專利名稱:氰化物水解酶的制備的制作方法
本發(fā)明涉及氰化物水解酶的制備方法。
含有氰化物水解酶EC 4.2.1.66號(或者稱為甲酰胺水解酶)的某種真菌，能夠把氰化物降解為甲酰胺(見生物化學(xué)和生物物理學(xué)雜志151卷，468～474頁，(1972年)以及植物病理學(xué)67卷，1001～1006頁(1977年))，可參閱下述日本發(fā)酵技術(shù)雜志45卷，7期，630～636頁(1967年);46卷，10期，807～813頁(1968年);47卷，10期，639～643頁和644～650頁(1969年)以及48卷，5期，277～282頁和253～290頁(1970年)。一般認(rèn)為這種真菌適用于微生物處理含氰廢液(見歐洲專利61249號)，為適合此種目的，最好含氰化物水解酶的真菌長時(shí)間后仍然穩(wěn)定，而且具有高活性。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種制備氰化物水解酶的方法，包括步驟(A)在溫度28～34℃，pH值4.5～7.5以及稀釋率不大于0.11/小時(shí)的條件下，在含碳和適當(dāng)無機(jī)營養(yǎng)物源的液體培養(yǎng)中連續(xù)培養(yǎng)需氧微生物菌株。同時(shí)，在發(fā)酵情況下，連續(xù)地把氰離子和/或氰化氫和/或產(chǎn)生氰離子和/或氰化氫的化合物供給當(dāng)量濃度至少為15毫克分子的培養(yǎng)物(完全培養(yǎng)基中的氰離子和/或氰化氫供給培養(yǎng)物);步驟(B)從培養(yǎng)物回收含氰化物水解酶的細(xì)胞。
一種處理含氰化物材料以降解其中氰化物的方法，其中，該材料用氰化物水解酶或包含氰化物水解酶的組合物處理，特征為氰化物水解酶是由本發(fā)明方法制備。該方法也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在培養(yǎng)條件下，加到培養(yǎng)物的氰離子變成氰化氫。
雖然也可使用適宜的菌株，但最好的微生物菌株是真菌菌株?？捎糜诒景l(fā)明方法的真菌包括Stemphylium loti，如ATCC 11718;陸生小齒菌;如CBS 231.53;從加拿大農(nóng)業(yè)部渥太華培養(yǎng)中心得到的念珠形鐮刀菌，如3104，SA，49a號，也可是儲存號CBS161.82;Helminthosporium Sorghicola，或稱作Drechslera Sorghicola，如CBS 249.49;periconiacircinata，如CBS263.37;以及Glomerella tucamanensis，CBS 132.37(ATCC NO.指的是美國馬里蘭州20852，羅克維爾市12301 Park Lawn Drive美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫的登記號，CBS NO.指的是荷蘭巴恩真菌菌種收藏中心的登記號)。還可使用其它真菌以及在文獻(xiàn)中所介紹的產(chǎn)生酶的真菌，包括Collectotrichum graminicola，高梁膠尾孢菌，大斑病長蠕孢菌，玉蜀黍?qū)Ｈ滏呔?，碳色長蠕孢菌，維多利亞長蠕孢菌和H.Phomna。
較好的真菌菌株是鐮刀菌，尤其是磚紅鐮刀菌株CMI 300533，1986年2月3日儲存在英國Ferry Lane，Kew，Richmond，Surrey，Tw9 3AF，英聯(lián)邦真菌研究所;并由此得到變種和突變體。較好的真菌菌株CMI 300533對小麥不致病原，具有下列形態(tài)特征培養(yǎng)基(1)，馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)250克洗凈并切成小片的馬鈴薯放在15磅/吋2壓力的蒸煮器中15分，煮成物用兩層細(xì)棉布壓榨，把2%葡萄糖和2%瓊脂加到混濁的濾液，對培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌及分配。
培養(yǎng)基(2)，Czapek-Dox(改進(jìn)的)瓊脂(Oxoid)(CDA)“Oxoid”表示注冊商標(biāo)。
生長條件25℃，幾星期。
