專利名稱：：一種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑及其制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高效微生物菌劑及制備和應(yīng)用方法，具體的是一種能促進(jìn)砷超富集植物-蜈蚣草吸收土壤砷的微生物菌劑，屬于環(huán)境修復(fù)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：砷的化合物具有致癌、致畸、致突變等性質(zhì)。砷中毒是以皮膚為主的全身性疾病，它可以危害人體的皮膚、呼吸、消化、泌尿、心血管、神經(jīng)、造血系統(tǒng)等。由于砷污染地下水的開采、含砷農(nóng)藥化肥的使用、金屬冶煉以及礦山開采導(dǎo)致我國大量土地出現(xiàn)嚴(yán)重的砷污染。土壤環(huán)境中的砷通過食物、飲用水和呼吸進(jìn)入人體，超過限量會引起人體砷中毒。近年來我國湖南、廣西、云南等地，均出現(xiàn)過砷污染和砷中毒事件，土壤砷污染問題已成為我國重要的環(huán)境問題之一。目前，砷污染場地修復(fù)已成為各國的研究熱點問題。砷污染場地的植物修復(fù)是治理砷污染有效技術(shù)手段之一。研究報道發(fā)現(xiàn)的砷超富集植物_蜈蚣草以極強(qiáng)的富砷特性和極大的生物量而受到廣泛的關(guān)注。2003年陳同斌等公開了一種治理土壤砷污染的方法(CN1397390A)，該方法通過蜈蚣草根部吸收大量的砷并向上輸送和轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部。2005年陳保東等公開了一種提高砷污染土壤植物修復(fù)效率的方法(CN1633834A)，該方法是對蕨類植物蜈蚣草接種叢枝菌根真菌，使其菌根化。2007年廖曉勇等公開了利用植物修復(fù)砷污染土壤的方法(CN1981947A)，該方法包括有育苗、種植密度和刈割組合的成套技術(shù)，可以提高蜈蚣草的修復(fù)砷污染土壤的修復(fù)效率。經(jīng)過多年的努力，利用蜈蚣草修復(fù)砷污染的土壤已在實踐中取得了成功(廖曉勇等，環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2004)。目前，如何進(jìn)一步提高蜈蚣草修復(fù)效率，拓展植物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用能力是當(dāng)前國內(nèi)外的研究焦點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)解決問題克服現(xiàn)有植物修復(fù)技術(shù)的不足，提供一種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑及其制備和應(yīng)用方法，能夠大大提高蜈蚣草修復(fù)效率，拓展植物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用能力。本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑，所述微生物菌劑為農(nóng)桿菌屬Agrobacteriumsp.C13發(fā)酵的菌液與復(fù)合載體按質(zhì)量百分比0.51:l混合制備而成；所述復(fù)合載體為草炭上、稻殼、鋸術(shù)和活性炭，它們細(xì)度均為60目，按質(zhì)量百分比30:2530:2530:15混合而成。復(fù)合載體的微生物吸附量達(dá)到1091012個/克。所述的農(nóng)桿菌屬Agrobacteriumsp.C13發(fā)酵菌液是在高氏一號培養(yǎng)基中發(fā)酵1824h，發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、二級三角瓶液體培養(yǎng)、三級發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵后菌液中菌數(shù)為1091012個/mL?！N強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑的制備方法，步驟如下3蛋白胨0.5%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5%、pH7.07.2，將培養(yǎng)基裝入試管；無菌；將農(nóng)桿菌屬Agrobacteriumsp.C13接種；在28。C下培養(yǎng)18_24h保存?zhèn)溆?；b.二級三角瓶液體培養(yǎng)在步驟a中一級斜面培養(yǎng)基主料中去掉瓊脂，作為二級培養(yǎng)主料，PH7.07.2，將培養(yǎng)基裝入三角瓶，滅菌冷卻后，把斜面菌液接種至液體培養(yǎng)基；在28t:下振蕩培養(yǎng)18-24h，終止培養(yǎng)，備用；c.