專利名稱：方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)如下蛋白質(zhì)的新方法其一個或多個結(jié)構(gòu)域是全長且正確折疊的，在N端或C端附加有一種或多種標(biāo)記部分，并且涉及含有這些蛋白質(zhì)的陣列，以及這些陣列在快速篩選中的用途。
背景技術(shù)：
基因組作圖計劃給治療靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)方法和藥物發(fā)現(xiàn)方法帶來了革命。在鑒定新的治療靶標(biāo)后，現(xiàn)有的組合化學(xué)文庫的高通量篩選將提出對這些靶標(biāo)有活性的多種潛在先導(dǎo)化合物。對于通過較早期臨床試驗研究所有先導(dǎo)化合物這顯然是不經(jīng)濟(jì)的；然而目前還沒有用于評價這些先導(dǎo)化合物對生物中所有蛋白質(zhì)的可能活性譜的快速方法。如果有的話，這種方法允許在早期估計所有先導(dǎo)化合物的可能的毒理學(xué)譜，此信息將顯著加快決定研究及不研究哪種先導(dǎo)化合物的過程。
在制藥工業(yè)中另外還需要鑒定現(xiàn)有藥物(已經(jīng)上市的或仍在研制中的)的所有靶標(biāo)，從而確定其作用機(jī)制。這種信息的獲得將大大加快新藥獲管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的過程，因為越來越清楚，管理機(jī)構(gòu)現(xiàn)在認(rèn)為對作用機(jī)制的了解極為重要。另外，這類信息也能用于設(shè)計改進(jìn)的第二代藥物。這是因為大多數(shù)藥物至少有較小的副作用，這或許是由于藥物或其代謝產(chǎn)物與不希望的靶標(biāo)結(jié)合引起的；所有這些靶蛋白都需要鑒定，以確定設(shè)計改良藥物所需的標(biāo)準(zhǔn)。然而目前還沒有獲得這種信息的簡單方法，價值數(shù)百萬美元的大量潛在藥物僅僅由于缺乏對作用靶點的了解而遭放棄。
愈加認(rèn)為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在負(fù)責(zé)細(xì)胞對內(nèi)部和外部應(yīng)激的反應(yīng)方面非常重要。因此，特異蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是藥物介導(dǎo)干預(yù)傳染病和其它病癥的可能靶點。目前，酵母雙雜交試驗是測定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的唯一可靠方法，但這種體內(nèi)測定甚至在非高通量形式時也不易與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的特異激動劑或拮抗劑的鑒定相容。功能蛋白質(zhì)組表達(dá)陣列，或“蛋白質(zhì)組芯片”，允許以體外形式測定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的特異性和任何藥物介導(dǎo)的作用的特異性。因此具有巨大的潛能，因為它們給該研究領(lǐng)域真正帶來革命。
產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)組陣列的一種方法是分別克隆、表達(dá)、純化和固定在特定蛋白質(zhì)組中表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。但是，開始時需要考慮的一個重要問題是目的基因組的絕對大小，以及完整基因組序列數(shù)據(jù)的獲得。
作為這一點的說明，一個典型細(xì)菌基因組約為5Mbp，少量現(xiàn)已經(jīng)完全測序(例如，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、大腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))；真菌基因組一般約為40Mbp，哺乳動物基因組約為3Gbp，植物基因組約為10Gbp。目前估計，人類基因組序列將在2003年前后完成，盡管有多少信息將要公開還值得懷疑。希望在短期限內(nèi)獲得典型模式生物之外的任何生物的基因組顯然是完全不切實際的，然而從功能蛋白質(zhì)組學(xué)的前景來看，模式生物只有有限的價值。因此，雖然原則上在后4年內(nèi)有可能設(shè)計并合成用來從cDNA文庫中克隆人類基因組中全部約100 000種基因的引物，但實際上這將是非常昂貴(僅引物的成本就將達(dá)到數(shù)百萬美元)并且非常艱苦的過程，即使必要的序列數(shù)據(jù)庫可以獲得。
但是，那些無法獲得完整序列數(shù)據(jù)的藥物相關(guān)生物又怎么辦呢？功能蛋白質(zhì)組學(xué)不能簡單地忽略它們，那么替代方法是什么呢？表達(dá)cDNA文庫原則上能與非特異固定一起用來產(chǎn)生蛋白質(zhì)陣列，但這種技術(shù)明顯受限于由于蛋白質(zhì)折疊遭破壞，非特異固定常常導(dǎo)致功能喪失的事實。另外，所有宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)都可以固定，最好則顯著降低信噪比，最差則導(dǎo)致陽性結(jié)果混亂。因此，能生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)組陣列(其中多種蛋白質(zhì)特異固定并通過共有基序或標(biāo)簽純化，而不影響其功能，并且不需要知道其完整基因組序列)是功能蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的一個巨大進(jìn)步。
發(fā)明者現(xiàn)在發(fā)展了一種新方法，解決了上述問題，它提供的方法可使蛋白質(zhì)組中的每種蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)內(nèi)的特定位置附加一種通用標(biāo)記，而不需要預(yù)先知道相應(yīng)基因的DNA序列。然后能用這種“標(biāo)簽”使下游固定和純化方法具有通用性和特異性，隨后能產(chǎn)生空間確定的陣列，其展示來自特定蛋白質(zhì)組的數(shù)千種蛋白質(zhì)。
此處的一個重要問題涉及“標(biāo)簽”的精確定位。如果標(biāo)簽符合閱讀框地插入任何基因的隨機(jī)、不確定的位置，產(chǎn)生的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)可能以一種不確定的方式截短，在大多數(shù)情況下正確折疊，因而功能遭到破壞。通常發(fā)現(xiàn)，全長蛋白質(zhì)在N端和C端之一(或兩端)處含有短多肽延伸，它們可被截短但不影響折疊或功能。然而，如果這種截短去除任何N端或C端延伸，并與結(jié)構(gòu)域邊界交叉，蛋白質(zhì)的折疊和功能通常受損。此處所述的方法允許將標(biāo)簽精確插入位于每種蛋白質(zhì)N端或C端的正確閱讀框內(nèi)，或者插入靠近任一端且對于蛋白質(zhì)的折疊和功能并不重要的區(qū)域內(nèi)，使得各種經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)在特異固定于陣列中時能夠正確折疊，從而保留功能。對于不同結(jié)構(gòu)域有不同功能的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，此處所述的方法也允許將標(biāo)簽插入整個編碼序列之內(nèi)，但位于特定結(jié)構(gòu)域邊界之外，使得各個標(biāo)記結(jié)構(gòu)域在特異固定于陣列中時正確折疊，從而保留功能。
由于陣列中的每種蛋白質(zhì)都具有完全的功能，因此能直接篩查這些陣列，以確定藥靶和其它生物學(xué)相關(guān)分子。陣列的空間確定可將每種蛋白質(zhì)的表型與其基因型直接相關(guān)，從而可以確定“命中(hit)”。

發(fā)明內(nèi)容
因此，第一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)一種或多種蛋白質(zhì)的方法，這些蛋白質(zhì)中一個或多個結(jié)構(gòu)域是全長且正確折疊的，在N端或C端均附加有一種或多種標(biāo)記部分，該方法包括(a)產(chǎn)生一種或多種DNA分子，其含有編碼該蛋白質(zhì)的開放閱讀框以及5’和/或3’非翻譯區(qū)；
(b)在向子DNA(daughter DNA)分子中統(tǒng)計學(xué)意義上摻入α-S-dNTP及dNTP的條件下擴(kuò)增該DNA分子；(c)特別保護(hù)該DNA分子的5’或3’端免于核酸酶消化；(d)在可以除去該開放閱讀框的5’或3’非翻譯區(qū)(包括起始或終止密碼子)的條件下，首先用5’-3’或3’-5’核酸酶處理該DNA分子，產(chǎn)生一組嵌套缺失(nested deletion)，隨后用單鏈核酸酶處理；(e)將步驟(d)產(chǎn)生的片段克隆到含有一種或多種5’或3’標(biāo)記部分的編碼序列的表達(dá)載體中；(f)表達(dá)該編碼蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，DNA分子的擴(kuò)增在統(tǒng)計學(xué)上摻入一種α-S-dNTP，更優(yōu)選地?fù)饺毽?S-dTTP或α-S-dATP。