生長率分別為4.0厘米/3天3.0厘米/3天。
生長特征柔毛狀白色氣中菌絲體的分散菌落。帶灰玖瑰色PSA培養(yǎng)基的斑點(diǎn)由深紅色趨向于黃色，在CDA上趨向有點(diǎn)淺色的，偶而產(chǎn)生深紅色色素，這尤其在老化時(shí)。1～2星期后，氣中菌絲體趨向于棕色并萎陷。然后菌落變得相當(dāng)粘稠，如形成分生孢子座，在PSA上的顏色由淡紅到棕色，在CDA上變成赭色。
不產(chǎn)生滲出液，并且形成的色素趨向于菌絲體顏色。
分生孢子小分生孢子不是由這種真菌產(chǎn)生的，而由單個(gè)側(cè)向生長擔(dān)子?；驇в卸虪顡?dān)子梗的多分支分生孢子梗產(chǎn)生的。在較老的培養(yǎng)物中，分生孢子梗聚集成分生孢子座，特別在CDA上，分生孢子從鐮刀形變?yōu)閺澢忓N狀背腹形。在較新培養(yǎng)物中有3～5個(gè)通常為5個(gè)隔膜，孢子大小為25～50μ×2.5μ～4.0μ。
基底細(xì)胞往往是有蒂的，尤其是較長的具有5個(gè)隔膜的孢子。膨脹細(xì)胞產(chǎn)生在菌絲體中，厚膜孢子往往產(chǎn)生在菌絲內(nèi)，并以單個(gè)或成簇的發(fā)生。
在我們的共同未決英國專利申請8604069號和8607595號中，介紹并要求保護(hù)由磚紅鐮刀菌CMI 300533的需氧培養(yǎng)的細(xì)胞制備氰化物水解酶的方法。
可使真菌以兩種不同形式生長，即球狀或粒狀形式或成分散狀，即真菌細(xì)胞是分散在生長培養(yǎng)基中的彌散絲條。為用于廢液處理，重要的是真菌從與球狀或粒狀相反的分散狀形式生長。由于營養(yǎng)物的擴(kuò)散和氣體通過粒狀真菌，而阻止粒狀生長時(shí)，使得培養(yǎng)無效。本發(fā)明方法中的培養(yǎng)步驟(A)的條件有助于分散狀形式的生長。
在本方法培養(yǎng)步驟(A)中，真菌菌株可在碳或氧限量條件下適宜地生長，然而較好的條件是在碳和氧都限量的雙重條件下，這樣則生長得更好。培養(yǎng)基最好是一種限定的培養(yǎng)基，即一種除了碳源外只含天然鹽而無任何未限定的有機(jī)物質(zhì)，如酵母液。
任何適宜的碳源可用于本方法，但葡萄糖較好。好的氮源包括硫酸銨和氫氧化銨，好的磷源包括磷酸鉀和磷酸。培養(yǎng)基的主要成分最好在其穩(wěn)定狀態(tài)下，以下列濃度范圍供應(yīng)本方法的培養(yǎng)基H3PO410～20毫克分子K2SO4800～1400ppmMgSO4·7HO 700～1200ppm葡萄糖·1H2O 10，000～40，000ppm(NH4)2SO4500～3000ppm微量營養(yǎng)物 0.1ppm～20ppm在穩(wěn)定狀態(tài)下，供給培養(yǎng)物的一種非常適宜的培養(yǎng)基具有下述組分1.1M H3PO4320毫升/20升微量金屬/生物素 10毫升/20升K2SO420克/20升MgSO4·7H2O 18克/20升葡萄糖·1H2O 223克/20升(NH4)2SO450克/20升微量金屬/生物素(每升)FeCl3·6H2O 9.6克CuSO4·5H2O 3.6克MnSO4·4H2O 30.0克ZnSO4·7H2O 38.0克生物素 0.52克氰離子或氰化氫在本發(fā)明整個(gè)培養(yǎng)過程中，分別地或與其它營養(yǎng)物一起供給培養(yǎng)物。最好把氰化鈉或氰化鉀之類的堿金屬氰化物加到用于本發(fā)明的培養(yǎng)基，在開始培養(yǎng)階段，氰化物從低濃度開始，以漸增濃度加入，培養(yǎng)物中真菌細(xì)胞的允許量也隨之增加。最后，在穩(wěn)定狀態(tài)培養(yǎng)期間，供給培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基中，氰化物至少以15毫克分子濃度供給，即液體的總量給培養(yǎng)物，最好為2～10(尤其4～6)毫摩爾/克干重細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)物穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，供給培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中較高濃度氰離子，能增加細(xì)胞中氰化物水解酶的活性，酶的活性程度隨著氰離子濃度的增加而線性增加。例如酶活性單位即每分鐘每毫升培養(yǎng)物產(chǎn)生甲酰胺的微摩爾數(shù)，在氰化物容量低(5毫克分子)時(shí)為55單位，而氰化物容量高(20毫克分子)時(shí)為220單位。
