本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素p450(cytochromep450,p450)酶，又稱混合功能氧化酶或微粒體單加氧酶，是機(jī)體內(nèi)最重要的藥物代謝酶。p450參與了人體膽固醇，激素，脂肪酸，維生素等內(nèi)源性物質(zhì)的合成和代謝，對(duì)維持人體正常生理功能起到重要作用，同時(shí)也參與了多數(shù)外來(lái)物的生物轉(zhuǎn)化，大約70％的藥物(包括絕大部分臨床藥物和殺蟲劑)的主要清除是由p450介導(dǎo)的。細(xì)胞色素p450酶催化的i相反應(yīng)是化合物在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵步驟，因?yàn)檫@一步反應(yīng)通常是藥物從體內(nèi)清除的限速步驟，可影響化合物的半衰期、清除率等動(dòng)力學(xué)特征，且p450酶活性常隨遺傳因素、年齡、疾病狀態(tài)或其它藥物相互作用的影響而發(fā)生改變。藥物對(duì)機(jī)體p450酶的影響，能造成臨床上顯著的藥物相互作用。
cyp1a1是重要的i相代謝酶，主要在人肝外組織中表達(dá)，例如人肺、皮膚、小腸中表達(dá)。cyp1a1參與多種環(huán)境毒素和內(nèi)源性底物的代謝，并在多種前致癌物被激活成具有遺傳毒性中間體或最終致癌物的過(guò)程中起到了重要作用,例如在一定程度上激活咖啡因誘使肝硬化的發(fā)生(molaspectsmed.1999.20：1‐137)。除此之外，cyp1a1的分布存在很大的個(gè)體差異，cyp1a1酶的表達(dá)受遺傳、年齡、疾病、性別、環(huán)境和共服藥物等多種因素的影響。因此，cyp1a1在不同個(gè)體中的肝臟含量也有很大差別，其含量范圍分別為：cyp1a1:0‐3pmol/mg(pharmacology&therapeutics2013；138:103)。因此，開展cyp1a1酶活的個(gè)體差異研究對(duì)于臨床個(gè)性化安全用藥有著重要意義。目前國(guó)內(nèi)外制藥巨頭在藥物開 發(fā)過(guò)程中，需要在體外評(píng)估各候選新藥抑制cyp1a1的能力。因此，開發(fā)高效、靈敏的特異性cyp1a1探針底物對(duì)于高效篩選cyp1a1抑制劑，及定量測(cè)定生物體系內(nèi)cyp1a1的活性至關(guān)重要。
由于cyp1a1亞家族中的各亞型具有相似的氨基酸序列，其底物通常相互交疊，因此各亞型酶鮮有特異性的底物。目前，已報(bào)道的cyp1a1的熒光探針底物有3個(gè)，分別是乙氧基試鹵靈，熒光素-cee和熒光素-me-ege。這些已知的熒光底物均屬于off-on型探針，單酶選擇性并不高且易受生物基質(zhì)的干擾，定量誤差較大。而比率型探針發(fā)射光譜的藍(lán)移/紅移則可用于比率檢測(cè)，且此時(shí)探針?lè)肿釉涂勺鳛閮?nèi)部校準(zhǔn)來(lái)減小光照強(qiáng)度、探針濃度、樣品不均勻、儀器參數(shù)等對(duì)定量分析的影響。因此，開發(fā)高選擇性的cyp1a1比率型熒光探針?lè)磻?yīng)及其配套的高通量檢測(cè)方法具有重要的實(shí)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一類細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針底物及其應(yīng)用，該熒光探針底物和去氯乙基化產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長(zhǎng)具有明顯差異，且產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率更高更易檢測(cè)。利用該探針?lè)磻?yīng)可對(duì)多種生物體系中cyp1a1的分布和功能進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。
本發(fā)明提供了一類細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1特異性的熒光探針，該探針可被cyp1a1特異性催化生成相應(yīng)的o-去氯乙基化產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)通式如式式(ⅰ)所示，該底物具有1,8-萘酰亞胺類結(jié)構(gòu)，
其中r為-ch3、苯基、-oh等基團(tuán)中的一種，n為1～10。
一種cyp1a1特異性熒光探針的制備方法，該方法包括下列步驟：
步驟一：4-溴-1,8-萘二甲酸酐與氨基化合物在醇中反應(yīng)得到4-溴-1,8-萘酰亞胺；
步驟二：式(ⅲ)所示化合物與碳酸鉀在有機(jī)溶劑中反應(yīng)得到式(ⅱ)所示4-甲氧基-1,8-萘酰亞胺；
步驟三：在氬氣保護(hù)下，約200-500mg式(ⅱ)所示化合物與約5-20ml50-60％氫碘酸水溶液反應(yīng),120-130℃攪拌12-24h后，加大量水稀釋，過(guò)濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到式(ⅲ)所示4-羥基-1,8-萘酰亞胺；
步驟四：將約式(ⅲ)所示化合物與碘代氯乙烷，碳酸鉀，在乙腈中80-90℃反應(yīng)12h-24h后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，真空干燥得到式(ⅰ)所示化合物；
所述反應(yīng)中化合物ⅲ與碘代氯乙烷及碳酸鉀摩爾比例為1:1.25-1.75:1.5-2.5。
本發(fā)明還提供了所述細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針的應(yīng)用，采用上述式(ⅰ)化合物作為cyp1a1亞酶的特異性底物，進(jìn)行o-去氯乙基化結(jié)合反應(yīng)，通過(guò)定量檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)的底物消除率或其o-去氯乙基化產(chǎn)物的生成率來(lái)定量測(cè)定不同生物體系(包括重組表達(dá)cyp1a1單酶、人或動(dòng)物組織制備液、各類組織細(xì)胞等生物體系)中cyp1a1的活性；具體測(cè)定方法為：
——體系中以1,8-萘酰亞胺類化合物作為比率型探針底物；底物濃度選擇1/10～10km；單點(diǎn)測(cè)定時(shí)底物濃度優(yōu)選km。
——在pbs緩沖液中，反應(yīng)溫度為20℃至60℃之間，優(yōu)選37℃為最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間；孵育體系ph介于5.5～10.5之間，優(yōu)選ph7.4為最優(yōu)反應(yīng)ph值；
——反應(yīng)時(shí)間為5～60分鐘，確保以上底物相應(yīng)的o-去氯乙基化產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物轉(zhuǎn)化率不超過(guò)20％時(shí)終止反應(yīng)；
