專(zhuān)利名稱(chēng)：用微球體包埋活組織細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域?qū)儆谖⑶蝮w包埋活組織細(xì)胞。一種已知的合成無(wú)定型硅膠微球的方法包括在一個(gè)容器里放入一種有機(jī)硅前體和強(qiáng)酸溶液以及用溶劑化物諾丹明從無(wú)定型硅膠微球上洗去多余的有機(jī)硅前體的步驟。有機(jī)硅前體和強(qiáng)酸溶液是不混溶的。合成無(wú)定型硅膠微球的方法還包括加入一種選自諾丹明-6G、-B、銪3+、熒光素、香豆素-120、香豆素-314T、硫堇、鈾、和鈾敏感的銪的摻雜物，攪拌有機(jī)硅前體和強(qiáng)酸溶液，在強(qiáng)酸溶液中形成有機(jī)硅前體滴液，其中強(qiáng)酸溶液中的水水解有機(jī)硅前體滴液形成無(wú)定型硅膠微球，并且用一種溶劑洗滌除去多余的有機(jī)硅前體。產(chǎn)物呈熒光性。
在另一個(gè)已知的方法中，活的動(dòng)物組織細(xì)胞和微生物細(xì)胞，例如，酵母細(xì)胞被包埋在由有機(jī)硅制備的無(wú)機(jī)的膠中。組織細(xì)胞的包埋是通過(guò)用一種有機(jī)硅前體與一種強(qiáng)酸水溶液混合，水解有機(jī)硅前體而提供一種成膠液，冷卻成膠液，形成一種活組織細(xì)胞和亨克氏平衡鹽溶液的混合物，堿液加入到成膠液，隨后，立刻將含有組織細(xì)胞的混合液加入成膠液中，然后，把產(chǎn)物混合物倒入一種容器中形成一種無(wú)機(jī)膠包埋的組織細(xì)胞。有機(jī)硅前體可以是四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷、或四丙氧基硅烷。微生物細(xì)胞的包埋采用的是類(lèi)似的方法，其中成膠液的制備是采用把一種鹼加入到用濃酸水溶液水解有機(jī)硅產(chǎn)生的溶液中得到的，微生物細(xì)胞的分散液與成膠液混合，將產(chǎn)生的混合物倒進(jìn)一個(gè)容器中形成一種無(wú)機(jī)膠包埋的微生物細(xì)胞。
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及微球體包埋活組織細(xì)胞的方法。用許許多多微球體包埋活組織細(xì)胞的這種方法包括的步驟有一種有機(jī)金屬前體和一種水解液混合形成成膠液；活組織細(xì)胞和鹽溶液混合，形成一種含有活組織細(xì)胞的溶液；含有活組織細(xì)胞的溶液和成膠液混合，形成一種一定比重的混合物。
本發(fā)明第一個(gè)獨(dú)立的方面，是本方法也包括混合物在一個(gè)含有一種油的容器中混合的步驟，攪拌混合物形成許多的微球，而每個(gè)微球都包埋著一些活組織細(xì)胞。這種油與混合物是不相溶的，它的比重與混合物相比較低。
本發(fā)明的第二個(gè)獨(dú)立的方面，這種方法也包括將混合物形成滴液；和將滴液放入一種有油的柱子中的步驟。這種油和混合物是不相溶的，油與混合物相比它的比重較低，在混合物其頂部形成許多微球，而每個(gè)微粒體包埋著一些活組織細(xì)胞。
本發(fā)明的第三個(gè)獨(dú)立的方面，有機(jī)硅前體是選自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷所組成的一組有機(jī)硅。
本發(fā)明的第四個(gè)獨(dú)立的方面，所指的活組織細(xì)胞是來(lái)自一種動(dòng)物。
本發(fā)明的第五個(gè)獨(dú)立的方面，所指的活組織細(xì)胞是來(lái)自一種植物。
本發(fā)明的第六個(gè)獨(dú)立的方面，所指的活組織細(xì)胞是來(lái)自真菌。
本發(fā)明的第七個(gè)獨(dú)立的方面，所指的活組織細(xì)胞是來(lái)自細(xì)菌。
用這種包埋活組織的方法創(chuàng)造了一種新的藥物投送系統(tǒng)，能使活的分泌治療化合物的細(xì)胞移植在體內(nèi)，而勿需免疫抑制。陶瓷材料(無(wú)機(jī)非金屬)可以用于包埋能分泌治療藥物，而且被移植在寄主(病人)體內(nèi)摸擬真實(shí)的器官投送治療藥物的活組織細(xì)胞。
