本發(fā)明涉及天然色素提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從荸薺皮中提取色素的方法。
背景技術(shù)：
中國的馬蹄產(chǎn)量占世界的95％以上，我國荸薺年總加工量超過100萬噸，荸薺果皮約占總荸薺質(zhì)量的20％，每年產(chǎn)生的荸薺皮廢料在20萬噸以上，資源量很大。荸薺皮中有豐富的天然黃酮類色素、淀粉、纖維素、多酚、多糖等多種成分。但是荸薺皮歷來被當(dāng)成飼料使用，或直接丟棄，這造成了資源的浪費(fèi)。所以從荸薺皮中提取天然色素，將廢棄資源開發(fā)利用，有著重要的意義。天然色素作為食品添加劑，因其具有較高的安全性以及一定營養(yǎng)價(jià)值和保健作用而廣受人們的關(guān)注開發(fā)天然色素食用替代合成色素，已成為熱點(diǎn)研究課題。荸薺皮色素是一種天然的黃酮色素，存在荸薺果皮與果肉之間，具有良好的抑菌作用和抗氧化活性荸薺是廣受歡迎的藥食兩用果蔬，在我國大部分地區(qū)廣泛種植，本身是食用作物，其色素更具有安全性。隨著荸薺產(chǎn)品的需求增加，廢棄荸薺皮更容易獲得，開發(fā)荸薺皮色素產(chǎn)品成為可能。
現(xiàn)有提取技術(shù)中提取的色素較粗，其成分復(fù)雜，色階低、含糖量高，且容易霉變，不利保存，也不能直接應(yīng)用，其生物活性也因提取技術(shù)的自身缺陷而相應(yīng)降低。因此，亟待尋找到一種真正高效從荸薺皮中提取色素的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
鑒于上述和/或現(xiàn)有荸薺皮中提取色素的方法的問題，提出了本發(fā)明。
因此本發(fā)明的目的是改善荸薺皮色素在提取過程中存在的提取率低、能耗大、效果差、耗時(shí)長、生物活性低等問題，提供一種提取率高、溫和、簡便的從荸薺皮中提取天然色素的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種從荸薺皮中提取色素的方法，包括，預(yù)處理，將除雜后的荸薺皮，在30～40℃烘干后粉碎；酶解，向荸薺皮中加入磷酸氫二鈉緩沖液，再按荸薺皮質(zhì)量的0.4～2.0％加入復(fù)合酶，在50～55℃、700～850rpm的條件下攪拌反應(yīng)1～3h，離心過濾；萃取，將酶解后的荸薺皮加入體積分?jǐn)?shù)50～70％的乙醇溶液，進(jìn)行超聲微波萃取，得到色素產(chǎn)品。
作為本發(fā)明所述從荸薺皮中提取色素的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述加入體積分?jǐn)?shù)50～70％的乙醇溶液，其添加量為按酶解后的荸薺皮質(zhì)量的10～30倍。
作為本發(fā)明所述從荸薺皮中提取色素的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述進(jìn)行超聲微波萃取，其中，超聲波固定頻率為45～50KHz，功率為45～50W。
作為本發(fā)明所述從荸薺皮中提取色素的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述進(jìn)行超聲微波萃取，其中，微波功率為100W～300W，萃取時(shí)間為30～300s。
作為本發(fā)明所述從荸薺皮中提取色素的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述復(fù)合酶包括纖維素酶和果膠酶，其中，纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比為3：1～1：3。
作為本發(fā)明所述從荸薺皮中提取色素的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述離心，其是在7000～8000rpm下離心15～25min。
作為本發(fā)明所述從荸薺皮中提取色素的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述磷酸氫二鈉緩沖液的pH為4.0～6.0，其添加量為荸薺皮質(zhì)量的14～16倍。
作為本發(fā)明所述從荸薺皮中提取色素的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述粉碎，其是將烘干后的荸薺皮粉碎，過30～50目篩。
本發(fā)明的有益效果：
(1)本發(fā)明提供的提取方法，黃酮得率高，同時(shí)仍能最大程度保持原有生物活性。
(2)提取的黃酮色素穩(wěn)定性好，色素品質(zhì)高。
(3)此方法具有溫和、高效、簡便、耗能低等特點(diǎn)，應(yīng)用于天然色素的提取領(lǐng)域，有更大的優(yōu)勢，具有廣闊的發(fā)展前景。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。
在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
