專利名稱：一種農(nóng)用鹽堿消生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
嗜鹽桿菌的生產(chǎn)屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
全國耕地14億畝，鹽堿地約4億畝，新疆有耕地6000萬畝，1/3屬鹽堿地，農(nóng)業(yè)發(fā)
展史.在一定程度上是一部和鹽堿作斗爭的歷史。歷來采用水利改良鹽堿地，耕作改良，化學改良，生物改良等多種方法，改良鹽堿地獲得了很大的進展和成績。但是改造鹽堿地是一個世界難題，需要長期卓絕的奮斗。生產(chǎn)不息，奮斗不止。

發(fā)明內(nèi)容
一種農(nóng)用鹽堿消及其應(yīng)用本發(fā)明目地在于用生物技術(shù)獲得一種高效、快速、低成本的治理土地鹽堿地的方法?！N農(nóng)用鹽堿消的組成是，利用嗜鹽桿菌在鹽堿環(huán)境中，能轉(zhuǎn)化鹽堿，成為酶的蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)多為氨基酸的化合物)奇妙的“修復(fù)工具”，能夠修復(fù)DNA，也能夠修復(fù)鹽堿地。 腐植酸小分子是黃腐植酸，黃腐植酸由15種以上氨基酸組成，腐植酸具有離子交換、螯合、 吸附、凝聚、膠溶、還原等綠色功能，有助于修復(fù)鹽堿地。稀土可以提高酶的活性，活化嗜鹽桿菌提供的酶，也就是說提高蛋白質(zhì)的活性。在一定條件下，可促進作物生根發(fā)芽，增加作物葉綠素含量，增強光合作用速率，提高作物對氮、磷、鉀的吸收，稀土可增強作物抗逆性。稀土有“四兩撥千斤的威力”。三者組合，強有力地促進高效、快速、治理鹽堿地，在農(nóng)戶使用多種抗鹽堿產(chǎn)品對比中鹽堿消突顯優(yōu)勢。嗜鹽菌似乎是修復(fù)DNA損傷的高手。為了解其中的奧秘，馬里蘭大學在美國航空航天局的資助下進行了一系列研究。研究人員用輻射轟擊法破壞嗜鹽菌的DNA，使其分裂成碎片，但它們在幾個小時內(nèi)就能將所有的染色體“召集”到一起，重新恢復(fù)正常功能。嗜鹽菌為何能有如此頑強的生存能力？馬里蘭嗜鹽菌研究項目主任喬斯林·迪魯吉羅認為，根本的原因在于嗜鹽菌是在一個原本就不適合生命生存的地方生存和進化的。死海海水的鹽濃度是正常海水的5-10倍，多數(shù)海洋生命在死海里會很快死亡。高鹽濃度導(dǎo)致與輻射類似的后果，使有機體的細胞，特別是細胞中的DNA受損。在這種含鹽量極高的極端環(huán)境中生存和進化，正是嗜鹽菌能夠承受輻射和其他惡劣環(huán)境的原因。在強烈的紫外線光束的照射下， 多數(shù)微生物會全部死亡，但80%的嗜鹽菌活了下來，且能繼續(xù)正常生存和繁殖。研究人員還做了一個實驗，將含有嗜鹽菌細胞的海水置于模擬太空的真空環(huán)境里，結(jié)果水分很快蒸發(fā)， 留下的鹽分形成了含有微量水分的結(jié)晶體，嗜鹽菌細胞躲藏在這些像一個個小房子似的鹽的晶體里，能避免進一步的干燥缺水，可以在很長的一段時間內(nèi)處于半休眠狀態(tài)。如果鹽的晶體有機會重新溶入有水環(huán)境中，嗜鹽菌細胞會重新活躍起來，修復(fù)由于缺水引起的DNA 損傷，迅速恢復(fù)正常的生存活動。