為提高或完成所需要的結(jié)果，活組織可通過(guò)遺傳工程進(jìn)行改造。陶瓷材料孔隙的大小要足以使治療的藥物分子通過(guò)，但孔隙又要足以使移植的細(xì)胞與寄主的免疫系統(tǒng)分隔開(kāi)。非有機(jī)的包埋材料在生物學(xué)上是惰性的，可減少免疫或自體免疫響應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
通過(guò)參照如下詳細(xì)的描述，其它方面以及伴隨的許多優(yōu)點(diǎn)會(huì)更容易看出，同樣也更容易被理解。
本發(fā)明被認(rèn)為是新穎的一些特征在附后的權(quán)利要求中予以陳述。


；圖1．是一個(gè)容器和一個(gè)攪拌棒的側(cè)視圖。容器中含有一種油和按照本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施方案由活組織細(xì)胞的溶液與成膠液形成的混合物的混合物。
圖2．是滴加器和油柱的側(cè)視圖。其油柱中含有按照本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案由活組織細(xì)胞的溶液與成膠液形成的混合物的混合物。
優(yōu)選的實(shí)施方案的詳細(xì)描述一種合成溶膠包埋活組織細(xì)胞的方法，包括在第一個(gè)容器放入一種有機(jī)金屬前體和一種水解液，攪拌溶液直到溶液變清，清液在冰浴中冷卻，在第二個(gè)容器中放入活組織細(xì)胞和平衡的鹽溶液形成一種組織溶液的步驟。
收獲活組織細(xì)胞。活組織細(xì)胞放入一種平衡鹽溶液中形成一種組織溶液。用于人細(xì)胞的溶液可以是普通的醫(yī)用鹽水溶液。用于包埋活細(xì)胞的鹽濃度需要充分平衡以免細(xì)胞破碎。U．S．專(zhuān)利No．4，797，213在第六列第10行給出所使用亨克氏平衡鹽溶液。活組織細(xì)胞可以來(lái)自一種植物、一種動(dòng)物、細(xì)菌、真菌或者酵母。
有機(jī)金屬前體可以是一種有機(jī)硅前體，水解液可以是摩爾濃度在0．05至2．5范圍的一種強(qiáng)酸。本方法也包括加一種分子濃度在0．05至2．5范圍的鹼溶液到清溶液中。隨后，立刻把組織溶液加入清溶液和鹼溶液中，攪拌清液、鹼液和組織溶液，形成成膠液，處理該成膠液，得到無(wú)機(jī)膠包埋活組織細(xì)的所需要物理結(jié)構(gòu)。溶液加鹼充分中和避免在極端pH下細(xì)胞破損。
有機(jī)硅前體可以選自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷、四丙氧基硅烷、和甲基三甲氧基硅烷。
有機(jī)金屬前體可以選自三-正-丙氧基鋁、三仲丁氧基鋁、乙酰乙酸酯螯合二仲丁氧基鋁、三仲丁氧基鋯、丁氧基硼、甲氧基硼、丁氧基鈦(iv)、異丙氧基鈦和異丙氧基鋯。強(qiáng)酸選自由硝酸和鹽酸。其它可被使用的強(qiáng)酸包括硫酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鹼溶液是氫氧化鋁。請(qǐng)參閱C．J．Brinker，Journalof Non-Crystaline Solutions，volume48，page48 and volume63，page45．由Jeffrey W．Pollard和John M．Walker編輯的在位于Clifton New Jersey的Humana出版社出版的題目為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一書(shū)的第十三章141頁(yè)描述亨克氏平衡液。
根據(jù)K．Lindsey編輯和由Humana出版社出版的題目為植物組織培養(yǎng)手冊(cè)原理和應(yīng)用?？梢詮哪ニ榈娜~子的碎片中得到一種植物組織細(xì)胞，將這種葉子的碎片放入平衡鹽溶液中形成植物組織溶液。
由Jeffrey W．Pollard和John M．Walker編輯的位于Clifton的New JerseyHumana出版社出版的題目為“動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)”一書(shū)的第十三章141頁(yè)也描述了一種動(dòng)物組織細(xì)胞的制備。