其次，此處所稱的“一個(gè)實(shí)施例”或“實(shí)施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個(gè)實(shí)施例中”并非均指同一個(gè)實(shí)施例，也不是單獨(dú)的或選擇性的與其他實(shí)施例互相排斥的實(shí)施例。
實(shí)施例1
將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入適量料液比為1：15的磷酸二氫鈉緩沖液，加入荸薺皮干粉總質(zhì)量1.2％的纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，其中纖維素酶和果膠酶的比例為1：2，在55℃、750rpm的條件下攪拌反應(yīng)2h，在7000rpm下離心25min，過濾。取酶解之后的荸薺皮渣，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：20加入。進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，其中萃取條件為，超聲波固定頻率40KHz，功率50W，微波功率250W，萃取時(shí)間為90s。離心，濾出提取液，反復(fù)提取2次。合并所有濾液，測得提取的總黃酮得率為1.507％。
實(shí)施例2
將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入適量料液比為1：15的磷酸二氫鈉緩沖液，加入荸薺皮干粉總質(zhì)量1.2％的纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，其中纖維素酶和果膠酶的比例為1：2，在50～55℃、700～850rpm的條件下攪拌反應(yīng)1～3h，在7000～8000rpm下離心15～25min，過濾。取酶解之后的荸薺皮渣，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：20加入。進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，其中萃取條件為，超聲波固定頻率40KHz，功率50W，微波功率150W，萃取時(shí)間為90s。離心，濾出提取液，反復(fù)提取2次。合并所有濾液，測得提取的總黃酮得率為1.497％。
實(shí)施例3
將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入適量料液比為1：15的磷酸二氫鈉緩沖液，加入荸薺皮干粉總質(zhì)量1.2％的纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，其中纖維素酶和果膠酶的比例為1：1，在50℃、850pm的條件下攪拌反應(yīng)2h，在8000rpm下離心15min，過濾。取酶解之后的荸薺皮渣，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：20加入。進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，其中萃取條件為，超聲波固定頻率40KHz，功率50W，微波功率250W，萃取時(shí)間為90s。離心，濾出提取液，反復(fù)提取2次。合并所有濾液，測得提取的總黃酮得率為1.517％。
實(shí)施例4
將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入適量料液比為1：15的磷酸二氫鈉緩沖液，加入荸薺皮干粉總質(zhì)量1.2％的纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，其中纖維素酶和果膠酶的比例為1：2，在50℃、800rpm的條件下攪拌反應(yīng)2h，在7500rpm下離心20min，過濾。取酶解之后的荸薺皮渣，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為50％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：20加入。進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，其中萃取條件為，超聲波固定頻率45KHz，功率45W，微波功率200W，萃取時(shí)間為120s。離心，濾出提取液，反復(fù)提取2次。合并所有濾液，測得提取的總黃酮得率為1.533％。
實(shí)施例5
將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入適量料液比為1：15的磷酸二氫鈉緩沖液，加入荸薺皮干粉總質(zhì)量0.8％的纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，其中纖維素酶和果膠酶的比例為1：2，在50℃、700rpm的條件下攪拌反應(yīng)3h，在7000rpm下離心25min，過濾。取酶解之后的荸薺皮渣，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：20加入。進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，其中萃取條件為，超聲波固定頻率40KHz，功率50W，微波功率250W，萃取時(shí)間為90s。離心，濾出提取液，反復(fù)提取2次。合并所有濾液，測得提取的總黃酮得率為1.512％。