嗜鹽菌為何能在這一系列實驗中存活下來？迪魯吉羅研究小組和西雅圖系統(tǒng)生物技術(shù)研究所的科學家們用現(xiàn)代基因測試工具觀察嗜鹽菌細胞DNA受損的全過程，發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌在受到強烈紫外線照射和被置于模擬太空的真空環(huán)境后，其整套“分子修復(fù)工具”都被激活了。所謂“分子修復(fù)工具”是一種叫做酶的蛋白質(zhì)。嗜鹽菌里有著一定數(shù)量承擔修復(fù)工作并“隨時待命”的酶，當受到致命劑量的輻射照射時，這些“埋伏”著的酶會很快出動，對 DNA進行“搶救”，然后其他種類的酶繼續(xù)其修復(fù)工作，并激活產(chǎn)生這些酶的基因。迪魯吉羅研究小組還發(fā)現(xiàn)，在嗜鹽菌MOO個基因的基因組里包含了好幾套獨特的DNA修復(fù)“工具”。 嗜鹽菌的這些DNA修復(fù)“工具”，有的其他動植物也有，有的則是細菌才有的，還有的是一種叫做archaea太古代微生物(嗜鹽菌所屬的種類)所特有的，嗜鹽菌則擁有所有這些修復(fù) “工具”。此外，它還有幾種別的物種所沒有的新奇的DNA修復(fù)“工具”。嗜鹽菌的分離了解嗜鹽菌在實驗室中的培養(yǎng)方法和高產(chǎn)細菌視紫質(zhì)(Bacteriochodopsin，BR) 的培養(yǎng)條件以及菌種保藏等常規(guī)工作。二、原理嗜鹽菌在系統(tǒng)發(fā)生上與甲烷細菌(methanobacteria)、熱酸菌 (thermoacidophilic bacteria)均屬干古細菌類(archaebacteria)，這禾中只有在極高鹽濃度介質(zhì)中才能生長的細菌在分類學上屬于鹽桿菌科(Halobacteriaceae)、已經(jīng)知道，此科下有兩個屬一個屬為鹽桿菌屬(HalcAacierium)，如鹽制品鹽桿菌(H. salinarium)，鹽生鹽桿菌(H. halobium)；另一個屬為鹽球菌屬(Halococcus)，如鱈鹽球菌(H. mohnruae)，鹽桿菌科的細菌有機體具有古細菌類特征的核糖體(如16S rRNA)；不具有一般細菌所具有的那種細胞壁(如細胞壁上不含有一般細菌細胞壁所具有的肽壤糖等典型組分，而是由糖蛋白組成)；有極端嗜鹽的原核細胞，僅能在大于2mol/L的NaCl中才能正常生長它們的酶系也僅在高鹽的介質(zhì)中才具有正?；钚?；它們的蛋白質(zhì)含有較多的酸性氨基酸殘基等。這一科的生物大都是蛋白水解型的，屬于異養(yǎng)的需氧呼吸代謝類型。當它們從自然界中分離出來時，都包含有C-50類胡蘿卜素，但在自然界中以及在人工培養(yǎng)條件下，均會遇到無色素的菌體。另外，有許多菌株還含有視黃醛(Retinal)類色素，即細菌視紫質(zhì)。 但BR是否存在以及它在細胞中的含量，在任何一個菌株中均與生長條件有關(guān)，因此它不是分類學上的特征。在20世紀60年代，發(fā)現(xiàn)了嗜鹽菌中含BR的膜，即紫膜(為細胞膜的一部分)具有光驅(qū)動的質(zhì)子泵功能，并導(dǎo)致產(chǎn)生光合磷酸化。此后對這一細菌的研究有了更加廣泛的興趣，相繼開展了有關(guān)光能轉(zhuǎn)換、紫膜結(jié)構(gòu)和功能、對極端環(huán)境的調(diào)節(jié)適應(yīng)以及探討古細菌進化途徑的因子等等多方面的研究。嗜鹽菌中細菌的細胞壁由糖蛋白組成，在2mol/L NaCl 中會完全失去其堅硬性，在低于lmol/L NaCl的介質(zhì)中，細胞壁破碎并發(fā)生溶胞。在經(jīng)受中等強度的機械壓力時，也能引起溶胞。這些特點是與另一屬鹽球菌屬不同的。它們的細胞壁由堅固的硫酸鹽雜多糖組成，在水中其結(jié)構(gòu)也不會破壞，細胞也不呈通常的棒形。鹽桿菌的細胞所要求的生長環(huán)境，如介質(zhì)中離子組分、鹽濃度和PH等，常反映了它們的生態(tài)特點，如從高堿性、高鹽分的沙漠潮中分離到的種類都要求高PH、低鎂和高 NaCl濃度的介質(zhì)，而從曬鹽場中分離的則要求中性pH、一般鎂離子濃度和高NaCl濃度的介質(zhì)。