從包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的肝、胰、甲狀腺、甲狀旁腺、腦垂體腺體、腎皮質(zhì)可以獲得一種動(dòng)物的組織細(xì)胞。包埋這些組織細(xì)胞其中之一的一種溶膠可以用于一種人造器管，例如，一種人造肝臟或一種人造胰臟。
例如，已從牛肝(牛的肝細(xì)胞)獲得活的動(dòng)物組織細(xì)胞。將牛肝切成小塊是分散活的動(dòng)物組織細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)程序。取大約10克小塊的牛肝放入60毫升的亨克氏平衡鹽溶液中放置半小時(shí)，目的是為了從牛肝除去血紅蛋白。除去亨克氏平衡鹽溶液。40毫克的膠原酶和60毫克的中性蛋白酶溶解于亨克氏平衡鹽溶液。中性蛋白酶和膠原酶是酶。搖動(dòng)亨克氏平衡鹽溶液半小時(shí)，沉淀后成為一種組織溶液。組織溶液是一種有單個(gè)的活肝細(xì)胞分散在其中的上清液。本發(fā)明人已經(jīng)用一種有機(jī)膠包埋了肝細(xì)胞。
U．S．專(zhuān)利No．5，270，192給出一種肝細(xì)胞反應(yīng)器，一種生物人工肝，它包括一個(gè)具有注入口和注出口的保護(hù)外殼，一種基質(zhì)填充在保護(hù)外殼中，以便截留保護(hù)外殼內(nèi)的肝細(xì)胞聚集物，同時(shí)允許基質(zhì)流動(dòng)。
U．S．專(zhuān)利No．4．391．909給出組織細(xì)胞如胰島郎罕氏細(xì)胞或肝細(xì)胞，它們被包埋在一種用分子量大于3000的多聚物與有酸性基團(tuán)的多糖交聯(lián)的一種球形的半滲透膜中。在微膠粒中的細(xì)胞是能生存的，健康的，具有生理活性、有進(jìn)行代謝的能力。包埋的細(xì)胞可被移植在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，以產(chǎn)生活體組織中該細(xì)胞特有的物質(zhì)和化學(xué)變化。本發(fā)明人用一種有機(jī)膠已經(jīng)包埋了胰島郎罕氏細(xì)胞。
U．S．專(zhuān)利No．5．166．058給出了純化了的BMP-2蛋白質(zhì)可以用于骨和軟骨缺欠，傷口醫(yī)治和有關(guān)組織修復(fù)治療。對(duì)于骨和／或軟骨的形成，包括一種具有投送BMP-2A、BMP-2B或其它的BMP蛋白質(zhì)到骨質(zhì)和／或軟骨損傷的能力的基質(zhì)的組合物，為骨和軟骨的發(fā)育提供一種結(jié)構(gòu)，而且可任選地被吸收進(jìn)體內(nèi)，這樣的基質(zhì)目前使用的材料可以形成可用于其它的編碼骨誘誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的移植醫(yī)用DNA序列的應(yīng)用。基質(zhì)材料的選擇要根據(jù)生物性、生物降解性、機(jī)械性、外觀裝飾性、界面的性質(zhì)而定。BMP-2的特定應(yīng)用決定合適的配方。用于這種組合物的潛在的基質(zhì)可以是生物可降解的和化學(xué)上確定的硫酸鈣、三磷酸鈣、羥基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它潛在的材料是生物可降解的，而且生物學(xué)上已確切表征的，例如，骨骼或者表皮膠原。其它的基質(zhì)是由純蛋白質(zhì)或細(xì)胞外的基質(zhì)成份組成。其它潛在的基質(zhì)是非生物降解的和化學(xué)上確定的，諸如，燒結(jié)的羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它的陶瓷。基質(zhì)可以包含上述類(lèi)型材料的任何的組合，例如，聚乳酸和羥基磷灰石、或者膠原和三磷酸鈣。生物陶瓷在其組成可能改變，例如，鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽，和在加工過(guò)程中進(jìn)行改變，以改變孔的大小、顆粒大小、顆粒的形狀和可生物降解的能力。根據(jù)改變BMP-2蛋白質(zhì)作用的各種因素，即，希望形成的骨骼的重量，骨骼損傷的部位，骨損傷的狀況，受傷的程度，損傷組織類(lèi)型，病人的年令、性別和飲食，任何嚴(yán)重的感染，給藥時(shí)間以及其它的臨床因素，由醫(yī)生決定用量方式。用藥量可隨組合物中BMP蛋白質(zhì)的類(lèi)型和用于重新構(gòu)成的基質(zhì)類(lèi)型來(lái)改變。在終組合物中已知的生長(zhǎng)因子，如；IGFI(類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子I)的加入也可影響用藥量。