實(shí)施例6
將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入適量料液比為1：15的磷酸二氫鈉緩沖液，加入荸薺皮干粉總質(zhì)量1.2％的纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，其中纖維素酶和果膠酶的比例為1：2，在55℃、850pm的條件下攪拌反應(yīng)1～3h，在7000rpm下離心25min，過濾。取酶解之后的荸薺皮渣，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：20加入。進(jìn)行超聲微波協(xié)同萃取，其中萃取條件為，超聲波固定頻率40KHz，功率50W，微波功率250W，萃取時(shí)間為90s。離心，濾出提取液，反復(fù)提取2次。合并所有濾液，測得提取的總黃酮得率為1.540％。
對比實(shí)施例
(1)溶劑萃取法：將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：20加入，在室溫下攪拌提取60min，離心，過濾，提取2次。測得提取的總黃酮得率為1.236％。
(2)超聲萃取法：將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為50％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：10加入，放入超聲清洗儀中進(jìn)行超聲提取，提取條件為超聲功率20KHz、80W，提取40min，離心，過濾，提取2次。測得提取的總黃酮得率為1.281％。
(3)微波萃取法：將荸薺皮洗凈，除去表面灰塵雜質(zhì)，剔除腐爛部分，在30℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，過40目篩。稱取2g的荸薺皮，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為80％乙醇溶液，按照荸薺皮干粉固液質(zhì)量比1：10加入，放入微波爐中進(jìn)行提取，提取條件為微波功率350W，提取時(shí)間為5min。離心，過濾，提取2次。測得提取的總黃酮得率為1.380％。
本發(fā)明中的荸薺皮色素提取液中總黃酮含量的測定按以下方法進(jìn)行：準(zhǔn)確稱取的蘆丁標(biāo)品20mg，用無水乙醇溶解，并全部轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用去離子水定容，混勻，得質(zhì)量濃度為0.2mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml于50mL容量瓶中，加5％亞硝酸鈉1.0ml，混勻，放置5min，然后加入10％九水硝酸鋁1.0ml，混勻，放置5min，然后加入0.4％氫氧化鈉10.0mL，混勻，用去離子水稀釋至刻度，20min后于紫外分光光度計(jì)λ＝510nm處測定其吸光度A，以試劑空白參比。用最小二乘法做線性回歸，測得黃酮濃度CX(mg/ml)與吸光度A的回歸方程：CX＝2.8972A+0.0077，R2＝0.9993。取荸薺皮色素提取液1ml，按照上述方法測定提取液中黃酮的濃度C(mg/ml)。
黃酮得率(％)＝[(C×V)/M]×100％
其中C：提取液中黃酮的濃度(mg/ml)；V：提取液最后定容的體積(ml)；M：荸薺皮干粉的質(zhì)量(g)
具體如下表所示：該表反應(yīng)了不同提取方法下的荸薺皮色素的黃酮得率。
穩(wěn)定性評價(jià)：
1、溫度
將對比例1～3，實(shí)施例1～6提取的荸薺皮色素溶于體積分?jǐn)?shù)60％乙醇配成濃度為0.1mg/mL的溶液。分別取該溶液5mL，在不同溫度下加熱1h，冷卻至室溫后，在可見光范圍掃描溶液的吸光度。評價(jià)色素在不同溫度下的穩(wěn)定性。
9組色素在20～100℃水浴1h后，在可見光范圍掃描，沒見異常吸收峰。溫度對色素穩(wěn)定性影響的結(jié)果也表明，該色素的中性溶液有較好的熱穩(wěn)定性能。在常見的食品加工過程中，高溫處理并不常見，故荸薺皮可作為食品添加劑，用于食品的著色。
2、pH
將對比例1～3，實(shí)施例1～6提取的荸薺皮色素溶于體積分?jǐn)?shù)60％乙醇配成濃度為0.1mg/mL的溶液。分別取該溶液5mL，加入不同濃度的HCl或NaOH溶液，并定容為10mL，使得溶液的pH值分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。室溫下振蕩1h后，在可見光范圍掃描溶液的吸光度。評價(jià)色素在不同pH值下的穩(wěn)定性。