嗜鹽菌生長的條件除了 NaCl鹽濃度要大于2mol/L以外，還要求Na+、Mg2+為細胞外介質(zhì)中的主要陽離子，而在細胞內(nèi)部這類離子也保持著同樣的強度，但K+則是細胞內(nèi)的主要陽離子。本實驗介紹的培養(yǎng)方法主要是以鹽生鹽桿菌作為對象，這是一種從鹽場中分離出來的，目前世界上各實驗室使用最廣泛的嗜鹽菌。三、實驗材料培養(yǎng)鹽生鹽桿菌最好選用Oxoid或holcx蛋白胨。有些蛋白胨如美國 Bacto-Tryptone (Difco0123-01)或 Bacto-p印tone (Difco 0118-01)因含有一種能使嗜鹽菌細胞溶胞的物質(zhì)，故不能使用。有一些蛋白胨在準備培養(yǎng)基過程中會產(chǎn)生少量沉淀，可以在培養(yǎng)基未加熱前用6000g離心30min(20°C )除去，或用0. 45 μ m過濾器去除。液體培養(yǎng)基由蛋白胨加鹽基介質(zhì)(即為保持細菌正常生長所要求的離子組分和高滲濃度的介質(zhì)，常簡稱為路)組成，這樣的培養(yǎng)基常簡寫為RM。鹽生鹽桿菌RM的化學配方如下=NaCl 233. 76g/L，MgSO4 · 7H20 9. 4g/L，Na6C4H5O2 · 2H20(檸檬酸鈉)3. Og/L，KCl 2. Og/L, Oxoid L-37 蛋白胨 10g/L，調(diào)節(jié) pH 為 7. 2 左右。BS即是指上面配方中不含蛋白胨和檸檬酸鈉的溶液。在上述培養(yǎng)基中加入1. 5% (質(zhì)量體積分數(shù))瓊脂后即成固體培養(yǎng)基、121°C、滅菌15 20min。四、方法與步驟1.液體通氣培養(yǎng)細菌可在大體積、透明的玻璃瓶中培養(yǎng)，如20L體積的玻璃瓶，內(nèi)盛IL培養(yǎng)液。將瓶水平放置，這樣可使培養(yǎng)液有較大的表面接受光照。為了給以充分的光照條件，可以在瓶子的上、下兩個方向各放置4只20W的日光燈管。雖然照明對色素形成不一定是必需的，但在照明條件下(IO4 106crg/S · cm2)可以使細菌合成最大產(chǎn)率的紫膜。用處于穩(wěn)定生長期的菌液來接種。細菌可在高達57°C下生長，但為了防止水分過分蒸發(fā)，通常調(diào)節(jié)生長溫度為38 40°C。為了保證良好的有氧生長條件，瓶中必須通氧?？諝庠谖催M入培養(yǎng)液前先流過蒸餾水，以防止培養(yǎng)液的過分蒸發(fā)。培養(yǎng)液中可用噴霧微量抗泡劑以防止泡沫大量形成。在開始生長的3 里，介質(zhì)的通氣量可以保持為250L/h， 這樣的通氣量在開始生長的他里，使4L的培養(yǎng)液達到氧的飽和狀態(tài)，然后氧濃度迅速下降到10%的飽和水平。故在3 后，通氣速率可調(diào)節(jié)到160L/h，這樣的速率使得氧濃度在其后的生長期間保持為低于5%的飽和狀態(tài)。在這樣的氧濃度下，細菌能以最高速率合成紫膜。在IlOh生長后，此時細菌已處于穩(wěn)定生長期約30h，可以收獲。細胞的生長情況可用測定在660nm處的濁度來檢查，也可以進行細胞計數(shù)。紫膜生長通常在細菌生長的對數(shù)期快結(jié)束時出現(xiàn)，而且在氧的供應(yīng)降低時有最大產(chǎn)率。隨著培養(yǎng)條件的變化，紫膜的產(chǎn)率也會有很大差別。