標(biāo)記部分可以是一種肽序列，例如六組氨酸標(biāo)簽，抗體表位或擬生物素，或者實際上是一種完整蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如麥芽糖結(jié)合蛋白域。標(biāo)記部分本身可以被翻譯后修飾，例如通過添加生物素或脂類分子。在一個優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記部分也允許純化“標(biāo)記的”蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的方法可以不依靠對多種基因序列的任何了解，而成批的(in one pot)特異修飾cDNA文庫的每一個成員。事實上，它依靠核酸酶對每種cDNA的非漸進(jìn)性截短，使得每種cDNA的5’或3’非翻譯區(qū)被去除。然后將編碼已知標(biāo)記部分的其它已知DNA序列附加到產(chǎn)生的每種cDNA的嵌套缺失上。如果標(biāo)記部分與單個cDNA處于同一閱讀框內(nèi)，并且它之前不是任何閱讀框內(nèi)終止密碼子，則通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的每種遺傳修飾cDNA將編碼一種含有一個共同部分(例如與N端或C端融合的多肽“標(biāo)簽”)的蛋白質(zhì)。對正確折疊的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選可以去掉與結(jié)構(gòu)域邊界交叉并且影響蛋白質(zhì)折疊(因此影響功能)的所有截短體，以及與標(biāo)簽融合的所有閱讀框外融合體。
由于cDNA文庫的每個成員都以相同方式修飾，最終結(jié)果是，cDNA文庫編碼的每一種蛋白質(zhì)都在N端或C端附加有一個共同部分。
由cDNA文庫表達(dá)的蛋白質(zhì)通常被“標(biāo)記”，這易于鑒定和分離。待其純化后，例如，即可附著于微陣列上。借助于標(biāo)簽本身，或者借助于先與蛋白質(zhì)結(jié)合的另一部分，能夠?qū)崿F(xiàn)這種附著。
通過此處所述方法形成的陣列構(gòu)成了本發(fā)明的第二方面。這些陣列含有通常固定于固體載體上的“標(biāo)記”蛋白質(zhì)表達(dá)文庫。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，有多種固體載體常用于陣列領(lǐng)域，任何一種這類“基質(zhì)”都能用于生產(chǎn)本發(fā)明的陣列。
如此處所述，術(shù)語“蛋白質(zhì)陣列”是指一種或多種蛋白質(zhì)部分以一種模式在一種表面上的空間確定的排列。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)部分直接或間接附著于該表面。這種附著可以是非特異的(例如，物理吸附于表面，或形成非特異的共價相互作用)。在一個優(yōu)選實施方案中，利用此處所述的方法使蛋白質(zhì)部分通過與每個蛋白質(zhì)連接的共同標(biāo)記部分附著于表面。
在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)部分可摻入被表面限定的小泡或脂質(zhì)體中。
因此，例如，該模型的每個位置都可含有下列物質(zhì)的一個或多個拷貝a)一種蛋白質(zhì)類型的樣品(形式為單體、二聚體、三聚體、四聚體或更高的多聚體)；b)與相互作用分子結(jié)合的一種蛋白質(zhì)類型的樣品(例如DNA、抗體、其它蛋白質(zhì))；c)與合成分子結(jié)合的一種蛋白質(zhì)類型的樣品(例如肽、化學(xué)化合物)；或d)位于陣列模型每個位置上的2-100種不同標(biāo)記蛋白部分的混合物。
支持陣列的表面可通過如化學(xué)處理包被/衍生化。合適的表面的例子包括載玻片、聚丙烯、聚苯乙烯、硅、金或金屬支持物，或由例如硝酸纖維素、PVDF、尼龍或磷酸纖維素制成的膜。
如此處所述，本發(fā)明的方法可將特定蛋白質(zhì)組內(nèi)的所有蛋白質(zhì)在N端或C端特異添加標(biāo)簽。一些蛋白質(zhì)可能不耐受N端延伸，而其它氨基酸可能不耐受C端延伸，但是絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都可耐受一種或其它這種延伸。然而，現(xiàn)有的文庫克隆方法完全不能解決這一問題，因為它們將基因克隆為全長、未修飾的cDNA，或與某些蛋白質(zhì)配偶體融合的隨機(jī)并且?guī)缀醣厝唤囟痰娜诤象w。與后者相比，本方法可以使標(biāo)簽位置定向于位于或靠近cDNA產(chǎn)物N端或C端殘基的序列，例如，使得與希望的肽配偶體的融合不影響cDNA產(chǎn)物的折疊或功能。與前者相比，如此處所述將蛋白質(zhì)固定于陣列中的方法是通過特異的而不是非特異的相互作用，這些特異相互作用是添加到每個cDNA末端的標(biāo)簽的功能。另外，此處所述的方法也能用來篩選純化、固定的在非細(xì)菌宿主生物中表達(dá)的蛋白質(zhì)，通過正確折疊和翻譯后修飾有助于保持功能，而現(xiàn)有方法如噬菌體展示或λ-cDNA表達(dá)文庫只限于細(xì)菌宿主，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)真核蛋白質(zhì)在其中以非功能形式合成，這是由于錯誤的折疊或不正確的翻譯后修飾。
本發(fā)明的方法具有廣泛的潛在體外用途，大體可分為三個主要領(lǐng)域蛋白質(zhì)-配體相互作用的研究、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究、蛋白質(zhì)-DNA相互作用的研究。
蛋白質(zhì)-配體相互作用此處所述的方法可以快速分析特定新化學(xué)實體與特定蛋白質(zhì)組中所有蛋白質(zhì)的相互作用。這能通過以不同嚴(yán)格性用NCE探查適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)組陣列簡單地實現(xiàn)，其中可考慮反相高通量篩選。這種篩選的結(jié)果可直接用于多種情況，其中一些在以下描述。
對細(xì)胞或完整生物檢測化合物文庫的高通量篩選程序通常用來鑒定先導(dǎo)化合物，這可以在篩選前不知道靶標(biāo)的情況下引起表型改變。然而，隨后鑒定主要靶標(biāo)是一個非常艱苦的過程。本發(fā)明的方法能直接用于這類問題，因為能產(chǎn)生有關(guān)物種的功能蛋白質(zhì)組陣列，然后用先導(dǎo)化合物篩查該陣列，確定其靶向蛋白質(zhì)組中的哪種蛋白質(zhì)。這種總體平行的鑒定蛋白質(zhì)-配體相互作用的方法將大大加速并簡化NCE主要靶標(biāo)的確定，也可鑒定也許重要的較弱的二級相互作用。另外，這些方法還能直接用于種間交叉反應(yīng)性的問題，例如，可以快速評價潛在抗真菌化合物與人類蛋白質(zhì)組中所有蛋白質(zhì)的相互作用；這類信息可證明在隨后先導(dǎo)化合物的任何優(yōu)化中非常有用。
高通量篩選方法現(xiàn)在可以快速鑒定能與以前被確定為潛在治療靶標(biāo)的特定蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子。然而，這些方法不能解決任何一種特定相互作用選擇性如何的問題，而這方面的了解對于決定是否研究特定先導(dǎo)化合物可能是至關(guān)重要的；大家認(rèn)為，導(dǎo)向一種蛋白質(zhì)的化合物可能比導(dǎo)向大量有關(guān)或無關(guān)蛋白質(zhì)的化合物顯示更低的副作用。
已經(jīng)成功通過三期臨床試驗、但由于其主要作用機(jī)制未知仍未能獲得管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的化合物有大量的例子。抗抑郁藥米安色林和曲唑酮(trazadone)和Pfizer的抗關(guān)節(jié)炎藥替尼達(dá)帕就是這樣的例子，它們都有上億美元的投資沒有回報。此處所述的方法能使這些失敗的藥物復(fù)活，因為如果能發(fā)現(xiàn)這些藥物的主要靶標(biāo)，隨后證實其作用機(jī)制，則極其寶貴的臨床實驗數(shù)據(jù)將獲得管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。
現(xiàn)有的所有藥物都有副作用，程度或大或小，一個例子是具有吸引力的抗精神分裂藥物氯氮平。如果能夠確定這些副作用的分子來源，將可大大促進(jìn)氨基酸主要作用優(yōu)化而副作用最小的下一代藥物的設(shè)計。此處所述的方法也能直接用于這些問題，因為在生成一種化合物與蛋白質(zhì)組中所有蛋白質(zhì)的相互作用譜時，可確定異常的二級相互作用，隨后能評價它們是否與已知的副作用有關(guān)。
本發(fā)明的方法也能通過用普通抑制劑篩查蛋白質(zhì)組陣列來鑒定蛋白質(zhì)家族，如絲氨酸蛋白酶。然后可以研制展示如所有人絲氨酸蛋白酶或所有激酶或所有p450酶的生物芯片，用于更集中地篩選先導(dǎo)化合物。例如，p450生物芯片可用于評價一種特定先導(dǎo)化合物是否能被代謝，因為p450介導(dǎo)的羥基化通常是該過程的第一步，被認(rèn)為是藥物反應(yīng)中患者-患者間差異的主要原因之一；實際上現(xiàn)在藥物設(shè)計的目的之一是產(chǎn)生首先不被代謝的化合物，因此p450芯片具有重要的潛在用途。
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和多蛋白質(zhì)復(fù)合物在細(xì)胞生物學(xué)中至關(guān)重要。例如，信號傳導(dǎo)途徑一般由細(xì)胞表面受體與外部配體之間的相互作用啟動，隨后是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的級聯(lián)，最終導(dǎo)致特定基因的激活。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能依賴于特異配體的存在，或者可能被特異配體阻斷，而一些多蛋白質(zhì)復(fù)合物只以依賴配體的形式形成。
利用雙雜交技術(shù)已經(jīng)鑒定了上千種新的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。此處所述的方法克服了這些方法的限制，能用多種經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)篩查蛋白質(zhì)組陣列，不僅鑒定各種相互作用的作用配偶體而且鑒定其相對強(qiáng)度。這些方法也能用于鑒定多蛋白質(zhì)復(fù)合物的組分，甚至在裝備依賴配體時。
