專利名稱：一種固定化漆酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種用螯合樹脂固定化漆酶及其制 備方法和在污水處理方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccases)是一種結(jié)合多個銅離子的蛋白質(zhì)，屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族，廣 泛存在于植物、真菌甚至昆蟲體內(nèi)。漆酶可存活于空氣中，能夠催化包括酚及其衍生物、芳 胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、留體激素和生物色素、金屬有機(jī)化合物、非酚類底物等一 系列底物的氧化反應(yīng)，反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是水，是一種綠色，環(huán)保，作用條件溫和的生物 催化劑，在生物造紙、食品生產(chǎn)、環(huán)境污染治理、有機(jī)合成、生物及免疫檢測等方面具有很強(qiáng) 的應(yīng)用潛力。因此，國內(nèi)外對漆酶的研究已在生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域，分子、細(xì)胞、 生物組織等多水平全面展開。漆酶蛋白一般由500-550個氨基酸構(gòu)成，含19種氨基酸，不同來源的漆酶其氨基 酸序列相似性并不高，最大的共性是含有4個銅離子的活性結(jié)構(gòu)中心，和銅原子連接的cys 和His及其周圍的氨基酸殘基是保守的，這些氨基酸都分布在含有兩對His的N末端區(qū)域， 或是分布于C末端的Cys和其余結(jié)合銅離子的His之間。研究表明，目前提高漆酶酶活效 果最好的金屬離子主要是銅離子。固定化酶技術(shù)，就是將生物酶通過化學(xué)或物理的處理方法固定在固體載體上，使 原來水溶性的酶與固態(tài)的水不溶載體相結(jié)合，用于溶液中的酶促反應(yīng)，反應(yīng)完成后通過簡 單過濾即可與反應(yīng)體系分離，并可以多次重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。20世紀(jì)60年代后，固定 化酶技術(shù)的研究得到了蓬勃的發(fā)展，到目前為止，已研究開發(fā)了多種固定化方法，包括吸附 法、鍵合法、交聯(lián)法和包埋法，各自優(yōu)缺點如表1所示。表1酶的幾種不同固載方法的比較 固定化漆酶技術(shù)以鍵合法和交聯(lián)法研究最為廣泛，為漆酶的廣泛應(yīng)用提供了重要 的理論依據(jù)，但是現(xiàn)有的漆酶固定化方法和載體普遍存在著固定化效率低、加工工藝復(fù)雜、 生產(chǎn)成本高、性質(zhì)不穩(wěn)定等缺陷，很難工業(yè)生產(chǎn)并實際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用螯合樹脂固定化漆酶的方
法及產(chǎn)品。本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供上述固定化漆酶在污水處理方面的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的固定化漆酶是以螯合樹脂為載體，將漆酶通過吸附、螯合作用固 定在該載體上。所述的螯合樹脂，其結(jié)構(gòu)中鍵合有含羧基的活性功能基團(tuán)。其原理如圖1 所示，利用螯合樹脂上的羧基基團(tuán)與漆酶蛋白中的胺基之間的靜電作用，將漆酶蛋白固定 到樹脂上后，漆酶蛋白中的4個銅原子會進(jìn)一步與羧基基團(tuán)配位螯合，從而使漆酶更加穩(wěn) 定的固定在螯合樹脂上。其中，所述的螯合樹脂，其結(jié)構(gòu)中鍵合有含羧基的活性功能基團(tuán)，可以為市售商品 也可以通過常規(guī)方法修飾得到，優(yōu)選為亞氨基羧酸型螯合樹脂和三元含羧基氯醋樹脂。本 發(fā)明所提供的固定化漆酶的制備方法如下(1)將螯合樹脂在乙醇中浸泡3_5h，濾去乙醇后，真空干燥；(2)將干燥后的樹脂放入含漆酶的磷酸緩沖液中(pH = 8. 0)，3_5°C下震蕩吸附 6-12h ；其中大約每Ig樹脂需要200U-500U的漆酶；(3)用pH = 8. 0的磷酸緩沖溶液洗滌，并檢測洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢
出ο本發(fā)明所提供的固定化漆酶可以應(yīng)用于含酚類污染物的污水處理，例如造紙廢水 和工業(yè)染料廢水，實驗表明，本發(fā)明所提供的固定化漆酶2h內(nèi)對2，4，6-三氯酚的去除率在 98%以上。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在于(1)本發(fā)明提供的固定化漆酶，加工工藝簡單，成 本低廉；(2)本發(fā)明提供的固定化方法，漆酶的吸附率高，可以達(dá)到90%以上；(3)本發(fā)明 提供的固定化漆酶，活性損失小，催化效率很高，性質(zhì)穩(wěn)定，可重復(fù)使用；(4)本發(fā)明通過靜 電和螯合雙重作用吸附固定漆酶，比傳統(tǒng)的離子交換吸附法吸附更加牢固，受溫度和PH影 響?。?5)本發(fā)明提供的固定化漆酶，一旦漆酶的活性降低后還可以再生，避免了載體的浪 費。