某些條件下可以完全不產(chǎn)紫膜。故在實驗室中的不同條件下，需要掌握生長期間的一些參數(shù)。如對數(shù)生長期的廷續(xù)時間、穩(wěn)定生長期的開始時間，介質(zhì)中氧的接受情況等。2.搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)既可為較大量的液體培養(yǎng)準備接種液，也可用來收集紫膜。搖瓶所盛的液體通常為瓶體積的1/4 1/3。搖床振蕩速率的大小控制著搖瓶內(nèi)的氧氣飽和程度。從而控制著紫膜的合成速率。如振蕩頻率為lOOr/min，生長6d，39°C，可以達到最大紫膜產(chǎn)率。而當提高至180r/min時，則菌體有較快的增長速度，但紫膜產(chǎn)率較低。3.菌種保藏菌種可以在RM固體培養(yǎng)基的瓊脂平板上于4°C下保存6個月至1年。平板必須用石蠟?zāi)烂芊夂茫驅(qū)⑵渲糜诿芊獾乃芰洗?，以防干燥。RM瓊脂斜面經(jīng)嚴密封好后，在 4°C下可保存1 2年。處于對數(shù)生長期的液體培養(yǎng)液(在RM基質(zhì)中)在-10°C下可以保存更長時間。4.色素突變菌株的分離嗜鹽菌細胞在RM-瓊脂上形成很清晰的菌落，瓊脂平板上可見有大數(shù)量的細胞， 由它們形成的群體可通過雙筒顯微鏡GX2Q放大進行觀察。根據(jù)不同的顏色可以很容易地識別突變菌落。特別是在反射光下，當它們與大量相鄰親緣群體進行互相對照比較時，更易區(qū)別。在分離時，首先將在RM液體培養(yǎng)中所得到的菌體液在顯微鏡下進行計數(shù)，并用BS 稀釋成IO4個/mL，取0. 05 0. ImL均勻涂布于瓊脂平板上，若平板能得到500 1000個群體，則表明這些細胞的接種效率為100%。必須嚴防干燥，為此可將瓊脂平板保存在密封的塑料袋中，于39°C下培養(yǎng)。第一次觀察可在培養(yǎng)15d以后，第二次觀察在總共培養(yǎng)了 25d 后?？张莸拇嬖趯乐赜绊戭伾?，因為它能將入射光反射回來。在相差顯微鏡下觀察，帶有空泡的單個細胞由于有很強的反射，對比細胞的暗背景顯得很亮。突變菌株用在RM-瓊脂平板上反復(fù)劃線的辦法來純化。突變菌株的表現(xiàn)型應(yīng)加以記錄，并在重新劃線后再觀察檢查。色素突變菌株的分離對于選育BR高產(chǎn)菌株是非常重要的。在連續(xù)做液體培養(yǎng)的進程中，由于菌種變異等多種原因，BR產(chǎn)率將逐漸減少，因此至少每隔一年需要進行一次高產(chǎn)菌株的分離篩選工作。此外，菌株分離工作還應(yīng)用于選育除含BR外的其它色素系統(tǒng)的菌體。(腐植酸)黃腐酸
0對鹽堿地的改良中國有近四億畝鹽堿地，主要分布在東北松遼平原、西北、華北及濱海地區(qū)，包括鹽土和堿土兩大類。鹽土主要是土體內(nèi)含有較多的可溶性鹽類，以NaCl、 Na2SO4為主。堿土主要是土體內(nèi)含有較多的NaHC03、Na2CO3和交換性鈉，使土壤堿性過高， PH值一般在9. 0左右。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，鹽堿土是障礙性低產(chǎn)土壤，其主要矛盾是含有過多的可溶性鹽分，土壤溶液濃度過高，作物吸水困難。在這類土壤中，土壤營養(yǎng)平衡遭到破壞，影響?zhàn)B分的正常吸收。某些堿性鹽類直接毒害、腐蝕作物，破壞作物根部的各種酶，影響新陳代謝和養(yǎng)分的吸收運轉(zhuǎn)能力。鹽堿土土粒分散度高，土壤結(jié)構(gòu)性很差，通氣性不好，耕性不良，是需要改良的惡性土壤?！