這些方法在說明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的用途的一個實例是確定與疾病狀態(tài)有關(guān)的特定細(xì)胞表面受體的胞質(zhì)域的信號配偶體；這些信號配偶體的鑒定與制藥前景直接相關(guān)，因為這些蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能恰好代表可能的治療靶標(biāo)。
蛋白質(zhì)-DNA相互作用估計在人類基因組的所有基因中，大約10％編碼轉(zhuǎn)錄因子，而現(xiàn)在只鑒定了其中一小部分。特異轉(zhuǎn)錄因子與DNA增強(qiáng)子元件的結(jié)合(通常是響應(yīng)外部刺激)是形成增強(qiáng)體(enhanceosome)復(fù)合物的必要條件，該復(fù)合物隨后開啟基因表達(dá)。關(guān)于給藥原則上能影響基因表達(dá)有不同的觀點藥物可阻斷蛋白質(zhì)或小分子與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而阻斷信號級聯(lián)；藥物可阻斷蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或抑制信號級聯(lián)內(nèi)的酶活性；或者另外，藥物可阻斷增強(qiáng)體復(fù)合物內(nèi)特異蛋白質(zhì)-DNA或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形成。一個例子是，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與如同免疫和炎癥反應(yīng)、肢發(fā)育、膿毒性休克、哮喘和HIV前肽產(chǎn)生一樣多樣化的細(xì)胞過程。NF-κB激活中的大多數(shù)胞內(nèi)信號級聯(lián)是所有這些反應(yīng)共有的，因此不是可能的干預(yù)靶標(biāo)。因此，反應(yīng)之間的差異在于最初的配體-受體相互作用或特異增強(qiáng)體復(fù)合物的形成。周知NF-κB可結(jié)合至少14種不同的增強(qiáng)子元件，因此增強(qiáng)體復(fù)合物是可能的治療靶標(biāo)。然而，描述各種增強(qiáng)體復(fù)合物需要知道有關(guān)DNA結(jié)合蛋白的數(shù)量以及彼此的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。能用本方法直接解決這兩個問題。為了鑒定新的DNA結(jié)合蛋白，能用特異性DNA探針篩查蛋白質(zhì)組陣列。此外，也能用特定轉(zhuǎn)錄因子的反式激活域篩查蛋白質(zhì)組陣列，以鑒定可與之相互作用的其它蛋白質(zhì)。這些篩查的交叉相關(guān)性可鑒定特異增強(qiáng)體復(fù)合物的新成分。
用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)陣列也可選擇識別陣列中展示的各種蛋白質(zhì)的分子。在一個優(yōu)選實施方案中，選擇的分子是抗體或抗體樣蛋白質(zhì)，將在噬菌體或核糖體上展示，或?qū)⑴c編碼mRNA共價連接。
因此，噬菌體展示抗體文庫能應(yīng)用于陣列中的每種固定蛋白質(zhì)，并通過洗滌除去未結(jié)合的抗體。然后按照正常程序回收選擇的噬菌體，用來感染細(xì)菌。噬菌體感染的細(xì)菌能產(chǎn)生展示所選抗體的噬菌體顆粒，用于后幾輪篩選，或者它們能產(chǎn)生可溶性抗體片段，以備直接應(yīng)用。術(shù)語“抗體”或“抗體片段”在此是指來源于小鼠、人、駱駝或其它生物的單鏈Fvs、FAB片段、輕鏈或重鏈片段。
在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)陣列可以是微孔形式，使得在篩選步驟后，能通過向每孔中添加適當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞(這些細(xì)胞將被篩選的噬菌體顆粒感染)回收噬菌體顆粒。然后向每孔加入生長培養(yǎng)基，使感染的細(xì)菌生長并表達(dá)抗體片段，而選擇的抗體片段與陣列中的每種固定蛋白質(zhì)保持物理分離。希望時，能在下幾輪篩選中使用感染的細(xì)菌產(chǎn)生的新噬菌體顆粒。這些方法現(xiàn)在已經(jīng)是篩選純化或固定蛋白質(zhì)的多克隆抗體或單克隆抗體片段的常規(guī)方法。實際上，通過總體平行的方式，同時利用標(biāo)準(zhǔn)體外抗體篩選方法，最初的蛋白質(zhì)陣列可產(chǎn)生針對上千種正確折疊的蛋白質(zhì)的多克隆抗體或單克隆抗體片段。
從原初陣列的每個孔中選擇的可溶性表達(dá)的抗體片段本身能固定于一個新的空間確定的陣列中，使得能在新陣列的每個位置上篩選針對固定于原初陣列上一個確定位置的蛋白質(zhì)的抗體片段。這樣產(chǎn)生的抗體陣列在每個位置上含有多克隆或單克隆抗體片段，這取決于在固定可溶性抗體片段前進(jìn)行篩選的輪數(shù)。
這些抗體陣列具有許多可能的用途，包括從粗細(xì)胞或組織裂解液中捕獲多種蛋白質(zhì)，用于相關(guān)蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)監(jiān)測。此外，也可以根據(jù)配體結(jié)合功能直接篩選抗體捕獲的蛋白質(zhì)。一般來說，任何一種單克隆抗體可結(jié)合靶蛋白，以致阻斷其功能，但是另一種單克隆抗體可能結(jié)合但不阻斷功能。以一種總體平行的方法評價蛋白質(zhì)組中所有蛋白質(zhì)的所有單克隆抗體結(jié)合但不影響功能的能力顯然是不切實際的。然而，蛋白質(zhì)組中所有蛋白質(zhì)的一組多克隆抗體可能含有具有希望的結(jié)合但不影響功能的能力的抗體，另外，也可能含有識別特定蛋白質(zhì)的所有翻譯后修飾的抗體。因此，如述產(chǎn)生的多克隆而不是單克隆抗體陣列通常有利于根據(jù)功能直接篩選捕獲的蛋白質(zhì)。
與原初蛋白質(zhì)陣列相比，用此處所述方法產(chǎn)生的抗體陣列具有固定于陣列上的所有蛋白質(zhì)在類似條件下都穩(wěn)定的優(yōu)點。從粗細(xì)胞或組織裂解液中捕獲的蛋白質(zhì)不是重組的，而是天然表達(dá)的。而且，能在從粗細(xì)胞或組織裂解液中捕獲后，根據(jù)功能或配體結(jié)合等直接篩選捕獲的蛋白質(zhì)，這應(yīng)當(dāng)有助于功能的保持。
因此，在其它方面，本發(fā)明提供(i)一種根據(jù)生物活性篩選一種或多種化合物的方法，包括下列步驟使一種或多種該化合物接觸如此處所述的蛋白質(zhì)陣列，測定一種或多種該化合物與陣列中蛋白質(zhì)的結(jié)合；(ii)一種根據(jù)特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用篩選一種或多種蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟使一種或多種該蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞表面受體)接觸如此處所述的陣列，測定一種或多種特定蛋白質(zhì)與陣列蛋白質(zhì)的結(jié)合；(iii)一種根據(jù)特異蛋白質(zhì)-核酸相互作用篩選一種或多種蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟使一種或多種核酸探針接觸如此處所述的陣列，測定該探針與陣列中蛋白質(zhì)的結(jié)合；(iv)如此處所述的陣列在快速篩選化合物、蛋白質(zhì)或核酸中的用途；(v)如此處所述的陣列在篩選可識別陣列中每種蛋白質(zhì)的分子中的用途，其中該分子優(yōu)選地是抗體；(vi)一種生產(chǎn)抗體陣列的方法，包括使此處所述的蛋白質(zhì)陣列接觸一種抗體文庫，使得蛋白質(zhì)陣列中的一種或多種蛋白質(zhì)至少結(jié)合抗體文庫中的一種抗體，除去所有未結(jié)合的抗體，與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體固定于蛋白質(zhì)陣列中；和(vii)一種篩查蛋白質(zhì)功能或豐度的方法，包括使此處所述的抗體陣列接觸一種或多種蛋白質(zhì)的混合物的步驟。
方法(i)、(ii)、(iii)和(iv)也可包括首先根據(jù)本發(fā)明的一種或多種方法生產(chǎn)陣列的步驟。
用此處所述方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的用途構(gòu)成了本發(fā)明的其它方面。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域周知可應(yīng)用修飾蛋白質(zhì)的多種用途，因此，在其它方面，本發(fā)明提供(i)用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)在多種表達(dá)宿主(即細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞)中的表達(dá)(例如，見Walker EA，ClarkAM，Hewison M，Ride JP，Stewart PM.，人1型11-β-羥基類固醇脫氫酶的催化域的功能表達(dá)、表征和純化。J Biol Chem 2001 Jun15；276(24)21343-50；Cai J，Daoud R，Georges E，Gros P.，多藥耐藥性蛋白1在Pichia pastoris中的功能表達(dá)。Biochemistry 2001 Jul17；40(28)8307-16；Hara H，Yoshimura H，Uchida S，Toyoda Y，AokiM，Sakai Y，Morimoto S，Shiokawa K.，人hepassocin——一種具有肝細(xì)胞有絲分裂原活性的肝特異性蛋白質(zhì)——的cDNA的分子克隆和功能表達(dá)分析(1)。Biochim Biophys Acta 2001 Jul 30；1520(1)45-53)(ii)用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的用途。
