEG-4)，用勻漿法填裝 4.6H50mm不銹鋼色譜柱，在反相色譜模式下分離位置異構(gòu)體，以乙腈/水 體系作為流動相，位置異構(gòu)體得到了分離(如圖2，圖3所示)。圖2所用色譜條件為流動相A為0.3%的乙酸水溶液，流動相B為 含0.3%乙酸的乙腈，流速lml/min;流動相組成為5%B;柱溫30°C; 檢測波長270nm。圖中1為對苯二酚，2為鄰苯二酚，3為間苯二酚。圖3所用色譜條件為流動相A為0.1%的乙酸水溶液，流動相B為 含0.1%乙酸的乙腈，流速lml/min;流動相組成為15%B;柱溫30°C; 檢測波長254nm。圖中1為鄰甲基苯乙酮，2為間甲基苯乙酮。
權(quán)利要求
1. 一種寡聚乙二醇鍵合硅膠固定相，其特征在于鍵合相為聚合度2-10的寡聚乙二醇分子，其結(jié)構(gòu)如下其中，X為-OCH3或-OCH2CH3，n＝2-10。
2. —種權(quán)利要求1所述固定相的制備方法，其特征在于使用dickchemistry作為鍵合方法，鍵合修飾有炔基的寡聚乙二醇分子，包括如下步 驟a.硅膠表面引入疊氮基團在有機溶劑中加入硅垸偶聯(lián)劑、疊氮化鈉和催化劑，硅烷偶聯(lián)劑、疊 氮化鈉與催化劑的摩爾比為1 : 1.2-3 : 0.01-0.1，于60 130°C條件下反 應(yīng)8 24小時，然后加入經(jīng)160°C加熱6 18小時的微球型硅膠，每克硅膠 所需硅烷偶聯(lián)劑為2-8mmol;在60~130QC條件下繼續(xù)反應(yīng)12 24小時， 用砂芯漏斗過濾，依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮洗滌，所得固體于真 空干燥箱中40 8(fC條件下干燥6 12小時，即得(3-丙基)疊氮基硅膠； 所用硅垸偶聯(lián)劑有如下結(jié)構(gòu)其中，X為-OCH3或-OCH2CH3， A為Cl—或Br—;b. 寡聚乙二醇分子修飾炔基在干燥的四氫呋喃中加入寡聚乙二醇，冷卻至-10 5。C，攪拌條件下加 入氫化鈉，-10~5°(:下反應(yīng)10-30分鐘，然后加入丙炔溴的甲苯溶液，-10 5°0 反應(yīng)1-6小時，升至室溫繼續(xù)反應(yīng)1-6小時；反應(yīng)體系經(jīng)過濾、濃縮后處 理，過硅膠柱色譜，即得單-O-炔丙基-寡聚乙二醇；c. click chemistry鍵合寡聚乙二醇固定相將上述制備的(3-丙基)疊氮基硅膠中加入體積比為1/10~10/1的水/ 甲醇或水/乙醇混合溶劑中，每克(3-丙基)疊氮基硅膠所需混合溶劑量為 10-50ml，再加入單-O-炔丙基-寡聚乙二醇、催化劑，單-O-炔丙基-寡聚乙二 醇的摩爾劑量為硅膠上疊氮的摩爾劑量的1~10倍，催化劑為硫酸銅和抗壞 血酸鈉，所用摩爾劑量分別為單-O-炔丙基-寡聚乙二醇的化合物摩爾劑量的 1 10%和2 40%;在10 80°C條件下反應(yīng)24~72小時，用砂芯漏斗過濾， 依次用乙醇，水，質(zhì)量濃度2-20。/。EDTA水溶液，水，丙酮洗滌，所得固體 于真空干燥箱中40 80°C條件下干燥6~12小時，即得寡聚乙二醇固定相。
3.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟a所用的有機 溶劑為乙腈，甲苯或N, N-二甲基甲酰胺；每克硅膠所需有機溶劑的量為 5-30ml;所用的催化劑為碘化鈉或者碘化鉀；所用的球形硅膠是粒徑和孔徑均勻的全多孔硅膠小球，粒徑為5 40um，孔徑為60 300A。
4. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所用寡聚乙 二醇為二聚乙二醇、三聚乙二醇、四聚乙二醇、五聚乙二醇、六聚乙二醇、 七聚乙二醇、八聚乙二醇、九聚乙二醇、十聚乙二醇或它們的混合物。
5. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所用的NaH 的摩爾劑量為寡聚乙二醇摩爾劑量的1.1~1.5倍。
6. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所用的丙炔 溴的摩爾劑量為寡聚乙二醇摩爾劑量的1.1-1.5倍。
7. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟b所用的丙炔 溴的甲苯溶液中丙炔溴的體積濃度為50% 90%。
8. 按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟c所用的單-O-炔丙基-寡聚乙二醇的摩爾比劑量為硅膠上疊氮的摩爾比劑量的2 5倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及液相色譜固定相，鍵合相為寡聚乙二醇分子(聚合度為2-10)，其結(jié)構(gòu)為其中，X為-OCH₃或-OCH₂CH₃，n＝2-10。本發(fā)明還提供了上述液相色譜固定相的制備方法，首先在硅膠表面引入疊氮基團，然后通過疊氮基與炔基的1，3-環(huán)加成反應(yīng)，即click chemistry，在水溶液中20～80℃的條件下反應(yīng)24～72小時，將修飾了炔基的低聚乙二醇分子鍵合到硅膠表面。本發(fā)明制得的固定相結(jié)構(gòu)新穎，分離選擇性高，并且和常規(guī)反相固定相(如ODS等)具有很好的互補性。
文檔編號B01J20/286GK101274272SQ200710010809
公開日2008年10月1日 申請日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者豐加濤, 張永平, 青 徐, 梁鑫淼, 郭志謀, 雷愛文 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所