一種特異性標(biāo)記的辣椒素?zé)晒馓结樇捌浜铣煞椒ê蛻?yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種特異性標(biāo)記的辣椒素巧光探針及其合成方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)和功能對(duì)生命體的運(yùn)動(dòng)有著十分重要的意義。研究蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)學(xué)的手段包括巧光光譜、核磁共振、電子顯微鏡、X射線晶體衍射等。其中，蛋白 質(zhì)的巧光檢測(cè)法具有標(biāo)記位點(diǎn)方法靈活、靈敏度高、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)得到廣泛應(yīng)用。然 而，目前全世界僅有少數(shù)機(jī)構(gòu)具備能力采用巧光標(biāo)記配體探針來(lái)研究離子通道結(jié)構(gòu)功能的 動(dòng)態(tài)過(guò)程，其技術(shù)原理是在配體特定位點(diǎn)標(biāo)記上巧光探針，并明確該巧光標(biāo)記探針仍然具 有功能。隨后，通過(guò)檢測(cè)該探針與受體膜蛋白之間的結(jié)合和解離效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)解析該通道蛋白 激活和失活的動(dòng)態(tài)過(guò)程。目前，運(yùn)種巧光標(biāo)記技術(shù)尚處于該領(lǐng)域前沿，已經(jīng)越來(lái)越受到廣泛 關(guān)注。 睛劇TRPVl通道又被稱為辣椒素受體，是一個(gè)配體口控的非選擇性陽(yáng)離子通道，可W被 各種外因性及內(nèi)因性的物理及化學(xué)刺激所激發(fā)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及末梢 神經(jīng)系統(tǒng)上，設(shè)及溫覺、痛覺的傳遞和調(diào)制W及整合各種疼痛信息等重要的生理功能。已知 主要的TRPVl內(nèi)源性配體為辣椒素，它本身不具備巧光特性，且目前尚無(wú)辣椒素類巧光配 體，無(wú)法對(duì)TRPVl通道的激活和失活等口控過(guò)程進(jìn)行可視化動(dòng)態(tài)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決目前TRPVl通道蛋白缺乏特異性巧光探針配體的問題，本發(fā)明將7-硝基 苯并巧咱（NBD)巧光基團(tuán)引入TRPVl的特異性配體辣椒素類似物，成功合成了一種新型的 特異性標(biāo)記的辣椒素巧光探針。
[0005] 首先，本發(fā)明公開了一種特異性標(biāo)記的辣椒素巧光探針，結(jié)構(gòu)如式（III):
[0006]
陽(yáng)007]其中，R=(邸2)2,（邸2)3,（邸2)4,（邸2)5,（邸2)6,（邸2)7,（邸2)8,（邸2)9,（邸2)1〇或(CHz) 11。其激發(fā)波長(zhǎng)在450-480皿之間，發(fā)射波長(zhǎng)在510-540皿之間。
[0008] 由于N抓巧光基團(tuán)在脂溶性壞境中的巧光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于水溶性環(huán)境，該特征可顯 著增強(qiáng)目標(biāo)化合物與膜蛋白受體TRPVl結(jié)合時(shí)的巧光強(qiáng)度。
[0009] 其次，本發(fā)明還提供了特異性標(biāo)記的辣椒素巧光探針的合成方法。合成路線如下 式所示，將化合物I和化合物II在HOBT，DCC，DMP催化下在有機(jī)溶劑中縮合而成。
[0011] 其中，R= (CH2)2, (CH2)3, (CH2)4,（CHz)S, (CHz)S, (C&)7,（CHz)S, (CH2)9, (CHz)IO或 畑 2) 11。
[0012] 所述的有機(jī)溶劑為N，N-二甲基甲酯胺、乙臘、二氧六環(huán)、丙酬、氯仿、二氯甲燒、甲 醇和乙醇的一種或多種，或上述溶劑的任意比例混合，優(yōu)選為N，N-二甲基甲酯胺。
[0013] 優(yōu)選的，具體方法為：取1當(dāng)量化合物I與1當(dāng)量化合物II，溶于DMF中，加入1當(dāng) 量的冊(cè)BT、1當(dāng)量的DCC、0. 1當(dāng)量的DMAP，室溫?cái)埌?4小時(shí)；除去有機(jī)溶劑，柱層析，用二 氯甲燒：甲醇=10 :1洗脫，得到相應(yīng)的化合物III。
[0014] 另外本發(fā)明還提供了特異性標(biāo)記的辣椒素巧光探針用于TRPVl通道蛋白的特異 性巧光標(biāo)記的用途。