(iii)用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的用途，通過將修飾DNA分子克隆到酵母雙雜交表達(dá)載體中，分析表達(dá)的蛋白質(zhì)與酵母雙雜交系統(tǒng)中其它蛋白質(zhì)的相互作用(例如，見Staudinger J，PerryM，Elledge SJ，Olson EN.，利用雙雜交系統(tǒng)，酵母中脊椎動物螺旋-環(huán)-螺旋蛋白質(zhì)之間的相互作用。J.Biol Chem 1993 Mar5；268(7)4608-11，Vojtek AB，Hollenberg SM，Cooper JA.，哺乳動物Ras與絲氨酸/蘇氨酸激酶Raf直接相互作用。Cell 1993 Jul16；74(1)205-14)。
(iv)用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的用途，用于固定于親和柱/基質(zhì)上，例如，允許通過親和層析純化a)相互作用的蛋白質(zhì)，b)DNA，或c)化學(xué)化合物。(例如，見Rhodes N，Gilmer TM，Lansing TJ.，來自瞬時轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞的活性重組atm蛋白的表達(dá)與純化。Protein Expr Purif 2001 Aug；22(3)462-6；Zwicker N，Adelhelm K，Thiericke R，Grabley S，Hanel F.，Strep-tag II用于人c-Myc活性bHLHzip域的一步親和純化。Biotechniques 1999Aug；27(2)368-75，Giuliani CD，Iemma MR，Bondioli AC，Souza DH，F(xiàn)erreira LL，Amaral AC，Salvini TF，Selistre-de-Araujo HS.，活性重組賴氨酸49磷脂酶A(2)myotoxin作為融合蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)。Toxicon 2001 Oct；39(10)1595-600)(v)用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)作為診斷工具在通過親和純化固定中進(jìn)行抗體檢測(ELISA測定)的用途(例如，見Doellgast GJ，Triscott MX，Beard GA，Bottoms JD，C heng T，Roh BH，Roman MG，Hall PA，Brown JE.，靈敏的酶聯(lián)免疫吸附測定，用于通過酶聯(lián)凝集測定利用信號擴(kuò)增檢測肉毒桿菌神經(jīng)毒素A、B、E。J ClinMicrobiol 1993 Sep；31(9)2402-9)(vi)用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)作為cDNA微陣列探針鑒定DNA結(jié)合蛋白的用途(例如，見DeRisi J，Penland L，BrownPO，Bittner ML，Meltzer PS，Ray M，Chen Y，Su YA，Trent JM.，cDNA微陣列在分析人癌癥中基因表達(dá)模式中的用途。Nat Genet 1996Dec；14(4)457-60)(vii)用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的用途，通過質(zhì)譜分析用本發(fā)明的方法修飾的源文庫或原材料的表達(dá)蛋白質(zhì)成分，闡明“蛋白質(zhì)組”中蛋白質(zhì)的身份(例如，見Bordini E，Hamdan M.，利用矩陣-輔助激光解吸/電離時間飛行和電噴質(zhì)譜法研究某些共價和非共價復(fù)合物。Rapid Commun Mass Spectrom 1999；13(12)1143-51)。
本發(fā)明每個方面的優(yōu)選特征在細(xì)節(jié)上加以必要的修改后適用于其它任一方面。
現(xiàn)在將參照下列實施例描述本發(fā)明，這些實施例絕不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。


圖1a顯示載體pMM106H的構(gòu)建；圖1b顯示標(biāo)記之前一個示例基因(GST)的PCR擴(kuò)增和外切核酸酶消化的細(xì)節(jié)；圖1c顯示特異連接和PCR擴(kuò)增以導(dǎo)入標(biāo)簽的細(xì)節(jié)；圖1d顯示GST催化的谷胱甘肽與1-氯-2，4-二硝基苯的反應(yīng)。
實施例1(a)載體構(gòu)建(見圖1a)發(fā)明者構(gòu)建了一種載體pMM106H，其來源于pUC19，含有一個強(qiáng)雜合啟動子(Ptrc)，用來引導(dǎo)克隆到緊接啟動子序列下游NcoI位點的基因的表達(dá)。發(fā)明者在NcoI位點與下游HpaI位點之間插入一個676bp的無義DNA序列作為填充片段。HpaI是一種平端切割酶，用來切割載體，如果閱讀框位于平端的第一個堿基上，下游DNA編碼一種聚天冬酰胺六組氨酸肽。六組氨酸標(biāo)簽后是一個琥珀終止密碼子(TAG)，之后是編碼維多利亞水母(Aequorea Victoria)綠色熒光蛋白(GFP)的基因。pMM106H的結(jié)構(gòu)通過測序得到證實。
只有在克隆期間在HpaI位點處產(chǎn)生正確閱讀框時，作為NcoI/平端片段克隆到pMM106H中的基因才與His-標(biāo)簽和GFP融合。GFP在此用作有利于目視篩選表達(dá)His標(biāo)簽的克隆的報道基因，也是融合蛋白正確折疊的標(biāo)志，因為只有在折疊成正確構(gòu)象后GFP才有活性。
琥珀終止密碼子將產(chǎn)生少量全長融合蛋白，顯示為綠色菌落，但是大多數(shù)融合蛋白在His標(biāo)簽后立即終止，能用于隨后的固定和酶測定。應(yīng)當(dāng)理解，可溶性表達(dá)使細(xì)胞具有某些可見表型的蛋白質(zhì)的大量不同肽能替代GFP作為經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)表達(dá)和折疊的標(biāo)志。包括但不限于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶的lacZ片段和能抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，如λ-CI阻抑蛋白。
下述方法采用的模板為pSGTN。該質(zhì)粒如下構(gòu)建首先在標(biāo)準(zhǔn)條件下利用引物’GSTfwd2’(5’-ATG CTG CAG ACG TCA ACA GTATCC ATG GCC CCT ATA CTA GG-3’)和’GSTHindIII’(5’-GCGAGG AAG CTT GTC AAT CAG TCA CGA TGA ATT CCC G-3’)從pGEX-2T(Pharmacia)中PCR擴(kuò)增日本裂體吸蟲(Schistosomajaponicum)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因。這兩條引物在GST的終止密碼子處導(dǎo)入一個NcoI限制位點，使GST的第二個殘基從絲氨酸突變?yōu)楸彼?，并在GST基因3’的多克隆位點中導(dǎo)入一個終止密碼子，隨后是一個HindIII限制位點。然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下將PCR產(chǎn)物作為NcoI/HindIII片段克隆到預(yù)先用NcoI/HindIII消化的pTrcHisA(Invitrogen)中，產(chǎn)生pGSTN。
(b)標(biāo)記前基因的PCR擴(kuò)增和外切核酸酶消化(見圖1b)發(fā)明者使用定制設(shè)計的載體特異引物’STforwar’(5’-ATG CTGACG TCA TGA GGC CCA TGG GGC CCG GAT AAC AAT TTCACA CAG G-3’)和’STreverse’(5’-GCG GAT CCT TGC GGC CGCCAG GCA AAT TCT GTT T-3’)通過聚合酶鏈反應(yīng)從構(gòu)建體pGSTN中擴(kuò)增GST基因，這兩條引物分別結(jié)合載體起點上游156bp和終止密碼子下游84bp。在4個分開的100μl反應(yīng)中進(jìn)行30個循環(huán)的PCR(94℃1min；57℃1min；72℃2min)。每個PCR反應(yīng)含有～20ng模板DNA、各50pmol引物和2.5單位Pwo聚合酶。每個PCR反應(yīng)都在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(10mM Tris.HCl pH8.8，25mM KCl，5mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，10％DMSO)中進(jìn)行。4個PCR反應(yīng)也都含有非標(biāo)準(zhǔn)脫氧核苷酸三磷酸混合物，如下
反應(yīng)1)200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，150μM dGTP，50μM α-S-dGTP；反應(yīng)2)200μM dATP，200μM dTTP，200μM dGTP，150μM dCTP，50μM α-S-dCTP；反應(yīng)3)200μM dATP，200μM dGTP，200μM dCTP，150μM dTTP，50μM α-S-dTTP；反應(yīng)4)200μM dGTP，200μM dTTP，200μM dCTP，150μM dATP，50μM α-S-dATP.