三級發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)主料與二級培養(yǎng)主料相同，將二級培養(yǎng)液按15%的接種量接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件為罐溫3035t:、罐壓0.020.05MPa通氣量l:lv/v/min、攪拌速度300350轉(zhuǎn)/min、發(fā)酵時間2436h，生產(chǎn)出來的發(fā)酵液備用；(2)將草炭土、稻殼、鋸末、活性炭，用高速粉碎機(jī)粉碎過60目，然后按照按質(zhì)量百分比30:2530:2530:15混合而成；(3)將步驟(1)中得到的發(fā)酵液與步驟(2)中的復(fù)合載體按質(zhì)量百分比0.5i:i的比例均勻混合。—種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑的應(yīng)用方法，將制備好的的微生物菌劑按5g/kg土用量施加到應(yīng)用蜈蚣草修復(fù)的砷污染場地中。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(1)本發(fā)明以草炭土、鋸末、稻殼、活性炭4種材料為載體，它們都具有來源廣泛、成本低廉、使用方便、保藏期長等優(yōu)點，制備方法簡單，易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，因而能被廣泛推廣應(yīng)用。(2)本發(fā)明提高了微生物菌劑的質(zhì)量、篩選出來的復(fù)合載體與現(xiàn)有的單一菌劑載體相比，有效活菌數(shù)明顯增多。(3)本發(fā)明選用的菌種生長、繁殖能力及適應(yīng)性較強(qiáng)，并能保證在砷污染環(huán)境中對蜈蚣草吸砷能力有較大的促進(jìn)作用。(4)本發(fā)明將制備好的菌劑按5g/kg土用量施加到應(yīng)用蜈蚣草修復(fù)的砷污染場地中，修復(fù)植物地上部生物量提高了16_17%，場地中砷的去除率比對照提高了40-41%。(5)本發(fā)明解決了液態(tài)菌劑保存和運(yùn)輸都不方便的問題，將微生物制劑制成固體菌劑，以便于工程應(yīng)用。圖1為不同載體菌含量隨時間的變化；圖2為蜈蚣草地上部生物量；圖3為土壤中砷的去除量。具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明實施例1強(qiáng)化修復(fù)的菌劑制備(1)菌種發(fā)酵a.—級斜面培養(yǎng)蛋白胨O.5%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5%、pH為7.2，將培養(yǎng)基裝入試管；無菌；將農(nóng)桿菌屬Agrobacteri咖sp.C13接種；在28。C下培養(yǎng)24h保存?zhèn)溆?；b.二級三角瓶液體培養(yǎng)在步驟a中一級斜面培養(yǎng)基主料中去掉瓊脂，作為二級培養(yǎng)主料，pH為7.2，將培養(yǎng)基裝入三角瓶，滅菌冷卻后，把斜面菌液接種至液體培養(yǎng)基；在2『C下振蕩培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)，備用；c.三級發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)主料與二級培養(yǎng)主料相同，將二級培養(yǎng)液按15%的接種量接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件為罐溫3(TC、罐壓0.03MPa通氣量1:lv/v/min、攪拌速度300轉(zhuǎn)/min、發(fā)酵時間36h，生產(chǎn)出來的發(fā)酵液備用；(2)載體原料獲取草炭土、稻殼、活性炭購自北京市花卉市場，鋸末取自北京市房山區(qū)。(3)不同復(fù)合載體比較草炭土、稻殼、鋸末、活性炭，用高速粉碎機(jī)粉碎過60目。按照表l所述比例混合，滅菌備用。將發(fā)酵液與各比例復(fù)合載體按質(zhì)量百分比0.51:1的比例均勻混合。在不同時間段內(nèi)檢測不同配比復(fù)合載體有效活菌數(shù)量。結(jié)果如圖l所示，5種復(fù)合載體菌含量總體變化規(guī)律是一致的，即都表現(xiàn)出隨時間先減少后增多。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是因為由于微生物從液體環(huán)境到固體環(huán)境，微生物處在生長停滯期，造成接菌后的兩天中菌數(shù)迅速下降。當(dāng)微生物逐漸適應(yīng)載體環(huán)境后迅速繁殖，菌含量急劇增加，這時微生物處在快速生長期，生長第六天趨于穩(wěn)定。復(fù)合載體4和5的有效活菌數(shù)最多，效果最好。即載體中草炭土、鋸末、稻殼、活性炭的質(zhì)量百分比為30:2530:2530:15是最佳比例。表1復(fù)合載體的配比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(4)菌劑制備將最佳比例載體與發(fā)酵液按照比例混合，無菌條件下風(fēng)干水分保持在30%左右，以松散不結(jié)塊為準(zhǔn)，分裝備用。實施例2，微生物菌劑室內(nèi)實施用上述方法制備的菌劑進(jìn)行室內(nèi)盆栽實驗。菌劑中有效活菌量1091012個/克。具體實施方法為在lkg高砷土中施加5g菌劑，混合均勻后，裝入盆中，移栽蜈蚣草幼苗。種植兩個月后，收獲。從圖2可以看出，施加菌劑后蜈蚣草地上部生物量干重達(dá)到2.lg，比對照提高16%。從如圖3可以看出蜈蚣草地上部砷富集量達(dá)到3.lmg，比對照提高了41%。從以上實驗結(jié)果可以看出，施加耐砷菌劑，明顯促進(jìn)了蜈蚣草的生長，且蜈蚣草地上部富集砷的量也明顯增加，砷污染土壤的植物修復(fù)效率明顯提高。權(quán)利要求一種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑，其特征在于所述微生物菌劑為農(nóng)桿菌屬Agrobacteriumsp.C13發(fā)酵的菌液與復(fù)合載體按質(zhì)量百分比0.5～1∶1混合制備而成；所述復(fù)合載體為草炭土、稻殼、鋸末和活性炭，它們細(xì)度均為60目，按質(zhì)量百分比30∶25～30∶25～30∶15混合而成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑，其特征在于所述的農(nóng)桿菌屬Agrobacteriumsp.C13是用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的，發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)過一級斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、二級三角瓶液體培養(yǎng)、三級發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵后菌液中菌數(shù)為1091012個/mL。3.—種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑的制備方法，其特征在于步驟如下(1)菌種發(fā)酵a.—級斜面培養(yǎng)基主料配方為蛋白胨0.5%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5%、pH7.07.2，將培養(yǎng)基裝入試管；無菌；將農(nóng)桿菌屬Agrobacteriumsp.C13接種；在28。C下培養(yǎng)18_24h保存?zhèn)溆?；b.二級三角瓶液體培養(yǎng)在步驟a中一級斜面培養(yǎng)基主料中去掉瓊脂，作為二級培養(yǎng)主料，pH7.07.2，將培養(yǎng)基裝入三角瓶，滅菌冷卻后，把斜面菌液接種至液體培養(yǎng)基；在2『C下振蕩培養(yǎng)18-24h，終止培養(yǎng)，備用；c.三級發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)主料與二級培養(yǎng)主料相同，將二級培養(yǎng)液按15%的接種量接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件為罐溫3035t:、罐壓0.020.05MPa通氣量l:lv/v/min、攪拌速度300350轉(zhuǎn)/min、發(fā)酵時間2436h，生產(chǎn)出來的發(fā)酵液備用；(2)將草炭土、稻殼、鋸末、活性炭，用高速粉碎機(jī)粉碎過60目，然后按照按質(zhì)量百分比30:2530:2530:15混合而成；(3)將步驟(1)中得到的發(fā)酵液與步驟(2)中的復(fù)合載體按質(zhì)量百分比0.51:1的比例均勻混合。4.一種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑的應(yīng)用方法，其特征在于將制備好的權(quán)利要求1所述的微生物菌劑按5g/kg土用量施加到應(yīng)用蜈蚣草修復(fù)的砷污染場地中。全文摘要一種強(qiáng)化植物修復(fù)砷污染場地的微生物菌劑及制備方法和應(yīng)用方法，屬于環(huán)境修復(fù)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。所述菌劑所使用的菌種為農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumsp.C13)。該菌劑采用復(fù)合載體，其成分包括草炭土、鋸末、稻殼、活性炭，其質(zhì)量百分比為30∶25～30∶25～30∶15。微生物發(fā)酵液與復(fù)合載體按照質(zhì)量比0.5～1∶1混合配比，復(fù)合載體的微生物吸附量達(dá)到109～1012個/克。將制備好的菌劑按5g/kg土用量施加到應(yīng)用蜈蚣草修復(fù)的砷污染場地中，修復(fù)植物地上部生物量提高了16-17％，場地中砷的去除率比對照提高了40-41％。本發(fā)明的菌劑載體原料豐富，制備方法簡單，易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號B09C1/00GK101735997SQ200910242389公開日2010年6月16日申請日期2009年12月10日優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日發(fā)明者廖曉勇,朱崗輝,閻秀蘭申請人:中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所