[0015] 本發(fā)明設(shè)及一種新型的運(yùn)用于瞬時(shí)感受器電位香草酸受體Utransient receptorpotentialvanilloid!,TRPV1)通道蛋白激活的脂溶性巧光探針及其合成方 法。該類化合物是WTRPVl的特異性配體辣椒素結(jié)構(gòu)類似物修飾巧光基團(tuán)7-硝基苯并巧 咱（NBD)而成，具有良好的脂溶性，較長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)，同時(shí)具有合成簡(jiǎn)便、標(biāo)記溫和等優(yōu)點(diǎn)， 特別是該類化合物在脂溶性和水溶性環(huán)境中的巧光強(qiáng)度的差異，為膜蛋白口控過(guò)程中構(gòu)象 變化的研究提供了良好的工具。作為一種有效的巧光探針，該類化合物可W用于配體結(jié)合 TRPVl通道蛋白的特異性巧光標(biāo)記，對(duì)解析TRPVl通道激活和失活等口控的動(dòng)態(tài)過(guò)程有著 重要的幫助。該類探針的激發(fā)波長(zhǎng)在450-480nm之間，發(fā)射波長(zhǎng)在510-540nm之間，通過(guò)對(duì) 該系列不同鏈長(zhǎng)辣椒素類似物的使用，可W對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)學(xué)特征、及生物學(xué)功能進(jìn) 行更精確的描述。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1轉(zhuǎn)染TRPVl蛋白表達(dá)的肥K293細(xì)胞，于記錄第10秒給予化合物III，TRPVl通 道被激活的電流圖；于第28秒灌洗除去化合物III，通道關(guān)閉電流消失；
[0017] 圖2轉(zhuǎn)染TRPVl蛋白表達(dá)的肥K293細(xì)胞，于記錄第10秒給予化合物III，該化合物 與膜上TRPVl通道結(jié)合，細(xì)胞巧光強(qiáng)度增加；于第28秒灌洗除去化合物III，細(xì)胞巧光強(qiáng)度逐 漸減弱直至消失；
[0018] 圖3轉(zhuǎn)染TRPVl蛋白表達(dá)的肥K293細(xì)胞，于記錄第10秒給予化合物III，該化合物 與膜上TRPVl通道結(jié)合，單細(xì)胞巧光成像顯示細(xì)胞巧光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；于第28秒灌洗除去 化合物III，單細(xì)胞巧光成像顯示細(xì)胞巧光強(qiáng)度逐漸減弱直至消失。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，W下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 下列實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。W下實(shí)施例中所需要的材 料或試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明均為市場(chǎng)購(gòu)得。 陽(yáng)02U 儀器：
[0022] 核磁共振儀度rukerAM400型核磁共振儀） 陽(yáng)〇2引巧光分光光度計(jì)（日本島津公司，RF-5301PC)
[0024] S用紫外分析儀（上海精科物理光學(xué)儀器廠，ZF-IS用紫外分析儀）
[00巧]AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司陽(yáng)0%] 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（南京科爾儀器設(shè)備有限公司，RE-1302BV-G2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器）
[0027] 集熱式磁力攬拌器（上海予英儀器有限公司，DF-IOlS(數(shù)顯自動(dòng)恒溫?cái)埌杵鳎?陽(yáng)02引試劑：
[0029] 香草醒（阿拉下試劑，AR,>98% )
[0030] 鹽酸徑胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR,>98%) 陽(yáng)0川 6-氨基己酸（阿拉下試劑，AR, 98%)
[0032] 4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并巧咱（NBD-Cl) (Sigma,AR, >99%) 陽(yáng)03引 1-徑基苯并S挫（冊(cè)BT)(阿拉下試劑，AR, > 97%)
[0034] 二環(huán)己基碳二亞胺值CC)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR, > 95%) 陽(yáng)0對(duì) 4-二甲氨基化晚值MAP)(阿拉下試劑，AR,>97%)
[0036]N，N-二甲基甲酯胺值MF)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR,>9