在α-S-dNTP存在下模板DNA的擴(kuò)增當(dāng)然可以利用引物延伸反應(yīng)進(jìn)行，其采用多種不同的DNA聚合酶，包括缺乏3’-5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如Taq聚合酶，和熱不穩(wěn)定聚合酶，如T4 DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段。
在每種特異PCR混合物中含有一種α-硫代脫氧核苷酸三磷酸使有關(guān)α-S-dNTP隨機(jī)但統(tǒng)計學(xué)地?fù)饺胩禺怭CR終產(chǎn)物中。這些修飾核苷酸不是外切核酸酶III的底物，其用來終止酶對核苷酸的逐漸去除。然后合并4種PCR混合物，用QIAquick PCR cleanup試劑盒(Qiagen)在標(biāo)準(zhǔn)條件下純化，消化，用限制酶AatII完成。然后凝膠純化產(chǎn)生的～1000bp PCR產(chǎn)物。用AatII限制酶切產(chǎn)生3’-突出端，它對外切核酸酶III活性有抗性，因此保護(hù)PCR產(chǎn)物的5’端免于降解。
可以設(shè)想特異保護(hù)PCR產(chǎn)物一端免受外切核酸酶消化的備選方法，包括但不限于下列。產(chǎn)生4個或4個以上堿基的3’-突出端的任何限制酶能代替AatII，在PCR引物的設(shè)計中加入必要的位點。產(chǎn)生5’-突出端的任何限制酶也能代替AatII，在PCR引物的設(shè)計中加入必要的位點；在這種情況下，產(chǎn)生5’-突出端后進(jìn)行DNA-聚合酶-介導(dǎo)的補(bǔ)平反應(yīng)，其中相關(guān)α-硫代-dNTPs代替dNTPs，保護(hù)PCR產(chǎn)物的新3’端免受外切核酸酶消化。
然后在150μl反應(yīng)體積中，10-15μg消化的PCR產(chǎn)物與75單位外切核酸酶III/μg DNA在37℃下溫育30分鐘。Exo III消化在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液(66mM Tris.HCl pH8.0，6.6mM MgCl2，5mM DTT，50μg/ml牛血清白蛋白)中進(jìn)行。這些條件確保Exo III消化完成。然后加熱到75℃15分鐘使酶滅活。Exo III消化產(chǎn)物是從PCR產(chǎn)物3’-端的一組嵌套缺失。
外切核酸酶III是一種非漸進(jìn)性3’-5’外切核酸酶，它不能水解含有α-硫的核苷酸，因此在本方案中，每次Exo III到達(dá)α-硫代-脫氧核苷酸堿基時，PCR產(chǎn)物的凹缺3’-端的漸進(jìn)性截短即停止。最終結(jié)果是一組嵌套缺失，是在較早階段隨機(jī)摻入各種α-S-dNTP的結(jié)果。在最初的PCR擴(kuò)增中采用的α-S-dNTP與dNTP之比根據(jù)經(jīng)驗確定，使嵌套缺失的外部橫跨中心大小為400bp的窗口，比最初的全長PCR產(chǎn)物約短100bp。
可通過改變α-S-dNTP與正常dNTP之比控制獲得的截短的大小范圍。當(dāng)該方法用于真核cDNA時這是重要的，因為這些cDNA含有長度可變的3’非翻譯區(qū)，最常見的3’-UTR長度為200-300bp。由于4種α-S-dNTP中的每一種的相對摻入效率因聚合酶種類而不同，因此希望采用對4種堿基中的每一種并對特定聚合酶優(yōu)化的α-S-dNTP與dNTP比例。采用的外消旋α-S-dNTP與dNTP的摩爾比一般為1∶1-1∶3。
(c)單鏈區(qū)的去除和克隆的準(zhǔn)備(見圖1c)在上一步驟中通過外切核酸酶III消化產(chǎn)生的嵌套缺失體通過乙醇沉淀純化，重懸浮于1×綠豆核酸酶緩沖液(50mM乙酸鈉pH5.0，30mM NaCl，1mM ZnSO4)中。在100μl反應(yīng)中，消化的DNA用(2單位/μg)30單位綠豆核酸酶30℃處理30分鐘。該步驟除去5’-和3’-突出端，產(chǎn)生平端產(chǎn)物。加入EDTA至終濃度為5mM終止反應(yīng)。消化的產(chǎn)物用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化，用NcoI消化，以100bp DNA階梯作為標(biāo)準(zhǔn)，在1％瓊脂糖/TBE凝膠上分離。用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖中提取大小為800-1000bp的產(chǎn)物。顯然，也能用其它單鏈核酸酶如S1核酸酶從3’-5’外切核酸酶產(chǎn)生的嵌套3’-缺失體上切除5’-突出端。
(d)嵌套缺失體制備的差異產(chǎn)生嵌套缺失的其它大量標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法與最早的方法明顯的差異。包括但不限于使用任何一種3’-5’外切核酸酶、任何一種5’-3’外切核酸酶或從線性DNA片段末端逐漸截短的任何一種內(nèi)切核酸酶。例如，能利用同上的反向引物，而用可結(jié)合GST基因起點約2kb上游的正向引物，進(jìn)行最初的PCR擴(kuò)增。這將產(chǎn)生GST基因側(cè)翼為5’-端＞2kb而3’-端只有84bp的片段。純化的PCR片段然后可用Bal31核酸酶處理，該酶從5’-端和3’-端逐步降解線性雙鏈DNA。該酶是非進(jìn)性的，DNA的降解速度取決于反應(yīng)時間和溫度，以及DNA的堿基組成。由于PCR產(chǎn)物中GST基因3’-端的側(cè)翼區(qū)明顯短于5’-端，在從另一端到達(dá)起始密碼子之前發(fā)生可達(dá)到及超過終止密碼子的降解。時程實驗可以確定從PCR產(chǎn)物3’-端除去可達(dá)400bp的最佳反應(yīng)條件。然后可使產(chǎn)生的嵌套缺失體成為平端，用特殊限制酶消化，切下原始載體在基因5’-端編碼的剩余的任何單鏈區(qū)，直接克隆到標(biāo)簽載體中。此外，也能用λ外切核酸酶產(chǎn)生嵌套5’-缺失。該酶的優(yōu)選底物是5’磷酸化雙鏈DNA，因此含有5’羥基端能容易地保護(hù)DNA底物的一端。
5’-3’外切核酸酶產(chǎn)生的嵌套5’-缺失體的單鏈3’突出端能用多種不同的酶去除，包括T4 DNA聚合酶或單鏈DNA特異核酸酶，如RNAse T或外切核酸酶T或綠豆核酸酶。
(e)修飾產(chǎn)物的克隆和分析(見圖1c)用限制酶NcoI和HpaI消化載體pMM106H(3μg)，凝膠純化2870bp骨架片段。然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下將載體DNA和如上所述制備的限制酶切產(chǎn)物連接在一起，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞，然后回收，平板接種于含100μg/ml羧芐青霉素的LB平板上。
對上一步獲得的全套缺失體施行這一克隆程序。然而，只有那些切除了GST基因的終止密碼子并且閱讀框內(nèi)密碼子之后立即終止的缺失體才能通過該方法在克隆步驟后與六組氨酸標(biāo)簽和GFP產(chǎn)生閱讀框內(nèi)融合；用該方法產(chǎn)生的其它所有缺失產(chǎn)物只能與六組氨酸標(biāo)簽和GFP產(chǎn)生閱讀框外融合，或者由于在GST終止密碼子處翻譯終止而產(chǎn)生未融合的GST蛋白。這是因為缺失產(chǎn)物平端與載體平端的連接產(chǎn)生一種基因融合，其中下游載體DNA的翻譯閱讀框由GST編碼區(qū)原始閱讀框說明。如果缺失產(chǎn)物終止于不完全密碼子，新添加的六組氨酸編碼序列將與GST基因處于閱讀框外，但如果缺失產(chǎn)物保留GST終止密碼子，則不產(chǎn)生GST與六組氨酸標(biāo)簽的翻譯融合。因此，只有上述全過程產(chǎn)生的六組氨酸-(和GFP-)標(biāo)記蛋白必須是GST與聚天冬酰胺、六組氨酸標(biāo)簽的融合體。沒有必要是絕對全長的克隆，然而，將篩選它們正確折疊和保持酶活性的能力，以用于其它步驟。
轉(zhuǎn)化的菌落在紫外線(365nm)下顯示，肉眼選擇發(fā)綠色熒光的30個菌落(約占總數(shù)的10％)進(jìn)行下一步分析。這些菌落復(fù)制平板接種，在標(biāo)準(zhǔn)條件下用抗-His-標(biāo)簽和抗-GST抗體通過菌落Western印跡法分析?？?His-標(biāo)簽抗體只結(jié)合表達(dá)六組氨酸標(biāo)記蛋白的菌落，因此Western印跡分析得到關(guān)于表達(dá)六組氨酸標(biāo)簽閱讀框內(nèi)融合體的菌落數(shù)的直接信息。另一方面，抗-GST抗體結(jié)合于GST蛋白C端附近，因此只能識別表達(dá)全長或接近全長GST蛋白的菌落。發(fā)明者鑒定了19個菌落(綠色熒光菌落的63％)，它們含有可被抗-His標(biāo)簽和抗-GST抗體陽性識別的蛋白質(zhì)。其中12個菌落的DNA進(jìn)行擴(kuò)增、純化并測序。測序數(shù)據(jù)證實存在與全長GST融合的兩個正確閱讀框內(nèi)融合體，10個菌落在GST基因中有短的截短，但仍與六組氨酸標(biāo)簽在閱讀框內(nèi)。因此，發(fā)明者經(jīng)過總過程獲得的全長GST菌落的分離率約為17％(占綠色熒光菌落總數(shù))，而預(yù)計保持活性的全長或接近全長GST克隆的分離率約為63％(占綠色熒光菌落總數(shù))。
(f)經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的固定和功能分析(見圖1d)用通過上述方法產(chǎn)生的全長、六組氨酸標(biāo)記的GST質(zhì)粒之一轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。一個羧芐青霉素抗性菌落在10ml液體培養(yǎng)液中生長至對數(shù)中期，然后補(bǔ)加100μM IPTG誘導(dǎo)六組氨酸標(biāo)記的GST表達(dá)。再生長4小時后，收獲細(xì)胞，通過凍融/溶菌酶裂解。對粗裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，顯示有過量表達(dá)的預(yù)期大小(27kDa)的一種蛋白質(zhì)，約占總可溶性蛋白的20％，以及少量54kDa GST-六組氨酸-GFP融合蛋白，這是由于琥珀抑制產(chǎn)生的。粗裂解液(500μl；100μg)然后與鎳-NTA磁珠(50μl；結(jié)合能力為15μg六組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì))混合，在磁場下通過沉淀回收磁珠。棄去上清液，洗滌磁珠，然后重懸浮于含有各1mM谷胱甘肽和1-氯-2，4-二硝基苯的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶測定緩沖液中。在室溫下30分鐘后，通過測量340nm的吸光度，采集終點測定數(shù)據(jù)；該波長對應(yīng)于GST-催化反應(yīng)產(chǎn)物的λmax。