——測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)底物減少量或o-去氯乙基化產(chǎn)物生成量作為cyp1a1活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
該探針底物及其去氯乙基化產(chǎn)物的熒光信號(hào)需采用不同檢測(cè)波長(zhǎng)去檢測(cè)，特異性底物的熒光檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)372nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)452nm；去氯乙基化產(chǎn)物的熒光檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)450nm最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為562nm。
一種細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光探針的應(yīng)用，該探針底物還可用于cyp1a1抑制劑和誘導(dǎo)劑的快速篩選及抑制和誘導(dǎo)能力的定量評(píng)價(jià)。
一種細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1特異性熒光底物的應(yīng)用，該探針底物還可用 于活細(xì)胞及活組織中cyp1a1功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明提供的細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1特異性比率型熒光探針的應(yīng)用，該探針底物及其o-去氯乙基化產(chǎn)物均具有熒光屬性，且兩者具有不同的光學(xué)屬性，可采用熒光檢測(cè)器同時(shí)實(shí)現(xiàn)底物及產(chǎn)物的快速、靈敏檢測(cè)；o-去氯乙基化產(chǎn)物及底物熒光檢測(cè)條件分別為：激發(fā)波長(zhǎng)372，450nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為452，562nm(如圖3所示)。
該特異性探針底物為比率型熒光探針，其在cyp1a1活性檢測(cè)過(guò)程不易受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各種重組cyp1a1、人及動(dòng)物組織制備液及各類組織細(xì)胞中cyp1a1酶活的定量測(cè)定；同時(shí)也可作為在體及動(dòng)物整體cyp1a1的探針底物，評(píng)估代謝酶cyp1a1的個(gè)體及種屬差異。該探針底物及o-去氯乙基化代謝產(chǎn)物的熒光檢測(cè)方法還可用于cyp1a1誘導(dǎo)劑和抑制劑的快速篩選及誘導(dǎo)和抑制能力的定量評(píng)價(jià)。
采用重組細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1單酶，肝微粒體孵育體系進(jìn)行考察，通過(guò)相關(guān)性分析(如圖5所示)，重組單酶代謝反應(yīng)(如圖6所示)，以及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)幾方面的證據(jù)，證明1,8-萘酰亞胺類化合物可特異性的經(jīng)細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1代謝，生成o-去氯乙基化氧化產(chǎn)物。進(jìn)一步采用各種哺乳動(dòng)物的新鮮提取的肝細(xì)胞﹑原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、肝切片﹑肝灌流等代謝評(píng)價(jià)體系進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)該代謝反應(yīng)具有非常良好的特異性。
作為高特異性的細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1單酶的熒光探針底物，該化合物可以用來(lái)檢測(cè)cyp1a1的活性，尤其適合用于對(duì)細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及酵母菌克隆表達(dá)體系生產(chǎn)的cyp1a1的酶活測(cè)定，以及多種哺乳動(dòng)物組織器官來(lái)源的微粒體、s-9等制備物中cyp1a1的活性標(biāo)定。
本發(fā)明中1,8-萘酰亞胺類化合物具有代謝產(chǎn)物單一(僅生成一個(gè)o-去氯乙 基化產(chǎn)物)、代謝酶高選擇性(主要由cyp1a1代謝)、底物及代謝產(chǎn)物易于檢測(cè)且靈敏度高等特點(diǎn)。
選用本發(fā)明所述細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1單酶的比率型熒光探針?lè)磻?yīng)檢細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1單酶體外活性具有以下突出優(yōu)勢(shì)：
(1)高特異性：1,8-萘酰亞胺類化合物可被細(xì)胞色素氧化酶cyp1a1單酶高特異性地代謝成一個(gè)代謝產(chǎn)物，即o-去氯乙基化產(chǎn)物。
(2)廉價(jià)易得：1,8-萘酰亞胺類化合物可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡(jiǎn)單易行，熒光方法檢測(cè)成本低。(3)高靈敏度：具有1,8-萘酰亞胺母核結(jié)構(gòu)的化合物均具有良好的熒光發(fā)射光譜特性(450～700nm)，且該底物及其o-去氯乙基化代謝產(chǎn)物具有不同的熒光發(fā)射光譜特征，能較好的進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)，同時(shí)可通過(guò)比率型標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立進(jìn)行定量測(cè)定cyp1a1單酶的檢測(cè)下限為0.005nm/ml(熒光發(fā)射/激發(fā)光譜是由synergyh1全功能微孔板檢測(cè)儀或島津高效液相色譜-熒光檢測(cè)儀lc-fd-30a檢測(cè)完成完成)。
附圖說(shuō)明
圖1.cyp1a1特異性探針底物的結(jié)構(gòu)通式；
圖2.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的1h-nmr譜圖；
圖3.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺及其o-去氯乙基化代謝產(chǎn)物的歸一化紫外吸收光譜圖(分別在372nm和450nm有最大吸收)；
