一種熒光探針及其制備方法、應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學領域，特別涉及一種熒光探針及其制備方法、應用。
【背景技術】
[0002] 0 _半乳糖苷酶是能夠催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖的酶，在腎近曲小管上皮 細胞中含量較高。醫(yī)學上，尿中半乳糖苷酶活性可反映腎實質，特別是腎小管的早期損 傷。實驗室研宄中，半乳糖苷酶基因（lacZ)常作為報告基因，通過檢測半乳糖苷 酶的表達水平來監(jiān)測目的基因的表達情況。因此，半乳糖苷酶的檢測具有重要意義。
[0003] 目前比較成熟的方法是通過光度法檢測。其檢測的顯色底物包含對-硝基苯 基-0-D-半乳糖苷（Biochemical，1960, 209)、4_甲基扇形酮基-0-D-半乳糖苷（J Organ Chem，1962, 27,1074)、氯酚紅基--D-半乳糖苷等。光度法檢測存在靈敏度低，操作流程 復雜等缺點?？蒲泄ぷ髡咴趯嶒炇已绣持袑毎邪肴樘擒彰笝z測靈敏度、操作便捷 性、檢測效果要求較高，常用的分光度法不能很好的滿足這些要求。通過熒光檢測探針能夠 很好的滿足實驗室研宄的需求。
[0004] e -半乳糖苷酶熒光檢測探針的基本原理主要是熒光發(fā)色團和半乳糖通過糖苷鍵 結合，在半乳糖苷酶作用下將糖苷鍵切斷，熒光發(fā)色團的結構發(fā)生變化從而產(chǎn)生熒光 的變化。通過檢測熒光的變化來定性和定量的檢測e-半乳糖苷酶。Ralp將DDA0(7-hydr oxy-9H_(l, 3-dichloro_9, 9-dimethylacridin_2-〇ne))焚光染料和半乳糖鏈接，發(fā)現(xiàn)在加 入0 _半乳糖苷酶后，最大發(fā)射波長紅移了近50nm，加入熒光探針后，在表達lacZ基因的細 胞里和陰性對照細胞有明顯的熒光變化（CANCER RESEARCH，2004,64,1579 - 1583)。Helen 合成了基于螢火蟲熒光素的熒光探針，在lacZ基因和螢火蟲熒光素基因雙表達的細胞里 加入熒光探針后，發(fā)現(xiàn)熒光強度和半乳糖苷酶的量成正相關的關系（NATURE METHODS， 2006, 3,295-301)。16丨811〇 Nagano合成了基于焚光共振能量轉移的0-半乳糖苷酶焚光探 針，在加入酶前后熒光由綠色變成藍色（J. AM. CHEM. S0C. 2006, 128, 15946-15947)。
[0005] 現(xiàn)有一些已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的熒光探針，其中有一些品牌AAT Bioquest?: Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit*Green Fluorescence*, SensoLyte? MUG 0-Galactosidase Assay Kit*Fluorimetric*， abeam? Beta Galactosidase Detection試劑盒（Fluorometric)等，美國生命技術（Life technologies)公司生產(chǎn)的 Fluorescein Di-0-D_Galactopyranoside(FDG)售價達到 5 毫克 3576 元人民幣。這些焚 光探針存在的一個很大的問題就是合成復雜，需要極大的成本，所以售價居高不下。另一個 問題是熒光基團的水溶性太差，在正常細胞生理環(huán)境下溶解較難。這些因素限制了 半 乳糖苷酶熒光探針的廣泛應用。
[0006] 因此，通過較少的合成步驟，較低的成本制備效果較好的半乳糖苷酶熒光探 針具有重要社會價值和經(jīng)濟效益。
[0007] 脂酶，是一種催化脂類的酯鍵水解反應的水溶性酶，能夠逐步的將甘油三酯水解 成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的動、植物和微生物（如霉菌、細菌等）組織中， 已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑等行業(yè)。特別是在食品行業(yè)中得到了大量的應用，并逐漸 成為食品領域中應用最為廣泛的酶類之一。同時，在醫(yī)學上血清脂肪酶活性測定可用于胰 腺疾病診斷，特別是在急性胰腺炎時，發(fā)病后4~8h內血清脂肪酶活性升高，24h達峰值，一 般持續(xù)8~14天。開發(fā)便捷靈敏的脂肪酶檢測方法具有重要的意義。
[0008] 常用的脂肪酶檢測有以下幾種方法。濁度測定法，在制作瓊脂平板時加入脂肪酶 的底物及有色指示劑。在瓊脂平板上點上待測脂肪酶（打孔加樣或濾紙片點樣）在脂肪酶 水解作用下加樣點的周圍出現(xiàn)透明圈（R. c. Lawrence，Nature, 1967, 213,1264-1265) pH測 定法，基于脂肪酶水解釋放脂肪酸導致反應液pH降低，采用pH電極監(jiān)測，用標準NaOH進 行滴定檢測（Tietz NW，Clin Chem.，1989, 35,1688-1693)。還有滴定法，免疫學方法（孫 艷，江西醫(yī)學檢驗，2002, 20, 382-384)，熒光檢測方法等。