作為對照，含有親本載體(pMM106H)或含有編碼無關(guān)His-標(biāo)記蛋白(丙氨酸消旋酶)的質(zhì)粒的DH5α培養(yǎng)物平行生長、誘導(dǎo)、收獲、裂解并測定。只檢測與含有His-標(biāo)記GST的粗裂解液混合的磁珠上的GST活性，清楚地證明，觀察到的GST活性是由于固定的His-標(biāo)記GST，該蛋白質(zhì)在特異固定后保留活性。
在完成酶測定后，通過加入含有100mM咪唑的緩沖液從磁珠上洗脫蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE分析。這表明，得到陽性活性測定結(jié)果的樣品含有預(yù)期為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶大小(27kDa)的一種固定的蛋白質(zhì)，從而證實在磁珠上觀察到的活性僅僅是由于這種重組His-經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
實施例2(a)載體構(gòu)建發(fā)明者構(gòu)建了第二種載體pMM111，它與pMM106H(見實施例1)基本相同，除了676bp NcoI/HpaI無義DNA填充片段被替換為來自大腸桿菌gdhA基因的300bp NcoI/HpaI片段；HpaI克隆位點被替換為SmaI位點，其位置使得下游六組氨酸標(biāo)簽與gdhA基因在閱讀框外2個核苷酸；GFP基因的ATG起始密碼子被替換為丙氨酸密碼子(GCG)。該載體已經(jīng)被消化，使得克隆到SmaI位點內(nèi)的插入片段必須在3’端含有密碼子的第一個核苷酸，與六組氨酸標(biāo)簽和GFP位于閱讀框內(nèi)。pMM111的構(gòu)建通過測序得到證實。
(b)導(dǎo)入標(biāo)簽的改進(jìn)方法發(fā)明者然后進(jìn)行與實施例1所述基本相同的方法，不同之處在于下列改變第一，在最初的PCR擴(kuò)增即部分(b)反應(yīng)3中只添加α-S-dTTP。第二，終產(chǎn)物克隆到載體pMM111的NcoI-SmaI位點。
該方法在理論上有優(yōu)于實施例1所述的幾個優(yōu)點。主要是來自與一種α-硫代-dNTP摻入最初PCR產(chǎn)物中的統(tǒng)計學(xué)結(jié)合。因此，在外切核酸酶III完全消化后，嵌套3’-凹缺的缺失體全都終止于3’-胸苷堿基而不是4種核苷酸中的任一種。如果3’-T屬于GST基因第一個框內(nèi)終止密碼子，或者在它之前，并且位于與第一個框內(nèi)終止密碼子的“T”相同的閱讀框內(nèi)，則這些片段克隆到pMM111的SmaI位點內(nèi)只能產(chǎn)生與六組氨酸標(biāo)簽和GFP的閱讀框內(nèi)融合(這是因為SmaI消化在標(biāo)簽的編碼序列之前產(chǎn)生2個核苷酸的缺口)。
在統(tǒng)計學(xué)上，用這種改進(jìn)方法進(jìn)行外切核酸酶水解可比實施例1少產(chǎn)生4倍的嵌套缺失體。然而，由于所有3種可能的終止密碼子都含有“T”作為其第一個堿基，它們?nèi)即嬖谟谌笔w組中，因此構(gòu)成多4倍的全套缺失體。假定任一特定“T”可能與終止密碼子的第一個“T”位于同一個閱讀框內(nèi)，用這種改進(jìn)方法產(chǎn)生的所有克隆的33％應(yīng)當(dāng)是與載體編碼的His標(biāo)簽的框內(nèi)融合體，但影響折疊(從而影響功能)的缺失體產(chǎn)生“白色”菌落(由于實施例1所述的原因)。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，按照此改進(jìn)方法，“綠色”群體內(nèi)精確、全長克隆的比例顯著高于按照實施例1所述方法發(fā)現(xiàn)的。對于“起始”密碼子相同，因為所有已知的起始密碼子(ATG，GTG，TTG，ATT，CTG)都在第二個位置含有“T”。
該改進(jìn)方法的另一個優(yōu)點是，能向最初PCR擴(kuò)增使用的正向引物(例如，正向-A 5’-AAA AAA AAA AAA GAT CGA TCT CAT GACGGA TAA CAA TTT CAC ACA GG-3’)的5’-端摻入一個polyA尾。在以3∶1的dTTPα-S-dTTP比擴(kuò)增中，至少一個α-S-dTTP殘基非?？赡茉诨パa(bǔ)鏈的末端、PCR產(chǎn)物的5’端摻入。摻入的這些核苷酸耐受外切核酸酶III消化，因此在特別保護(hù)PCR產(chǎn)物末端不受降解時不需要酶促步驟。
實施例3(a)利用六組氨酸標(biāo)簽對第二種蛋白質(zhì)的修飾按照實施例1對谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶所述的方法，發(fā)明者證明該方法不依賴于所操作的基因的序列。
從編碼人轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50的質(zhì)粒開始，除非另外說明，嚴(yán)格按照實施例1所述的方法，發(fā)明者能夠證明NF-κB p50的修飾，使得第一個框內(nèi)終止密碼子切除，而被替換為與編碼聚天冬酰胺、六組氨酸標(biāo)簽和GFP的DNA融合的框內(nèi)融合體(當(dāng)琥珀終止密碼子被抑制時)。當(dāng)用遠(yuǎn)紫外線(365nm)激發(fā)時，進(jìn)一步表征發(fā)綠色熒光的克隆。使用抗-His-標(biāo)簽抗體的菌落Western印跡分析允許鑒定表達(dá)六組氨酸經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的克隆。這些克隆的可溶性蛋白質(zhì)裂解液通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，用抗-His標(biāo)簽抗體雜交。在大約65kDaMr(對應(yīng)于與六組氨酸標(biāo)簽和GFP翻譯融合的NF-κB p50)和約38kDaMr(NF-κB p50-His標(biāo)簽)處觀察到免疫反應(yīng)性信號。另外，在約27kDaMr處也有信號，這可能是對應(yīng)于組氨酸標(biāo)記GFP蛋白的降解產(chǎn)物。測序數(shù)據(jù)證實，有幾個克隆編碼全長或接近全長的NF-κB與六組氨酸標(biāo)簽的正確框內(nèi)融合體。在一個實驗中，根據(jù)綠色熒光篩選了190個菌落?？偣?8個菌落(占篩查克隆總數(shù)的20％)在用遠(yuǎn)紫外線(365nm)激發(fā)時發(fā)綠色熒光。使用抗-His標(biāo)簽抗體的菌落Western印跡分析表明，38個克隆中有29個表達(dá)六組氨酸標(biāo)簽。測序數(shù)據(jù)證實，其中18個克隆是全長或者接近全長的NF-κB p50與六組氨酸標(biāo)簽的框內(nèi)融合體；其中7個克隆是絕對全長的、組氨酸標(biāo)記的NF-κB p50基因，其余11個組氨酸標(biāo)記克隆含有4-1個氨基酸殘基的短截短。該實驗清楚地證明了具有可指示蛋白質(zhì)表達(dá)和適當(dāng)折疊的報道系統(tǒng)的優(yōu)點。大約50％的發(fā)綠色熒光的克隆是與組氨酸標(biāo)簽融合的全長框內(nèi)融合體，或者含有不與域邊界交叉、與組氨酸標(biāo)簽框內(nèi)融合的少量截短。
(b)六組氨酸標(biāo)記的NF-κB p50的固定和功能分析用通過上述方法產(chǎn)生的全長、六組氨酸標(biāo)記的NF-κB質(zhì)粒之一轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。一個羧芐青霉素抗性菌落在10ml液體培養(yǎng)液中生長至對數(shù)中期，然后補(bǔ)加100μM IPTG誘導(dǎo)六組氨酸標(biāo)記的NF-κB p50表達(dá)。再生長4小時后，收獲細(xì)胞，通過超聲處理裂解。對粗裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，在預(yù)期大小(38kDa)處顯示一種過量表達(dá)的蛋白質(zhì)，約占總可溶性蛋白質(zhì)的5％。
κB基序 5′-CGT ATG TTG TGG GGA ATT CCC AGC GGA TAA C-3′3′-GCA TAC AAC ACC CCT TAA GGGTCG CCT ATT G-5′NF-κB P50結(jié)合位點在標(biāo)準(zhǔn)條件下，利用3’-端轉(zhuǎn)移酶用洋地黃毒苷在3’-堿基處標(biāo)記含有NF-κB p50的回文結(jié)合位點的雙鏈寡核苷酸“κB基序”。