胞}隨水來，水隨氣散，氣散鹽存”是鹽堿土的基本發(fā)生規(guī)律。通過加強排灌水利工程措施，降低地下水位，促進土體脫鹽過程是有效的改良途徑之一。通過合理施肥改良土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤陽離子代換能力也是不可忽視的。在這類土壤上施用含腐植酸類肥料， 提高土壤的陽離子代換能力，促進土壤團粒結(jié)構(gòu)的形成，就能破壞鹽分上升，減緩表土鹽分的積累，降低表土含鹽量，起到“隔鹽作用”。腐植酸分子上羧基等酸性基團，可在一定程度上中和土壤堿度，并加速Na+的脫除。腐植酸對土壤水有較強的吸持能力，使土壤的保水能力提高，在一定程度上降低了土壤水分的向上運動，從而減少了地面蒸發(fā)失水積鹽過程。腐植酸作為有機物質(zhì)施入土壤后，為土壤微生物提供了能量物質(zhì)，使微生物活力加強，微生物大量繁殖分泌的有機酸也能降低土壤堿度。另外，腐植酸具有較強的生理活性，對根系的發(fā)展及體內(nèi)的碳、氮和水分代謝，多種酶的活性都有促進作用，從而提高了作物的抗鹽堿能力 。提高土壤微生物活性，改善土壤生物學性狀土壤之所以表現(xiàn)出具有生命的特征，主要因為在土壤中生活著種類繁多，數(shù)量巨大的微生物和土壤動物。據(jù)測定每Ig 土壤中就含有300 500萬個微生物，每1畝耕層土壤可含有上千千克活的微生物。土壤作為微生物生活的環(huán)境，在適宜的條件下，這些微生物繁殖極快，活動旺盛，它們對施入或殘留于土壤中的有機物質(zhì)的分解，腐殖質(zhì)的形成，養(yǎng)分的活化、釋放、保持及土壤結(jié)構(gòu)的形成、理化性狀的改善都有重要作用。施用腐植酸或腐植酸復(fù)合肥料能夠促進土壤微生物的活動，增加有益微生物數(shù)量的事實，已被國內(nèi)外大量的研究資料所證實。吉林省農(nóng)科院土肥所的試驗表明，土壤施用腐植酸后微生物活性增強，經(jīng)測定土壤呼吸強度比對照提高1 3倍，土壤纖維素酶，磷酸酶及蛋白酶活性分別提高6% 50^,8.4% 46%，14% 42. 9% [43]0西北農(nóng)學院的測定結(jié)果表明土壤施用風化煤堆慪肥后，土壤中氨化細菌、固氮菌、纖維分解菌等有益微生物數(shù)量平均增加40. 9%，最高可達80% (表3- 43)。吉林市農(nóng)科所的試驗表明，白漿土施用草炭腐植酸復(fù)混肥后使灰漂層微生物總量增加1倍(增加值為2275萬/g 土，其中96. 5%為細菌)。同時土壤中自生固氮菌數(shù)量也明顯增加，與原土相比增加6倍te]。表3-43腐植酸對土壤微生物數(shù)量的影響
處理土壤有益 生物/ 干土)氟化細瞎面λ茵硝化細霣圩維分 細菌微生物兌數(shù)風化煤堆SK1320X10·2290620032724132004XIO4Q50kg/畝)螫遍堆￡￡1040X10 700610031720104004XIO4(250kg/畝〉對擁310X10 60054502008631003X10*1994年河北省農(nóng)業(yè)大學研究了土壤有機質(zhì)含量變化與腐植酸復(fù)合施肥用量的關(guān)系。結(jié)果(表3-44)發(fā)現(xiàn)，肥料中的腐植酸對土壤有機質(zhì)含量增加的直接作用不大。但間接增加作用是直接作用的5 對倍，說明腐植酸復(fù)合肥施入土壤后，以適宜C/N，C/P，C/ K比值供土壤微生物快速繁殖，從而對土壤有機質(zhì)增加產(chǎn)生超補償效應(yīng)，這種效應(yīng)是任何其他化學肥料所不具備的[44]。