用于本方法培養(yǎng)步驟(A)的最佳條件如下對于最高的酶活性，稀釋率在0.05～0.1/小時(shí);pH值5.0～6.0，尤其為5.5;溫度在28～32℃，尤其為30～32℃。
在培養(yǎng)階段，培養(yǎng)物連續(xù)從進(jìn)行培養(yǎng)的發(fā)酵桶排出，含氰化物水解酶的細(xì)胞用任意的適宜方法，最好采用過濾和排出的培養(yǎng)物分離。接著干燥所分離的細(xì)胞，并進(jìn)一步處理，如熱壓產(chǎn)生任意適宜形式如粒狀或粉末狀的含氰化物水解酶細(xì)胞材料。同時(shí)，酶可與細(xì)胞分離并用于無細(xì)胞形式，一般這是不必要的，酶通常不與含酶細(xì)胞分離。含氰化物水解酶的真菌菌絲體可能是固定的，如歐洲專利61249號中所述，但是，這種提純一般是不進(jìn)行的。
由本發(fā)明方法制備的氰化物水解酶材料很適于處理含氰化物廢液，例如用歐洲專利61249號的方法。制備的酶具有高度的貯存期穩(wěn)定性(例如半衰期多至130天)及高活性。在限氧或限氧和限碳的雙重條件下，進(jìn)行本方法的培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生有特別高穩(wěn)定性的含酶材料。當(dāng)溫度在30～32℃下進(jìn)行本方法的培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生有特別高活性的含酶材料。
下述實(shí)施例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1在限制葡萄糖，即在限定的培養(yǎng)基中，有氫化氰(HCN)存在下，連續(xù)培養(yǎng)鐮刀菌株CMI 300533，以提高氰化物水解酶活性。在不同的培養(yǎng)溫度，pH值5.5及稀釋率0.10/小時(shí)的條件下建立穩(wěn)定狀態(tài)，其結(jié)果列于表1。說明在30～32℃時(shí)，酶的活性最高，低于該溫度時(shí)，活性減半。34℃時(shí)生長，導(dǎo)致培養(yǎng)的失敗。酶活性單位是在pH值8.5，每分鐘從100毫克分子氰化鈉產(chǎn)生微摩爾的甲酰胺。
表1溫度對活性的影響PH 樣品活性 稀釋率 溫度 〔CN〕(單位/毫克干重) (1/小時(shí)) (℃) (毫克分子)5.5 59.3 0.05 30.0 15.45.5 27.5 0.05 28.0 14.45.5 27.1 0.05 27.0 15.25.5 25.5 0.05 25.0 13.25.5 22.7 0.05 25.0 14.75.5 52.4 0.05 30.0 14.05.5 52.3 0.05 32.0 14.8實(shí)施例2在限制葡萄糖，即限定的培養(yǎng)基中，有氫化氰的情況下，連續(xù)培養(yǎng)鐮刀菌株CMI 300533，提高氰化物水解酶的量。在PH(5.5)，溫度(30℃)及稀釋率(0.10/小時(shí))保持不變的不同氧合率的條件下建立穩(wěn)定狀態(tài)。冷凍干燥所得到的酶，在4℃下貯存在硅膠上，通過超限時(shí)間測定制劑的等分試樣，控制酶制劑的穩(wěn)定性，其結(jié)果列于表2，說明當(dāng)培養(yǎng)物在雙重限定氧和碳情況下生長時(shí)，增加貯存酶的穩(wěn)定性。
表2氧合作用 第一次半衰期有氧的 21天輕度缺氧 63天嚴(yán)重缺氧 90天實(shí)施例3
在限制葡萄糖，即限定的培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)鐮刀菌株CMI 300533，測定氰化物水解酶的誘導(dǎo)輪廓。在PH(5.5)溫度(30℃)及稀釋率(0.10/小時(shí))保持不變的不同流入濃度的氫化氰的條件下建立穩(wěn)定狀態(tài)。