采用溶菌酶/凍融法在含有5mM β-巰基乙醇的PBS(磷酸緩沖液pH7.5)中制備蛋白質(zhì)裂解液。將每個克隆200μl可溶性蛋白質(zhì)裂解液加到Ni-NTA包被的微孔中，在室溫下溫育45分鐘。在溫育結(jié)束時，用PBST(含有0.02％Triton X-100的PBS)洗孔三次，除去所有未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用含有5mM β-巰基乙醇的DNA結(jié)合緩沖液(10mMTris.HCl pH7.4，75mM KCl)洗孔三次，浸泡時間為1分鐘。向孔中200μl含1μg poly(dI-dC)非特異性DNA的DNA結(jié)合緩沖液中加入3’洋地黃毒苷標(biāo)記的κB基序(2pmol)。再溫育30分鐘后，用含有0.02％Triton X-100的10mM Tris.HCl pH7.4，25mM KCl洗孔三次，除去未結(jié)合的DNA。用含有0.2％牛血清白蛋白的“抗體稀釋緩沖液”(10mMTris.HCl pH7.4，25mM KCl)將抗-洋地黃毒苷抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物稀釋為150mU/ml。然后將稀釋的抗體(200μl)加到微孔中。在室溫下30分鐘后，用含有0.02％Triton X-100的“抗體稀釋緩沖液”(3×350μl)洗滌微孔，除去未結(jié)合的抗體。然后向孔中加入200μl含250μM對硝基苯磷酸酯(pNPP)——堿性磷酸酶的一種底物——的緩沖液(100mM Tris.HCl pH9.5，100mM NaCl，50mM MgCl2)，在室溫下反應(yīng)過夜，之后在405nm下測量每孔的黃色顯色(對應(yīng)于產(chǎn)物對硝基苯酚的形成)。底物pNPP的背景水解率很低，因此，根據(jù)孔中黃色的出現(xiàn)可立即判斷陽性測定結(jié)果。作為試驗對照，發(fā)明者減掉粗裂解液，或標(biāo)記的寡核苷酸，或抗體，或加入20倍過量的未標(biāo)記雙鏈oligo，或在同一載體背景中，用來自表達(dá)六組氨酸標(biāo)記GST的DH5α細(xì)胞的等量粗細(xì)胞裂解液代替含六組氨酸標(biāo)記NF-κB p50的粗裂解液。
在該試驗中，NF-κB p50首先經(jīng)由特異結(jié)合位點結(jié)合標(biāo)記的寡核苷酸。蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物然后通過六組氨酸標(biāo)簽固定于微孔中，然后洗掉其它所有蛋白質(zhì)(包括標(biāo)記oligo與粗裂解液中存在的其它DNA結(jié)合蛋白的復(fù)合物)以及任何未結(jié)合的、標(biāo)記的oligo。由于抗體偶聯(lián)物可識別oligo上的標(biāo)記物，而不是六組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)，如果在NF-κB p50通過標(biāo)簽固定后保持NF-κB p50-DNA相互作用，則試驗中只能觀察到陽性信號；如果該相互作用未保持，oligo將在洗滌步驟中丟失，因此不會觀察到顏色變化。
發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，只有在含有六組氨酸標(biāo)記的NF-κB p50粗裂解液和洋地黃毒苷標(biāo)記的寡核苷酸并且加入抗-洋地黃毒苷標(biāo)記的抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物的微孔中才檢測到黃色產(chǎn)物。這證明，觀察到的顏色改變特別是由于固定的NF-κB p50-寡核苷酸復(fù)合物，而且NF-κB p50在特異固定后保留活性。
實施例4(a)從10種基因的集合中鑒定一種蛋白質(zhì)發(fā)明者采用基本如實施例1所述的方法，不同之處在于下表列出的10種不同基因的集合。發(fā)明者制備了產(chǎn)生的特異修飾蛋白質(zhì)的陣列，使得陣列中的每個位置對應(yīng)于一種通過該方法附加的標(biāo)簽固定的重組蛋白。發(fā)明者然后通過功能試驗篩查該陣列，成功鑒定了該集合中的各種蛋白質(zhì)成分。
表1.集合中10種基因的大小和功能

開始時，所有10種基因均亞克隆到同一種pTrcHisA載體骨架中，因為該載體模擬cDNA文庫遇到的情況。實施例1所述的引物“STforward”和“STreverse”設(shè)計為用于擴(kuò)增pTrcHisA載體骨架內(nèi)編碼基因的通用引物。
設(shè)計引物“STforward”，使其編碼如下的多個限制位點

G-3Aat II Bsp HI Sfi I于是，為了外切核酸酶保護(hù)目的能用限制酶AatII或SfiI中的任何一種產(chǎn)生3’-突出端。為了在修飾過程結(jié)束時定向克隆，在該實施例中發(fā)明者選用BspHI，因為盡管在統(tǒng)計學(xué)上它在文庫內(nèi)更頻繁地酶切，但它產(chǎn)生與此處所用標(biāo)簽載體pMM106H中的NcoI克隆位點相容的粘端，并且不能酶切該集合中的所有11種基因。顯然，原則上能使用任何引物編碼的限制位點，只要標(biāo)簽載體在啟動子下游含有一個相當(dāng)?shù)目寺∥稽c；在這方面SfiI在較大文庫格式上具有明顯的優(yōu)點，因為它含有一條8bp的識別序列，因此SfiI位點在特定基因內(nèi)隨機(jī)出現(xiàn)的頻率(6.5×104分之一)比6bp識別序列如BspHI(4096分之一)更低。
標(biāo)簽載體pMM106H是一種“ATG”載體，即為了表達(dá)天然蛋白質(zhì)，5’-克隆位點(NcoI)與位于核糖體結(jié)合位點(RBS)下游的ATG起始密碼子重疊。然而，在此處所述的方法中，發(fā)明者不依靠在起始密碼子處含有一個共同限制位點的克隆基因。而是只依靠載體編碼的啟動子起始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，翻譯起始的必要信號由克隆的基因本身提供。因此在本實施例中，原始集合中的所有基因都在RBS之后緊接著含有一個起始密碼子，而無論在ATG處是否存在克隆位點。由于引物“STforward”結(jié)合于最初所有11個克隆的RBS上游，隨后用編碼限制位點的任何引物進(jìn)行修飾后克隆將向標(biāo)簽載體中導(dǎo)入新修飾的基因以及原始RBS和ATG，于是確保翻譯起始。在cDNA文庫形式中，用于所有全長cDNA的一種類似情況含有其自身5’-非翻譯區(qū)(UTR)，其中含有真核翻譯起始信號。獲得適當(dāng)翻譯起始所必需的是向真核載體中克隆每種修飾的cDNA以及其5’-UTR，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄起始信號，因此與本實施例中使用的相當(dāng)?shù)囊唤M通用PCR引物能以不依賴于序列的方式用于修飾cDNA文庫的每一個成員。
實驗方法如實施例1所述進(jìn)行，修改如下。等摩爾的一組所有10種基因用作使用引物“STforward”和“STreverse”的初始PCR擴(kuò)增的模板，之后用AatII消化片段以保護(hù)5’端。外切核酸酶III和綠豆核酸酶處理的片段完全如實施例1所述產(chǎn)生，然后用BspHI消化，其限制酶切正向PCR引物結(jié)合位點內(nèi)的獨特片段，產(chǎn)生一個用于克隆到載體pMM106H中的粘端。凝膠純化獲得的片段，與載體連接。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在紫外線(365nm)下顯示，肉眼選擇發(fā)綠色熒光的菌落進(jìn)行Western印跡分析。約占總數(shù)2％的轉(zhuǎn)化菌落發(fā)綠色熒光。其中，103個(42％)表達(dá)可由抗-His標(biāo)簽抗體識別的蛋白質(zhì)。這些菌落分別接種于96深孔平板中的1.5ml液體培養(yǎng)基中，生長過夜。離心收集細(xì)胞，通過凍融/溶菌酶裂解。然后將各個粗裂解液加至鎳-NTA包被的96孔平板的各個孔中，洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，剩下固定于每個孔中的分離的His標(biāo)記重組蛋白。然后利用實施例1和3所述的試驗測定固定的蛋白質(zhì)的GST或NF-κB活性，在所有情況下都根據(jù)綠色或黃色的出現(xiàn)分別確定含有陽性“命中”的孔。
在第一個試驗中，發(fā)現(xiàn)陣列中有三種蛋白質(zhì)顯示GST活性，命中率約為3％。相應(yīng)質(zhì)粒的測序顯示，所有三種都編碼GST基因與六組氨酸標(biāo)簽和GFP基因的框內(nèi)融合體；在這三種之中，有兩種為絕對全長GST，一種略微截短，但顯然不影響活性。
在第二個試驗中，陣列中有三種蛋白質(zhì)顯示陽性“κB基序”DNA結(jié)合活性。對陽性克隆的進(jìn)一步表征顯示，兩種克隆是NF-κB p50基因與六組氨酸標(biāo)簽的框內(nèi)融合體，其中之一接近全長(截短一個氨基酸)，而另一個截短更多，但含有NF-κB p50的完整DNA結(jié)合域。有趣的是，由于該試驗是設(shè)計用于結(jié)合同源DNA序列，DNA結(jié)合域仍然完整、折疊并具有功能的截短體在該試驗中將為陽性。發(fā)現(xiàn)第三個克隆是鼠轉(zhuǎn)錄因子NFAT的DNA結(jié)合域與His標(biāo)簽的框內(nèi)融合體。該試驗使用的3’-洋地黃毒苷標(biāo)記的“κB基序”含有一個NF-κB p50的特異性、高親和力(Kd約為pM)結(jié)合位點，但NFAT的DNA結(jié)合域也能以接近nM的親和力特異識別這同一個結(jié)合位點。因此該結(jié)果證明，該方法生產(chǎn)的陣列的功能篩查既能鑒定特異相互作用也能鑒定特異且生物學(xué)相關(guān)的較弱相互作用。
在下一個實驗中，按照該實施例的方法制備含有約340種His經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的陣列。通過GST活性測定分析陣列顯示，陣列中的所有蛋白質(zhì)8％具有強(qiáng)GST活性。另外，也利用基因特異的引物對一組340個編碼質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR分析，顯示每種基因位于His標(biāo)記的集合中。因此這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實本實施例的方法是不依賴于序列的，適用于不同基因的集合。