[0009] 脂肪酶熒光檢測具有更高的靈敏度和便捷性。ICN醫(yī)藥公司推出一個試劑盒可用 于脂肪酸的定量。其測定的基本原理是利用一種哺乳動物的脂蛋白為脂肪酶底物，該脂蛋 白與一種acrylodan熒光探針共軛。當沒有脂肪酸時該探針在432nm發(fā)光，而有脂肪酸 存在時該探針在 505nm 發(fā)光（Frederic Beisson, Lipid Sci. Technol. , 2000,133-153) 〇 Lavis將熒光素進行修飾，在酶切之前沒有熒光，酶切之后將熒光素釋放，產(chǎn)生熒光（Chem. Sci.，2011，2, 521 - 530)。Katie R將DDA0G-邊接上酯基，在酶切之前沒有熒光，酶切后產(chǎn) 生焚光（ChemBioChem 2015, 16, 70-75)。目前商業(yè)化的脂肪酶焚光檢測試劑有sigama公司 的 4-Methylumbelliferyloleate，發(fā)射在 449nm，激發(fā)在 327nm。美國 life science 公司的 EnzChek? Lipase Substrate, green fluorescent 售價達到 0.1 毫克 2819 元。這些焚 光探針存在的一個很大的問題就是合成復雜，需要極大的成本，所以售價居高不下。另一個 問題是熒光基團的水溶性太差，在正常細胞生理環(huán)境下溶解較難。

【發(fā)明內容】

[0010] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種熒光探針及其制備方法、應用。本發(fā)明通過三步合成 了基于6-羥基喹啉鹽的0 -半乳糖苷酶熒光探針，通過兩步合成了基于6-羥基喹啉鹽的 脂肪酶熒光探針，極大的降低了其生產(chǎn)成本，同時具有較好的水溶性和熒光檢測效果。
[0011] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：
[0012] 本發(fā)明提供了 6-羥基喹啉及其衍生物在制備熒光探針中的應用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種熒光探針，其結構如式I所示：
[0014]
【主權項】
1. 6-哲基嗟咐及其衍生物在制備巧光探針中的應用。
2. -種巧光探針，其特征在于，其結構如式I所示：
0
3. 根據(jù)權利要求1所述的巧光探針，其特征在于，其結構如式II或式III所示：
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的巧光探針在酶檢測中的應用。
5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述酶為0 -半乳糖巧酶和/或脂肪酶。
6. 根據(jù)權利要求2或3所述的巧光探針的制備方法，其特征在于，由6-哲基嗟咐及其 衍生物與酶底物制得。
7. 根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1 ;W四己酷基-a-D-漠代半乳糖和6-哲基嗟咐為原料，在有機溶劑存在的條件 下，經(jīng)無機堿催化，發(fā)生反應獲得第一產(chǎn)物； 步驟2 ;在醇類溶劑存在的條件下，W步驟1獲得的所述第一產(chǎn)物和甲醇鋼反應脫去己 酷基，調節(jié)抑值為中性，在有機溶劑中沉淀，獲得第二產(chǎn)物； 步驟3 ;在有機溶劑存在的條件下，取步驟2獲得的所述第二產(chǎn)物和艦甲燒反應，即得。
8. 根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟3中所述反應的溫度為90~ ll〇°C，所述反應的時間為10~15h。
9. 根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1 ;在有機溶劑存在的條件下，W十二酷氯、6-哲基嗟咐為原料、己胺為催化 劑發(fā)生反應，獲得第一產(chǎn)物； 步驟2 ;在醇類溶劑存在的條件下，W步驟1獲得的所述第一產(chǎn)物和艦甲燒發(fā)生反應， 在有機溶劑中沉淀，即得。
10. 根據(jù)權利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟2所述反應的溫度為80~ 90°C，所述反應的時間為12~1她。
【專利摘要】本發(fā)明涉及化學領域，特別涉及一種熒光探針及其制備方法、應用。本發(fā)明通過三步合成了基于6-羥基喹啉鹽的β-半乳糖苷酶熒光探針，通過兩步合成了基于6-羥基喹啉鹽的脂肪酶熒光探針，極大的降低了其生產(chǎn)成本，同時具有較好的水溶性和熒光檢測效果。
【IPC分類】C07H17-02, C07D215-20, G01N21-64, C09K11-06
【公開號】CN104845610
【申請?zhí)枴緾N201510191922
【發(fā)明人】王攀, 張國慶, 畢國強, 許向川, 陳偉
【申請人】中國科學技術大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月21日