圖4.12例hlm對(duì)n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的代謝圖；
圖5.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺及其o-去氯乙基化代謝速率與乙氧基試鹵靈的o-脫乙基代謝速率的相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)；
圖6.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的人cyp重組單酶篩選試驗(yàn)結(jié)果；
圖7.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成路線。
具體實(shí)施方式
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。cyp1a1特異性探針底物的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。
實(shí)施例1.n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成
(1)化合物n-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亞胺的合成
將4.2mmol正丁胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反應(yīng)過(guò)夜后，加入200ml水，析出大量固體，過(guò)濾，真空干燥得到米黃色固體n-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(2)化合物n-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將800mgn-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亞胺與2.54g碳酸鉀置于100ml單口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反應(yīng)過(guò)夜后，冷卻，析出大量黃色固體，過(guò)濾，大量水洗，真空干燥得到黃色固體n-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(3)n-正丁基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺的合成
將300mgn-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺置于25ml兩口瓶中，氬氣保護(hù)下加入10ml55-58％氫碘酸水溶液，120-130℃攪拌過(guò)夜后，加大量水稀釋，過(guò)濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到黃色固體，產(chǎn)率60-70％。
(4)化合物n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將1mmoln-正丁基-4-羥基-1，8-萘酰亞胺與1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸鉀置于50ml單口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反應(yīng)過(guò)夜后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，展開劑為乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(體積比)，真空干燥得到黃色固體n-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率40-50％。n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成路線如圖7所示。
注：化合物1、2的結(jié)構(gòu)如圖7所示，且其1h-nmr譜圖如圖2所示，1h-nmr譜圖和13c-nmr譜圖是由核磁共振波譜儀(avanceii400mhz)檢測(cè)完成。
實(shí)施例2.n-乙基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成
(1)化合物n-乙基-4-溴-1，8-萘酰亞胺的合成
將4.2mmol乙胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反應(yīng)過(guò)夜后，加入200ml水，析出大量固體，過(guò)濾，真空干燥得到米黃色固體n-乙基-4-溴-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(2)化合物n-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將800mgn-乙基-4-溴-1，8-萘酰亞胺與2.54g碳酸鉀置于100ml單口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反應(yīng)過(guò)夜后，冷卻，析出大量黃色固體，過(guò)濾，大量水洗，真空干燥得到黃色固體n-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(3)n-乙基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺的合成
將300mgn-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺置于25ml兩口瓶中，氬氣保護(hù)下加入10ml55-58％氫碘酸水溶液，120-130℃攪拌過(guò)夜后，加大量水稀釋，過(guò)濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到黃色固體，產(chǎn)率60-70％。
(4)化合物n-乙基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將1mmoln-乙基-4-羥基-1，8-萘酰亞胺與1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸鉀置于50ml單口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反應(yīng)過(guò)夜后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，展開劑為乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(體積比)，真空干燥得到黃色固體n-乙基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率40-50％。
實(shí)施例3.n-己基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺的合成
(1)化合物n-己基-4-溴-1，8-萘酰亞胺的合成