荸薺皮色素為黃酮色素，含多種酚羥基，在堿性溶液中會失去質(zhì)子，易形成更大范圍的電子共軛以降低體系的能力，故在堿性溶液的吸光度增加，而在酸性條件下有相反的效果。目測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨酸性的增強(qiáng)，荸薺皮色素溶液的顏色由黃色變?yōu)闇\黃色，變化不大；而隨堿性增強(qiáng)，色素的顏色由黃色變?yōu)樽厣伾兓却?，長時(shí)間放置后發(fā)生褐變，失去光澤。色素在酸性溶液中的吸光度減少，但變化不大；而在強(qiáng)堿溶液中色素的吸光度大幅度增加，且當(dāng)溶液pH值＞10后，色素在黃色光的吸收區(qū)外也有較大的吸光度，使得其溶液顏色加深，變?yōu)榧t棕色，極不穩(wěn)定。綜合目測和掃描結(jié)果可知，色素在偏中性溶液(pH＝5～9)中穩(wěn)定，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性溶液中不穩(wěn)定，但實(shí)施例1～6提取的色素相對變化較小。該類色素在常見的食品加工過程中使用時(shí)，應(yīng)避免形成強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液，以免破壞色素的結(jié)構(gòu)。
3、常用添加劑的影響
荸薺皮色素溶于體積分?jǐn)?shù)60％乙醇配成濃度為0.1mg/mL的溶液。分別取該溶液5mL，加入相同體積的10g/L和1g/L的常用食品添加劑溶液(蔗糖、葡萄糖、Vc、NaCl、檸檬酸、檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、NaSO3、NaHCO3)，搖勻。室溫振蕩1h后，在可見光范圍掃描溶液的吸光度。評價(jià)色素在常用添加劑溶液中的穩(wěn)定性。
荸薺色素溶液中加入常用的食品添加劑，在可見光范圍內(nèi)掃描，沒見異常吸附峰。糖類、中性和弱堿性的添加劑對色素的穩(wěn)定性影響不大，堿性較強(qiáng)的有機(jī)酸和無機(jī)酸都對色素的穩(wěn)定性有影響，但實(shí)施例1～6提取的色素相對變化較小。由于弱堿性添加劑會使溶液形成緩沖系統(tǒng)，使溶液pH值在小范圍內(nèi)變化，并不影響色素的穩(wěn)定性，結(jié)果與溶液的pH影響一致。因此，在荸薺皮色素溶液加工過程中應(yīng)避免形成強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境。
抗氧化活性：
1、還原能力
硫氰化鉀還原法用于測定抗氧化劑的總還原能力。K3Fe(CN)6絡(luò)合物中的Fe3+經(jīng)抗氧化劑還原，轉(zhuǎn)化為Fe2+的形式，形成布魯士蘭，在700nm有最大吸收。本發(fā)明實(shí)施例1～6提取的色素相比于對比實(shí)施例1～3的還原能力有較大的提高，其中最優(yōu)實(shí)施例4效果極為突出，具有很強(qiáng)的抗氧化還原能力。
2、ABTS+·陽離子自由基清除活性
ABTS+·陽離子自由基在溶液中與抗氧化劑反應(yīng)迅速，適用于pH值范圍大的溶液中，且ABTS+·活性測試發(fā)生在多種介質(zhì)中，可測定水溶性、脂溶性的提取物、天然純化合物和合成的抗氧化劑。本發(fā)明實(shí)施例1～6提取的色素相比于對比實(shí)施例1～3的清除ABTS+·的能力有了很大提高，其中最優(yōu)實(shí)施例4效果極為突出，提高了將近3倍，且大于Trolox和蘆丁的清除能力，具有較強(qiáng)的ABTS+·自由基清除活性。
3、DPPH·清除活性
DPPH離子在溶液中穩(wěn)定，反應(yīng)快速，是通過測定溶液中吸光度的減少來獲得抗氧化劑的清除活性，經(jīng)常用于測定經(jīng)典抗氧化劑的清除自由基活性。本發(fā)明實(shí)施例1～6提取的色素相比于對比實(shí)施例1～3的清除DPPH·的能力有了很大提高，其中最優(yōu)實(shí)施例4效果極為突出，且清除DPPH·的能力大于蘆丁的，比Trolox的小，具有較強(qiáng)的DPPH·自由基清除活性。
抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由此可見，目前荸薺皮色素存在著提取率低，能耗大，提取效果差，在提取過程中目標(biāo)物質(zhì)易被破壞，回收困難等問題，本發(fā)明通過從預(yù)處理、酶解、到萃取的優(yōu)選優(yōu)化，考慮到整個(gè)處理過程對黃酮品質(zhì)破壞的影響因素，在提高得率同時(shí)能夠兼顧黃酮本身品質(zhì)與活性。其中，本發(fā)明提供的提取方法，以實(shí)施例6為例，相比于對比實(shí)施例1～3，總黃酮得率分別提高了24.60％、11.60％、20.22％，同時(shí)生物活性相比為對比實(shí)施例1～3，也有極為突出的表現(xiàn)。綜上所述此方法具有溫和、簡便、耗能低等特點(diǎn)。并且，本發(fā)明是一種綠色高效、便于工業(yè)化推廣、簡單可行的提取方法，具有廣闊的發(fā)展前景。
應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。