圖1為金屬螯合樹脂固定化漆酶原理示意圖；圖2為固定化漆酶的操作穩(wěn)定性試驗結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1亞氨基羧酸型螯合樹脂固定化漆酶的制備(1)將IOg市售亞氨基羧酸型螯合樹脂(型號LSC-100)在500ml乙醇中浸泡4h， 濾去乙醇后，真空干燥4h;(2)將干燥后的樹脂放入500ml含3000U漆酶的磷酸緩沖液中(pH = 8. 0)，4°C下震蕩吸附6-12h ；(3)用pH = 8. 0的磷酸緩沖溶液洗滌，并檢測洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢
出ο(4)利用考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)分別測定固定前加入的漆酶量Ml和 固定后洗出液中剩余的漆酶量M2，計算出漆酶的固定化率漆酶的固定化率=[(M1-M2)/ Ml] X 100%。漆酶的固定化率為92%。實施例2三元含羧基氯醋樹脂固定化漆酶的制備(1)將IOg市售三元含羧基氯醋樹脂(型號C42)在500ml乙醇中浸泡4h，濾去乙 醇后，真空干燥4h;(2)將干燥后的樹脂放入500ml含5000U漆酶的磷酸緩沖液中(pH = 8. 0)，4°C下 震蕩吸附6-12h;(3)用pH = 8. 0的磷酸緩沖溶液洗滌，并檢測洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢
出ο(4)利用考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)分別測定固定前加入的漆酶量Ml和 固定后洗出液中剩余的漆酶量M2，計算出漆酶的固定化率漆酶的固定化率=[(M1-M2)/ Ml] X 100%。漆酶的固定化率為86%。實施例3固定化漆酶的熱穩(wěn)定性分別將實施例1中的固定化漆酶和游離漆酶置于70°C水浴中保溫，定時取樣檢測 其氧化愈創(chuàng)木酚的活性，結(jié)果表明游離酶在70°C水浴中保溫Ih后，酶活力明顯下降，4h后 酶活損失達(dá)到99%以上。而固定化漆酶在相同條件下保溫4h酶活僅損失19%，8h時仍保 留酶活56. 5%，顯示酶經(jīng)固定化后其熱穩(wěn)定性得到明顯提高。實施例2的固定化漆酶與此 類似。實施例4固定化漆酶的pH穩(wěn)定性取適量的實施例1中的固定化漆酶，分別懸浮于pH值不同的磷酸緩沖液中，25°C 保溫，每隔一段時間取出測定酶活性。結(jié)果表明，在PH 4.0 9.0范圍內(nèi)，固定化漆酶有較 好的穩(wěn)定性；當(dāng)緩沖液PH低于3. 0時，固定化漆酶活性減少較快，酶的穩(wěn)定性較差。實施例 2的固定化漆酶與此類似。實施例5固定化漆酶處理氯酚類廢水的效果將5g實施例1中的固定化漆酶裝入循環(huán)固定化酶反應(yīng)裝置中，在25 °C條件下半連 續(xù)處理酚類污染物，氧化2，6- 二氯酚和2，4，6-三氯酚，當(dāng)反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行Ih后，有70 %的 2,4,6-三氯酚和47 · 9%的2，6- 二氯酚被氧化；2h后，98%的2，4，6-三氯酚和70%的2， 6- 二氯酚被去除。實施例2的固定化漆酶與此類似。實施例6固定化漆酶的操作穩(wěn)定性將5g實施例1中的固定化漆酶裝入循環(huán)固定化酶反應(yīng)裝置中，在25 °C條件下半連 續(xù)處理酚類污染物，氧化2，6-二氯酚和2，4，6-三氯酚，當(dāng)反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行12批次后，固定化 漆酶酶活仍保持60%以上，結(jié)果如圖2所示。實施例2的固定化漆酶與此類似。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種固定化漆酶，其特征在于，其是以螯合樹脂為載體，將漆酶通過吸附、螯合作用固定在該載體上，所述螯合樹脂的結(jié)構(gòu)中鍵合有含羧基的活性功能基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的固定化漆酶，其特征在于，所述螯合樹脂為亞氨基羧酸型螯合 樹脂和三元含羧基氯醋樹脂。
3. 一種固定化漆酶的制備方法，其特征在于，將經(jīng)過乙醇處理后的螯合樹脂經(jīng)干燥后 放入含漆酶的緩沖液中，震蕩吸附即得固定化漆酶，其中所述螯合樹脂的結(jié)構(gòu)中鍵合有含 羧基的活性功能基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將螯合樹脂在乙醇中浸泡3-5h，濾去乙醇后，真空干燥；(2)將干燥后的樹脂放入含漆酶的pH8.0磷酸緩沖液中，3-5°C下震蕩吸附6-12h ；(3)用磷酸緩沖溶液洗滌，直到洗滌液中沒有蛋白被檢出。
5.權(quán)利要求1或2所述的固定化漆酶在含酚類污染物的污水處理中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述含酚類污染物的污水為造紙廢水或工 業(yè)染料廢水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化漆酶，其是以螯合樹脂為載體，將漆酶通過吸附、螯合作用固定在該載體上，所述螯合樹脂的結(jié)構(gòu)中鍵合有含羧基的活性功能基團(tuán)。本發(fā)明的固定化漆酶能夠應(yīng)用于含酚類污染物的污水處理中，具有加工工藝簡單，成本低廉，漆酶吸附率高，漆酶活性損失小，性質(zhì)穩(wěn)定等特點。
文檔編號C02F103/28GK101914515SQ20101022818
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者劉迎春, 高源 申請人:北京歐凱納斯科技有限公司