將4.2mmol己胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反應(yīng)過(guò)夜后，加入200ml水，析出大量固體，過(guò)濾，真空干燥得到米黃色固體n-己基-4-溴-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(2)化合物n-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將800mgn-己基-4-溴-1，8-萘酰亞胺與2.54g碳酸鉀置于100ml單口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反應(yīng)過(guò)夜后，冷卻，析出大量黃色固體，過(guò)濾，大量水洗，真空干燥得到黃色固體n-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率80-90％。
(3)n-己基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺的合成
將300mgn-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺置于25ml兩口瓶中，氬氣保護(hù)下加入10ml55-58％氫碘酸水溶液，120-130℃攪拌過(guò)夜后，加大量水稀釋，過(guò)濾，用水洗滌至濾液為中性，真空干燥得到黃色固體，產(chǎn)率60-70％。
(4)化合物n-己基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺的合成
將1mmoln-己基-4-羥基-1，8-萘酰亞胺與1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸鉀置于50ml單口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反應(yīng)過(guò)夜后，旋蒸除去溶劑，殘余固體用柱層析法提純，展開劑為乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(體積比)，真空干燥得到黃色固體n-己基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亞胺，產(chǎn)率40-50％。
實(shí)施例4.體外測(cè)定人重組cyp單酶的選擇性
(1)預(yù)先準(zhǔn)備90μlcyp代謝反應(yīng)體系，包括ph7.4的pbs緩沖液(100mm)、重組人cyp各單酶(0.075nm/ml)，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺終濃度為10μm，于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；
(2)向反應(yīng)體系中加入10μl濃度為10mm的nadp+起始反應(yīng)；
(3)30分鐘后，加入100μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；
(4)用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后， 取上清，進(jìn)行熒光檢測(cè)(ex＝372nm，em＝450nm)；重組人cyp1a1酶的選擇性最高約是其它單酶的10倍左右(圖6)。
實(shí)施例5.不同個(gè)體來(lái)源肝微粒體中cyp1a1的活性定量評(píng)估
(1)選取12例人肝微粒體(hlm)稀釋至2.5mg/ml，準(zhǔn)備cyp1a1代謝反應(yīng)體系，包括ph7.4的pbs緩沖液(100mm)、人肝微粒體(0.25mg/ml)、nadp+10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1unit/ml，mgcl240mm，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺終濃度為10μm，于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；
(2)向反應(yīng)體系中加入20μl濃度為10mm的nadp+起始反應(yīng)；
(3)30分鐘后，加入200μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；
(4)用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測(cè)(ex＝372nm，em＝450nm)，將所獲熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到12例人肝微粒體(hlm)對(duì)n-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘酰亞胺的代謝速率(圖4)。
實(shí)施例6.體外測(cè)定cyp1a1的檢測(cè)下限測(cè)定
實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測(cè)定，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺10μm，nadp+10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1unit/ml，mgcl240mm，cyp1a1單酶0.0025nm/ml～0.2nm/ml，ph7.4的pbs緩沖液50mm，總體積為100μl，37℃下孵育1h后通過(guò)酶標(biāo)儀分析，每組的平均值與不加cyp1a1的對(duì)照組比較，結(jié)果表明0.005nm/ml的cyp1a具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，因此確定cyp1a1的檢測(cè)下限為0.005nm/ml。
實(shí)施例7.cyp1a1酶濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測(cè)定，n-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亞胺10 μm，nadp+10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1unit/ml，mgcl240mm，cyp1a1單酶0.01nm/ml～0.2nm/ml，ph7.4的pbs緩沖液50mm，總體積為100μl，37℃下孵育30min，酶標(biāo)儀分析，產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度比底物的熒光強(qiáng)度的比值與酶濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2＞0.99，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬廣，可準(zhǔn)確定量cyp1a1的含量。