U．S．專(zhuān)利No．5，453，368的生物物質(zhì)包括PC-12細(xì)胞，該細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用移液管取出細(xì)胞放入離心管中，然后離心沉淀細(xì)胞。將這些細(xì)胞稀釋至2毫升，細(xì)胞濃度大約為每毫升2×106～5×106。含有液體的細(xì)胞被放入無(wú)菌Hamilton注射器中，而且放在一個(gè)注射泵Harvard裝置上。泵是通過(guò)規(guī)格為18的聚四氟乙烯管連接到一種規(guī)格為24的不銹鋼管上，它作為液體滴加的一種裝置。用1．5％藻朊酸鈉溶液(W／V)制備含有牛腎上腺嗜鎘細(xì)胞的微膠囊。PBS收集浴容器含有1．5％氯化鈣。培養(yǎng)六周后，微膠囊含有活的細(xì)胞。
用上述的方法，在硅膠中成功地包埋了下列細(xì)胞，而且保持其活性。真菌釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae顯毛金藻Phanerochaete chrysosporium植物
熱半月孢囊(光合作用海藻)Pyrocystis lunula(photosyntheticmarine)紅蘋(píng)果地面復(fù)蓋葉細(xì)胞(從磨碎葉的懸浮液中提取的含有葉綠體的細(xì)胞)Red apple ground cover leaf cells(individual chlorophyl-containing cells extracted from supematent of ground leaves)細(xì)菌磷發(fā)光細(xì)菌(生物發(fā)光的海洋細(xì)菌)Photobacterium phosphoreum(bioluminescent marine bacteria)，嗜砷地螺旋菌Geospirillum arsenophiluf(MIT-13)，鹽生鹽桿菌Halobacterium halobium．動(dòng)物鼠胰島郎格罕氏細(xì)胞Murine islets of Langerhans，豬胰島郎格罕氏細(xì)胞Porcine islets of Langerhans，牛肝細(xì)胞Bovine hepatocytes，豬肝細(xì)胞Porcine hepatocytes，人白血球細(xì)胞Human white blood cells，人紅血球細(xì)胞Human red blood cells，大鼠PC-12細(xì)胞(來(lái)自嗜鉻細(xì)胞瘤)Rat PC-12cells(from ratpheochromocytoma)，Lac-z轉(zhuǎn)染鼠間質(zhì)干細(xì)胞(基因工程哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞)Lac-ztransfected murine mesenchymal stem cells(genetically engineedmammalian tissue cells)，大鼠成纖維細(xì)胞Rat fibroblasts，人成纖維細(xì)胞Human fibroblasts，人骨肉瘤細(xì)胞Human osteosarcoma cells，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞Chinese hamster ovarian(CHO)cells．圖1．所涉及的是公開(kāi)的一種用微球體包埋活組織細(xì)胞的方法。本方法是用許多微球包埋活的組織細(xì)胞，它包括有機(jī)金屬前體和水解液混合形成成膠液；活組織細(xì)胞和鹽溶液混合形成含有活組織細(xì)胞的溶液；含有活組織細(xì)胞的溶液和成膠液混合形成一種一定比重的混合物?