限圖表示得到的活性程度和液體培養(yǎng)基中多至(至少)24毫克分子的氰化物濃度之間的線性響應(yīng)。圖中，縱座標(biāo)為以毫克分子為單位標(biāo)定的氰化物濃度，橫座標(biāo)為總活性(如上述定義)。
實(shí)施例4在6000升容積的發(fā)酵罐中，用限定的含葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基，連續(xù)地培養(yǎng)鐮刀菌株CMI 300533，葡萄糖濃度是限制生長的。pH在5.0～5.8，稀釋率0.08～0.1/小時(shí)，溫度在30～32℃。濃度61.5～73.5毫克分子的氰化鈉加入營養(yǎng)液。培養(yǎng)物通過減少通氣率來受氧氣壓力支配導(dǎo)致產(chǎn)生至多0.081克乙醇/升的培養(yǎng)液。超過140小時(shí)產(chǎn)生的生物量在12.2～14.3克/升，氰化物水解酶活性為每分鐘每毫克干重(在pH8.5和20℃下用120毫克分子氰化物溶液測定)產(chǎn)生81.0～122.4微摩爾甲酰胺。
權(quán)利要求
1.一種制備氰化物水解酶的方法，包括步驟(A)在溫度28～34℃，pH4.5～7.5以及稀釋率不大于0.11/小時(shí)的條件下，在含碳和適當(dāng)無機(jī)營養(yǎng)物源的液體培養(yǎng)中，連續(xù)培養(yǎng)需氧微生物菌株。同時(shí)，在發(fā)酵情況下，連續(xù)地把氰離子和/或氰化氫和/或產(chǎn)生氰離子和/或氰化氫的化合物供給當(dāng)量濃度至少為15毫克分子的培養(yǎng)物(完全培養(yǎng)基中的氰離子和/或氰化氫供給培養(yǎng)物)，步驟(B)從培養(yǎng)物回收含氰化物水解酶的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于微生物菌株是鐮刀菌屬的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于菌株是磚紅鐮刀菌株CMI 300533或由此得到的變種和突變體。
4.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求
的方法，其特征在于培養(yǎng)步驟(A)在碳或氧限量，或碳和氧都限量的雙重條件下，培養(yǎng)微生物菌株。
5.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求
的方法，其特征在于碳源是葡萄糖。
6.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求
的方法，其特征在于氰離子和/或氰化氫源以完全培養(yǎng)基當(dāng)量濃度為2～10毫摩爾/克干重細(xì)胞供給培養(yǎng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于氰離子和/或氰化氫源以完全培養(yǎng)基當(dāng)量濃度為4～6毫摩爾/克干重細(xì)胞量供給培養(yǎng)物。
8.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求
的方法，其特征在于pH范圍在5.0～6.0。
9.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求
的方法，其特征在于溫度范圍在30～32℃。
10.一種處理含氰化物材料以降解其中氰化物的方法，其中，該材料用氰化物水解酶或包含氰化物水解酶的組合物處理，其特征在于用本發(fā)明方法制備氰化物水解酶。
專利摘要
一種制備氰化物水解酶的方法，包括在特定的溫度、pH值和稀釋率的條件下連續(xù)培養(yǎng)微生物菌株，同時(shí)，在發(fā)酵情況下，連續(xù)地把氰離子和/或氰化氫和/或產(chǎn)生氰離子和/或氰化氫的化合物供給培養(yǎng)物。微生物最好是鐮刀菌株，特別是磚紅鐮刀菌CMI 300533。
文檔編號C12R1/77GK87100788SQ87100788
公開日1987年9月16日 申請日期1987年2月19日
發(fā)明者肯尼思·雷蒙德·理查森, 彼得·莫里斯·克拉克 申請人:帝國化學(xué)工業(yè)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan