利用RORγt為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用RORγt為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，包括如下步驟：制備淋巴細(xì)胞懸液或外周血單個核細(xì)胞，然后加入同種類熒光標(biāo)記的CD3、CD19、CD11c、Gr-1和NKp46抗體，孵育，PBS洗滌，得洗滌細(xì)胞；將洗滌細(xì)胞固定、清洗、離心，然后進(jìn)行打孔，經(jīng)染色后加入與上述不同熒光標(biāo)記的RORγt抗體，避光反應(yīng)后清洗細(xì)胞，離心，最后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選CD3、CD19、CD11c、Gr-1CD4、NKp46陰性、RORγt陽性的細(xì)胞，得LTi細(xì)胞，利用此方法分選LTi細(xì)胞，其方法簡單，分選獲得的LTi細(xì)胞純度高，達(dá)95.7%。
【專利說明】利用ROR Y t為標(biāo)記物分選LT i細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞分選領(lǐng)域，具體涉及利用ROR Y t為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞(lymph tissue inducer cell, LTi)是先天性淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells, ILc)的一個亞群,能抑制對自身或外源抗原有害的免疫反應(yīng),分泌多種消除炎癥的細(xì)胞因子，在多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病中扮演了重要角色。LTi細(xì)胞主要分布于人和動物的淋巴結(jié)中，如腸系淋巴結(jié)中，脾臟內(nèi)也有存在，其它器官和外周血中也有存在，但數(shù)量有限。
[0003]ROR Y t (Retinoid related orphan receptor gamma t)是 LTi 細(xì)胞主要表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是LTi細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，但是ROR Yt定為于細(xì)胞內(nèi)。并且Thl7、ILc22等細(xì)胞也表達(dá)RORy t。因此，現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行LTi細(xì)胞的流式細(xì)胞分選時，通常會選取CD3、CD56、CD117、CD127等多色表面標(biāo)記，抗體熒光過多，不僅使得細(xì)胞標(biāo)記復(fù)雜化，實驗過程太長，也影響了最終分選LTi細(xì)胞的純度。因此，需要一種簡單分選LTi細(xì)胞的方法，使其獲得的TLi的純度更高，也便于后續(xù)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用ROR Y t為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)分選LTi細(xì)胞純度相對較低的技術(shù)問題。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為:
[0006]利用ROR Y t為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，具體步驟如下:
[0007]A.制備淋巴細(xì)胞懸液或外周血單個核細(xì)胞；
[0008]B.將步驟A所得淋巴細(xì)胞懸液或外周血單個核細(xì)胞加入同種熒光標(biāo)記的⑶3、⑶19、⑶Ilc、Gr-1和NKp46抗體，孵育，PBS洗滌，得洗滌細(xì)胞；
[0009]C.將步驟B所得洗滌細(xì)胞固定、清洗、離心，然后進(jìn)行打孔，經(jīng)染色后加入另一種熒光標(biāo)記的ROR Y t抗體,避光反應(yīng)后清洗細(xì)胞,離心，得ROR Y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞；
[0010]D.將步驟C所得ROR Y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞重懸后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選⑶3、CD19、CDllc、Gr-lCD4、NKp46 陰性，ROR Y t 陽性的細(xì)胞，得 LTi 細(xì)胞。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟A中，淋巴細(xì)胞懸液按如下方法制備，分離淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟或肝臟組織，用PBS清洗后切割成組織塊，放入37°C、不含鈣和鎂離子、含5mM EDTA的Hanks液中洗滌25分鐘，然后離心除去表皮細(xì)胞，再加入膠原酶II1、DNA酶I和中性蛋白酶在37°C下消化30分鐘后用PBS清洗，然后用細(xì)胞篩過濾，離心，得到淋巴細(xì)胞懸液。
[0012]更優(yōu)選的，加入膠原酶II1、DNA酶I和中性蛋白酶的量為加入后溶液中膠原酶
II1、DNA酶I和中性蛋白酶的終濃度分別為1.0mg/mL、0.02mg/mL、0.lmg/mL。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟A中，外周血單個核細(xì)胞按如下方法制備，收集濃縮的白細(xì)胞，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液分離，得到外周血單個核細(xì)胞。[0014]優(yōu)選的，所述步驟B中，所述孵育是在溫度為10_28°C條件下孵育15分鐘。
[0015]更優(yōu)選的，所述步驟C是將步驟B所得洗滌細(xì)胞加入淋巴細(xì)胞固定液中固定45分鐘；再用洗滌液清洗、離心；然后用淋巴細(xì)胞打孔液重懸細(xì)胞，避光孵育30分鐘，加洗滌液，離心，收集沉淀；加入染色液重懸細(xì)胞后用熒光標(biāo)記的ROR Yt抗體，在10-28°C條件下避光反應(yīng)30分鐘,加入洗漆液清洗細(xì)胞,離心,得ROR Y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了利用RORYt為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，其方法簡單，通過雙色流式分選，即用同種熒光標(biāo)記⑶3、⑶19、⑶Ilc、Gr-1和NKp46抗體孵育后，將細(xì)胞穿孔，再用另一種熒光標(biāo)記的ROR Y t抗體結(jié)合，最后篩選CD3、CD19、⑶Ilc、Gr-1、NKp46雙陰性，ROR Yt陽性的細(xì)胞即為LTi細(xì)胞，利用此方法獲得的細(xì)胞純度高，其純度大于95.0%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0018]圖1為利用ROR Y t為標(biāo)記物分選細(xì)胞的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0019]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0020]實施例1
[0021]利用ROR Y t為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0022]A.分離小鼠淋巴結(jié)組織，用無菌PBS清洗后切割成0.5立方厘米的組織塊，放入37°C，在含5mM EDTA的Hanks (不含鈣、鎂離子)中洗滌25分鐘，在IOOOrpm/分鐘條件下離心10分鐘以除去表皮細(xì)胞，再加入膠原酶II1、DNA酶I和中性蛋白酶至終濃度分別為
1.0mg/mL、0.02mg/mL、0.lmg/mL，在37°C下消化30分鐘后用PBS清洗，然后用300目細(xì)胞篩過濾，離心，得到淋巴細(xì)胞懸液；
[0023]B.將步驟A所得到淋巴細(xì)胞懸液加入PE (藻紅蛋白或藻膽色素蛋白，Phycoerythrin)熒光標(biāo)記的 CD3、CD19、CDllc、Gr_l、NKp46 抗體，在溫度為 10_28°C條件下孵育15分鐘，PBS洗滌細(xì)胞三次，得洗滌細(xì)胞；
[0024]C.將步驟B所得洗滌細(xì)胞加入ImL淋巴細(xì)胞固定液(固定液是2% (w/v)多聚甲醛的濃度為0.0lM PBS溶液)固定45分鐘；用ImL洗滌液清洗(購自美國eBioscience公司，貨號為00-8333-56)后在1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘；收集沉淀，并用ImL淋巴細(xì)胞打孔液(購自美國eBioscience公司，貨號:00-5123_43，00-5223-56)重懸細(xì)胞，避光孵育30分鐘,然后加入2mL洗漆液,在1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘,收集沉淀；向沉淀中加入APC (藍(lán)色熒光色)標(biāo)記的ROR Y t抗體，室溫避光反應(yīng)30分鐘，再加入2mL洗滌液清洗細(xì)胞，并于1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘，得ROR y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞；
[0025]D.將步驟C所得RORYt抗體標(biāo)記的細(xì)胞加入ImL細(xì)胞染色液(購自美國eBioscience公司，貨號為00-8333-56)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選CD3、CD19、CDllc、Gr-l、NKp46陰性，RORyt陽性的細(xì)胞，得LTi細(xì)胞。
[0026]其分選結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，按本發(fā)明的方法分選得到的LTi細(xì)胞的純度高，達(dá)95.7%。
[0027]實施例2
[0028]利用ROR Y t為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0029]A.收集外周血細(xì)胞，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液分離，得到外周血單個核細(xì)胞(PBMC);
[0030]B.將步驟A所得PBMC，加入PE熒光標(biāo)記的CD3、CD19、CDllc、Gr_l、NKp46五種抗體，在溫度為10-28°C條件下孵育30分鐘，PBS洗滌細(xì)胞三次，得洗滌細(xì)胞；
[0031]C.將步驟B所得洗滌細(xì)胞加入ImL淋巴細(xì)胞固定液(2%多聚甲醛(w/v)0.0lM PBS溶液)固定45分鐘；再用ImL洗滌液清洗(購自美國eBioscience公司，貨號為00-8333-56)后在1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘；收集沉淀，沉淀用ImL淋巴細(xì)胞打孔液(購自美國eBioscience，貨號:00-5123_43，00-5223-56)重懸細(xì)胞，避光孵育30分鐘，然后加2mL洗滌液，在1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘，收集沉淀；向沉淀中加入0.1mL染色液(購自美國eBioscience公司，貨號00-8333-56)重懸細(xì)胞，再加入APC熒光標(biāo)記的ROR y t抗體，室溫避光反應(yīng)30分鐘，然后加入2mL洗滌液(購自美國eBioscience公司，貨號00-8333-56)清洗細(xì)胞，并于1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘,得RORy t抗體標(biāo)記的細(xì)胞；
[0032]D.將步驟C所得ROR Y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞加入ImL細(xì)胞染色液(購自美國eBioscience公司，貨號00-8333-56)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選CD3、CD19、CDllc、Gr-l、NKp46陰性，ROR Y t陽性的細(xì)胞，得LTi細(xì)胞。