；罱M織細(xì)胞可以是來(lái)自一種動(dòng)物或來(lái)自一種植物。本方法也包括混合物在含有油12的容器11中混合，然后用攪棒13攪拌混合物，形成許多微球體14。每個(gè)微球體14包埋著一些活的組織細(xì)胞。油12與混合物是不相混溶的，它的比重與混合物的比重相比較輕。有機(jī)金屬前體可以是一種有機(jī)硅前體。有機(jī)硅前體可以從四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷一組中挑選。
圖2．所涉及的是公開(kāi)的一種用微球體包埋活組織細(xì)胞的方法。本方法用許多微球包埋活的組織細(xì)胞，包括，有機(jī)金屬前體和水解液混合形成成膠液；活的組織細(xì)胞和鹽溶液混合形成含有活細(xì)胞的溶液和含有活的組織細(xì)胞的溶液與成膠液混合形成一定比重的混合物。活組織細(xì)胞可以是來(lái)自一種動(dòng)物或來(lái)自一種植物。該方法也包括混合物形成滴液和將滴液加入到一種含有油112的一個(gè)柱11l中的步驟。油112與混合物是不相混溶的，其比重低于混合物的比重，在頂部的位置形成許多微球，每個(gè)微球114包著一些活組織細(xì)胞。有機(jī)金屬前體可以是一種有機(jī)硅前體。有機(jī)硅前體可以從四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷組成的一組中挑選。
從前述部分可以看出，用一種溶膠包埋一種有活性的生物材料，包括已經(jīng)給以描述過(guò)的動(dòng)物和微生物的組織細(xì)胞。因此，前述的公開(kāi)將被認(rèn)為僅僅是對(duì)本發(fā)明原理的一種解釋。
權(quán)利要求
1．用許多微球包埋活組織細(xì)胞的方法包含a．使一種有機(jī)金屬的前體和一種水解液組合形成一種成膠液；b．使活組織細(xì)胞和一種鹽溶液組合形成含有活組織細(xì)胞的一種溶液；c．使從b步驟得到的含有活組織細(xì)胞的溶液與從a步驟得到的成膠液組合形成一種一定比重的混合物；d．將c步驟產(chǎn)生的混合物混入與c步驟產(chǎn)生的混合物不相溶的，比重小于從c步驟產(chǎn)生的混合物的一種油中，形成許多包埋著一些所說(shuō)的活組織細(xì)胞的微球。
2．根椐權(quán)利要求1所述的方法，混合步驟包括將這種油和步驟c得到的混合物進(jìn)行攪拌。
3．根椐權(quán)利要求1所述的方法，混合步驟包括將c步驟產(chǎn)生的混合物形成滴液和將滴液滴入油柱頂部。
4．根椐權(quán)利要求1、2或3所述的方法，在有機(jī)金屬前體和水解液相組合的步驟中，該有機(jī)金屬前體是有機(jī)硅前體。
5．根椐權(quán)利要求4所述的方法，該有機(jī)硅前體選自四乙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四甲氧基硅烷和四丙氧基硅烷。
6．根椐權(quán)利要求1、2或3的方法，該方法還包含e．由步驟b產(chǎn)生的含有活組織細(xì)胞的溶液與成膠液組合之前，由步驟a產(chǎn)生的成膠液與一種鹼組合，以充分中和成膠液，避免極端pH損傷活組織細(xì)胞。
全文摘要
一種用許多微球包埋活組織細(xì)胞的方法,包括:有機(jī)金屬前體和水解液混合形成成膠液;活組織細(xì)胞和鹽溶液混合形成含有活組織細(xì)胞的一種溶液;產(chǎn)生的含有活組織細(xì)胞的溶液和產(chǎn)生的成膠液混合形成一定比重的混合物。用許多微球包埋活組織細(xì)胞的方法,也包括:將混合物混入一個(gè)含有一種油的容器,而且攪拌混合物形成許多微球,每一微球包埋著活組織細(xì)胞。這種油和混合物是不相溶的,而且比重低于混合物。
文檔編號(hào)C09K11/06GK1292816SQ98810291
公開(kāi)日2001年4月25日 申請(qǐng)日期1998年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月18日
發(fā)明者愛(ài)德華·J·A·波普 申請(qǐng)人:索爾基因醫(yī)療有限公司