總之，發(fā)明者使用這些實施例所述的方法生產(chǎn)微孔形式的功能蛋白質(zhì)陣列，并且利用這些陣列，根據(jù)特異蛋白質(zhì)-配體相互作用(GST活性測定)或特異蛋白質(zhì)-DNA相互作用(NF-κB結(jié)合測定)，從一組集合中成功鑒定了三種不同的蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)一種或多種蛋白質(zhì)的方法，這些蛋白質(zhì)中一個或多個結(jié)構(gòu)域是全長且正確折疊的，在N端或C端均附加有一種或多種標(biāo)記部分，該方法包括(a)產(chǎn)生一種或多種DNA分子，其含有編碼該蛋白質(zhì)的開放閱讀框以及5’和/或3’非翻譯區(qū)；(b)在向子DNA分子中統(tǒng)計學(xué)意義上摻入α-S-dNTP及dNTP的條件下擴(kuò)增該DNA分子；(c)特別保護(hù)該DNA分子的5’或3’端免于核酸酶消化；(d)在可以除去該開放閱讀框的5’或3’非翻譯區(qū)，包括起始或終止密碼子，的條件下，首先用5’-3’或3’-5’核酸酶處理該DNA分子，產(chǎn)生一組嵌套缺失，隨后用單鏈核酸酶處理；(e)將步驟(d)產(chǎn)生的片段克隆到含有一種或多種5’或3’標(biāo)記部分的編碼序列的表達(dá)載體中；(f)表達(dá)該編碼蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該DNA分子的擴(kuò)增在統(tǒng)計學(xué)意義上摻入一種α-S-dNTP。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中一種α-S-dNTP是α-S-dTTP或α-S-dATP。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中該核酸酶是外切核酸酶III或λ外切核酸酶。
5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中該單鏈核酸酶是綠豆核酸酶或T4 DNA聚合酶。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中標(biāo)記部分可以證實所述開放閱讀框的表達(dá)。
7.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中標(biāo)記部分可證實所述開放閱讀框的折疊。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中標(biāo)記部分編碼綠色熒光蛋白。
9.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中標(biāo)記部分是一種肽序列，例如六組氨酸標(biāo)簽，一種完整蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如麥芽糖結(jié)合蛋白域。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中該標(biāo)簽允許純化陣列中的各種蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中插入標(biāo)簽，替換每種蛋白質(zhì)的起始或終止密碼子。
12.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中該標(biāo)簽符合閱讀框地插入緊接對于折疊和功能并不重要的每種蛋白質(zhì)末端的區(qū)域中。
13.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中該標(biāo)簽符合閱讀框地插入開放閱讀框內(nèi)，但在對于折疊和功能并不重要的特異結(jié)構(gòu)域邊界之外的區(qū)域內(nèi)。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其中步驟(a)中DNA分子的擴(kuò)增利用非校讀聚合酶，例如Taq聚合酶或DNA聚合酶IKlenow片段。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法，其中α-S-dNTP與dNTP之比為1∶1-1∶3。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，其中該5’-3’或3’-5’核酸酶不能水解α-S-磷酸二酯鍵。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其中該DNA分子是通過反轉(zhuǎn)錄由mRNA序列產(chǎn)生的cDNA。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其中對多種DNA分子平行施行該方法。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，其中對一批中的DNA分子群體單獨施行該方法。
20.利用權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)文庫。
21.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)陣列的方法，該方法包括(a)克隆分離權(quán)利要求20的文庫的每一個成員；(b)以空間分離的形式表達(dá)各種經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)；(c)借助標(biāo)記部分純化每種經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)；(d)將每種蛋白質(zhì)沉積于空間確定的陣列上。
22.利用如權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法制備，或者利用權(quán)利要求21所述的方法生產(chǎn)的一種含蛋白質(zhì)陣列。
23.如權(quán)利要求22所述的陣列，其中該陣列的成分例如固定于固體表面。
24.如權(quán)利要求22或23所述的陣列，其中借助標(biāo)簽部分固定每種蛋白質(zhì)。
25.一種根據(jù)生物活性篩選一種或多種化合物的方法，包括下列步驟使一種或多種該化合物接觸如權(quán)利要求22-24中任一項所述的蛋白質(zhì)陣列，測定一種或多種該化合物與陣列中蛋白質(zhì)的結(jié)合。
26.一種根據(jù)特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用篩選一種或多種蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟使一種或多種該蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞表面受體，接觸如權(quán)利要求22-24中任一項所述的陣列，測定一種或多種該特定蛋白質(zhì)與陣列蛋白質(zhì)的結(jié)合。
27.一種根據(jù)特定蛋白質(zhì)-核酸相互作用篩選一種或多種蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟使一種或多種該核酸探針接觸如權(quán)利要求22-24中任一項所述的陣列，測定該探針與陣列中蛋白質(zhì)的結(jié)合；
28.如權(quán)利要求22-24中任一項所述的陣列在快速篩選化合物、蛋白質(zhì)或核酸中的用途。
29.如權(quán)利要求22-24中任一項所述的陣列在篩選可識別陣列中每種蛋白質(zhì)的分子中的用途，其中該分子優(yōu)選地是抗體。
30.一種生產(chǎn)抗體陣列的方法，包括使如權(quán)利要求22-24中任一項所述的蛋白質(zhì)陣列接觸一種抗體文庫，使得蛋白質(zhì)陣列中的一種或多種蛋白質(zhì)結(jié)合該抗體文庫中的至少一種抗體，除去所有未結(jié)合的抗體，固定與蛋白質(zhì)陣列中的蛋白質(zhì)結(jié)合的那些抗體。
31.一種篩查蛋白質(zhì)功能或豐度的方法，包括使如權(quán)利要求30所述的抗體陣列接觸一種或多種蛋白質(zhì)的混合物的步驟。
32.如權(quán)利要求25-27或30中任一項所述的方法，該方法也包括首先產(chǎn)生如權(quán)利要求22-24中任一項所述的蛋白質(zhì)陣列的步驟。
33.如權(quán)利要求21所述的方法，其中陣列中的蛋白質(zhì)在一步中純化并固定。
34.利用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的用途。
35.利用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)在分析所表達(dá)的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)之間相互作用中的用途。
36.利用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)在固定于親和柱/基質(zhì)上的用途，例如，允許通過親和層析純化a)相互作用的蛋白質(zhì)，b)DNA，或c)化學(xué)化合物。
37.利用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)作為診斷工具在通過親和純化固定中進(jìn)行抗體篩查(ELISA測定)中的用途。
38.利用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)作為cDNA微陣列探針的用途。
39.如權(quán)利要求38所述的用途，用于DNA結(jié)合蛋白的鑒定。
40.利用此處所述方法生產(chǎn)的經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)在闡明“蛋白質(zhì)組”中蛋白質(zhì)身份中的用途。
41.如權(quán)利要求40所述的用途，其中對通過本發(fā)明的方法修飾的源文庫或原材料的表達(dá)蛋白質(zhì)成分進(jìn)行質(zhì)譜分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)如下蛋白質(zhì)的新方法其一個或多個結(jié)構(gòu)域是全長且正確折疊的，在N端或C端附加有一種或多種標(biāo)記部分，并且涉及含有這些蛋白質(zhì)的陣列，以及陣列中的這些蛋白質(zhì)在快速篩選中的用途。
文檔編號B01J20/24GK1494589SQ01815706
公開日2004年5月5日 申請日期2001年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月17日
發(fā)明者J·M·布萊克伯恩, M·A·馬爾德, M·薩馬德爾, R·科茲洛斯基, J M 布萊克伯恩, 嚷逅夠, 淼露, 馬爾德 申請人:森斯普羅特米克有限公司