[0033]實施例3
[0034]利用ROR Y t為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0035]A.分離小鼠扁桃體組織，用無菌PBS清洗后切割成0.5平方厘米的組織塊，放入37°C、不含鈣和鎂離子的、含5mM EDTA的Hanks液中洗滌25分鐘，然后在600rpm/分鐘條件下離心10分鐘以除去表皮細(xì)胞，再加入膠原酶II1、DNA酶I和中性蛋白酶至終濃度分別為1.0mg/mL,0.02mg/mL、0.lmg/mL，在37°C下消化30分鐘后用PBS清洗，然后用細(xì)胞篩(100目)過濾，離心，得到淋巴細(xì)胞懸液；
[0036]B.將步驟A所得淋巴細(xì)胞懸液，加入PE熒光標(biāo)記的CD3、CD19、CDllc、Gr-1、Kp46五種抗體，在溫度為10-28°C條件下孵育30分鐘，PBS洗滌細(xì)胞三次，得洗滌細(xì)胞；
[0037]C.將步驟B所得洗滌細(xì)胞加入ImL淋巴細(xì)胞固定液(2%(w/v)多聚甲醛0.0lM PBS溶液)固定45分鐘；再用ImL洗滌液清洗(購自美國eBioscience公司，貨號:00-8333-56)后在1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘；收集沉淀，沉淀用ImL淋巴細(xì)胞打孔液(購自美國eBioscience公司，貨號:00-5123_43，00-5223-56)重懸細(xì)胞，避光孵育30分鐘，然后加2mL洗滌液，在1700rpm/分鐘條件下離心10分鐘，收集沉淀；沉淀加入0.1mL染色液(購自美國eBioscience公司，貨號00-8333-56)重懸細(xì)胞，加入APC熒光標(biāo)記的ROR y t抗體，然后室溫避光反應(yīng)30分鐘，加入2mL洗滌液(購自美國eBioscience公司，貨號00-8333-56)清洗細(xì)胞，1700rpm/分鐘,離心10分鐘,得RORy t抗體標(biāo)記的細(xì)胞；
[0038]D.將步驟C所得ROR Y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞加入ImL細(xì)胞染色液(購自美國eBioscience公司，貨號00-8333-56)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選CD3、CD19、CDllc、Gr-l、NKp46陰性，RORyt陽性的細(xì)胞，得LTi細(xì)胞。
[0039]本發(fā)明中還可以用脾臟、肝臟等含有淋巴細(xì)胞按實施例1中步驟A的方法分離淋巴細(xì)胞。[0040]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.利用RORYt為標(biāo)記物分選LTi細(xì)胞的方法，其特征在于，具體步驟如下: A.制備淋巴細(xì)胞懸液或外周血單個核細(xì)胞； B.將步驟A所得淋巴細(xì)胞懸液或外周血單個核細(xì)胞加入同種熒光標(biāo)記的⑶3、⑶19、⑶I lc、Gr-1和NKp46抗體，孵育，PBS洗滌，得洗滌細(xì)胞； C.將步驟B所得洗滌細(xì)胞固定、清洗、離心，然后進(jìn)行打孔，經(jīng)染色后加入另一種熒光標(biāo)記的ROR Y t抗體,避光反應(yīng)后清洗細(xì)胞,離心,得ROR Y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞； D.將步驟C所得RORY t抗體標(biāo)記的細(xì)胞重懸后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選⑶3、⑶19、CDllc、Gr-lCD、NKp46陰性，RORyt陽性的細(xì)胞，得LTi細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟A中，淋巴細(xì)胞懸液按如下方法制備，分離淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟或肝臟組織，用PBS清洗后切割成組織塊，放入37°C、不含鈣和鎂離子、含5mM EDTA的Hanks液中洗滌25分鐘，然后離心除去表皮細(xì)胞，再加入膠原酶II1、DNA酶I和中性蛋白酶在37°C下消化30分鐘后用PBS清洗，然后用細(xì)胞篩過濾，離心,得到淋巴細(xì)胞懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:加入膠原酶II1、DNA酶I和中性蛋白酶的量為加入后溶液中膠原酶II1、DNA酶I和中性蛋白酶的終濃度分別1.0mg/mL、0.02mg/mL 和 0.lmg/mL0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟A中，外周血單個核細(xì)胞按如下方法制備，收集濃縮的白細(xì)胞，經(jīng)人淋巴細(xì)胞分離液分離，得到外周血單個核細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟B中，所述孵育是在溫度為10-28 °C條件下孵育15分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于:所述步驟C是將步驟B所得洗滌細(xì)胞加入淋巴細(xì)胞固定液中固定45分鐘；再用洗滌液清洗、離心；然后用淋巴細(xì)胞打孔液重懸細(xì)胞，避光孵育30分鐘，加洗滌液，離心，收集沉淀；加入染色液重懸細(xì)胞后用另一種熒光標(biāo)記的ROR Y t抗體，在10-28°C條件下避光反應(yīng)30分鐘，加入洗滌液清洗細(xì)胞，離心，得ROR Y t抗體標(biāo)記的細(xì)胞。
【文檔編號】G01N15/14GK103698261SQ201410006630
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】田志強(qiáng), 倪兵, 吳玉章, 田易, 楊玓, 顏秋萍, 倪東京, 張軼, 張夢潔, 楊爽, 朱小霜 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)