腐植酸及其肥料對土壤微生物活性的促進作用，不僅有利于土壤有機物質(zhì)的腐殖化和土壤物理、化學性質(zhì)的改善，而且有利于土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與釋放，增加土壤有效養(yǎng)分， 從而有效改善了作物的生長環(huán)境與營養(yǎng)條件，實現(xiàn)用地與養(yǎng)地相結(jié)合，達到培肥地力的目的。實施例一種農(nóng)用鹽堿消生產(chǎn)方法及其應(yīng)用配方工藝原料(1)嗜鹽桿菌液體指標1)含嗜鹽桿菌1. 1 X 106/g以上。(2)黃腐植酸液體含15種以上氨基酸，含黃腐酸6-8%。
(3)稀土(放射性元素在國標以下)嗜鹽桿菌黃腐酸稀土 50 47 3(重量比)將三種原料均勻勾兌，塑料桶包裝。 附圖
是產(chǎn)品加工程序方框圖。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)用鹽堿消的生產(chǎn)方法，其特征在于，所用嗜鹽桿菌是鹽生鹽桿菌作為原料，這是一種從鹽場中分離出來的，目前使用最廣泛的嗜鹽菌，液體含菌濃度要在1. IXioVg以上。配比量50%。
2.按權(quán)利要求1、一種農(nóng)用鹽堿消生產(chǎn)方法，其特征在于，所用的黃腐植酸含有15種以上的氨基酸(天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、色氨酸等)濃度在6-8%。液體配比量是 47%。
3.按權(quán)利要求1、一種農(nóng)用鹽堿消生產(chǎn)方法，其特征在于所用稀土RE203、0. 015%,Cal. 3%,Si9. 02%，有害物質(zhì)汞0，鉻43mg/kg、砷0. 85mg/kg, 鎘0. :3mg/kg、鉛26. :3mg/kg，均在國家標準以下。RE2O3水溶液配比量3%。
4.按權(quán)利要求1、一種農(nóng)用鹽堿消產(chǎn)品包裝采用塑料溶器。
5.按權(quán)利要求1、一種農(nóng)用鹽堿消使用方法，每畝地一公斤兌水1000公斤，均勻噴在地表，然后再噴清水2次，地面無積水為度。
全文摘要
一種農(nóng)用鹽堿消生產(chǎn)方法及其應(yīng)用，本發(fā)明目的在于用生物技術(shù)獲得一種高效、快速、低成本的治理土地鹽堿地的方法。一種農(nóng)用鹽堿消的組成是，利用嗜鹽桿菌在鹽堿環(huán)境中，能轉(zhuǎn)化鹽堿，成為酶的蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)多為氨基酸的化合物)奇妙的“修復(fù)工具”，能夠修復(fù)DNA，也能夠修復(fù)鹽堿地。腐植酸小分子是黃腐植酸，黃腐植酸由15種以上氨基酸組成，腐植酸具有離子交換、螯合、吸附、凝聚、膠溶、還原等綠色功能，有助于修復(fù)鹽堿地。稀土可以提高酶的活性，活化嗜鹽桿菌提供的酶，也就是說提高蛋白質(zhì)的活性。在一定條件下，可促進作物生根發(fā)芽，增加作物葉綠素含量，增強光合作用速率，提高作物對氮、磷、鉀的吸收，稀土可增強作物抗逆性。稀土有“四兩撥千斤的威力”。三者組合，強有力地促進高效、快速、治理鹽堿地，在農(nóng)戶使用多種抗鹽堿產(chǎn)品對比中鹽堿消突顯優(yōu)勢。
文檔編號C09K17/40GK102329623SQ20091011320
公開日2012年1月25日 申請日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日
發(fā)明者魏明重 申請人:魏明重