專利名稱：利用組培技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用組織培養(yǎng)技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法，屬
于作物栽培領域。
背景技術：
連作障礙是一個世界性難題，通常是指同一作物或近緣作物連作以后，即使在正常管理的情況下，也會產生產量降低、品質變劣、生育狀況變差的現象。連作障礙在非禾本科作物中比較突出，隨著設施農業(yè)的發(fā)展，連作障礙已經成為急需解決的栽培難題。 研究表明連作栽培常導致土壤理化性質發(fā)生改變，礦質元素失去平衡，有毒有害物質積累，更重要的是土壤微生物群落的自然平衡遭到破壞。 一些有益微生物的生長受到抑制，而有害微生物迅速蔓延，致使同種作物的生長受抑，種植效益急劇下滑。
近年來，由于分析技術的進步，有關自毒性成分的研究報道越來越多。它們主要是一些酚酸類成分，通過影響作物的多種生理活動而抑制作物生長。如果能夠有效清除這類自毒性成分，那么將顯著改善作物的根際環(huán)境，提高單位土地的生產力。
土壤中酚酸類成分主要來源于作物殘體的降解和根系分泌物，其清除主要靠土壤微生物降解或轉化為腐植酸。腐殖酸是土壤有機質的主體，通常占80%以上。它在土壤中可起到穩(wěn)定土壤團粒結構，緩沖土壤酸堿變化，促進作物生長和微生物活動，協(xié)調水、肥、氣、熱矛盾，提高通氣透水和保水保肥能力，因此被稱為"土中之寶，肥中精華"。 腐殖酸分為兩大類，即褐腐酸和黃腐酸。當細菌活動旺盛時，形成的褐腐酸較多；當真菌活動旺盛時，形成的黃腐酸較多。褐腐酸有利于植物生長，而黃腐酸溶解性強，可造成土壤營養(yǎng)元素流失，降低土壤肥力，從而不利于后茬作物生長。因此針對連作障礙，可以通過人工干預措施，施用有益細菌，促使作物根系發(fā)育，加快酚酸類成分降解，改善根際微生態(tài)，最終達到穩(wěn)產增產的目的。 目前經銷的有益微生物制劑從不同途徑取得，針對性不強，不能適應各地土壤條件，是否能在土壤中定植尚難以確定，更嚴重的是，微生物經過多代繁殖，其發(fā)生變異的幾率很大，優(yōu)良性狀易于喪失。因此快速而有針對性地分離有益微生物的技術是通過有益微生物治理作物連作障礙的關鍵。

發(fā)明內容
針對上述現有技術，本發(fā)明提供了一種快速而有針對性地分離有益微生物的技術，即一種利用組織培養(yǎng)技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的 —種利用組培技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法，步驟如下
l)建立目標作物的組織培養(yǎng)體系 得到無性繁殖的試管苗；
2)從目標作物適宜種植的土壤中或目標作物體表分離得到不同的細菌菌株；
3)制備作物提取物所述作物提取物是指目標作物整體或任何部位的任何溶劑所提取的溶液或其干燥物； 4)在目標作物的組織培養(yǎng)體系中接種步驟2)中得到的不同細菌菌株，觀察、評價各菌株對試管苗生長發(fā)育的影響；有的能促進試管苗的生長，有的抑制或導致試管苗死亡，還有的影響不顯著； 5)在目標作物的組織培養(yǎng)體系中添加作物提取物，培養(yǎng)一段時間后，試管苗有可能在添加作物提取物的培養(yǎng)基中逐漸枯死，難以生長，接種步驟2)中得到的不同細菌菌株，觀察、評價試管苗生長發(fā)育情況，有的菌株能使試管苗恢復生長；
6)在培養(yǎng)基中添加根際土壤常見有機酸，并接種步驟2)中得到的不同細菌菌株，定期測定培養(yǎng)基中有機酸的含量； 7)綜合分析，滿足以下三個條件之一的菌株即可認為是有益細菌菌株
a步驟4)中能促進試管苗生長的菌株； b步驟5)中能促進試管苗生長的菌株；或因添加作物提取物而使試管苗難以生
長，而接種后能使試管苗恢復生長的菌株； c步驟6)中能使有機酸含量顯著下降的菌株； 確定有益細菌菌株后，采用常規(guī)細菌發(fā)酵技術生產有益菌制劑，用于大田預防和治理作物的連作障礙； 以上步驟并無嚴格順序限制，可自由調整，上述1) 7)僅為方便描述，并非順序上的限制。 本發(fā)明利用了組織培養(yǎng)技術，避免了各種環(huán)境因素的影響，不受氣候和季節(jié)的限制，篩選有益細菌的速度得到了顯著的提高；篩選過程中，所用菌株直接來自產區(qū)土壤，完全適應當地土壤環(huán)境，同時，以土壤菌株對目標作物殘體脅迫的緩解能力以及對酚酸類成分的降解能力作為評價指標，所確定有益菌的針對性顯著增強?？傊景l(fā)明的方法有效實用，可行性高，適用于大多數作物的有益菌的篩選。


圖l為不同菌株對地黃試管苗生長的影響示意圖，其中，24號菌促進，35號抑制，37號致死。 圖2為地黃提取物對地黃試管苗生長的影響示意圖，其中，上圖為添加地黃提取物者，下圖為對照； 圖3為地黃提取物對地黃試管苗葉片SOD、 CAT、 POD和APX活性的影響直方圖，其中，橫坐標中0、 1、 2、 3、 4的含義為每50mLMS培養(yǎng)基中添加0.00， 0.75，1.50， 2.25， 3.00mL10X的地黃根系提取液； 圖4為有益菌對地黃提取液所致脅迫的緩解作用示意圖，其中，用地黃根系提取液替代MS培養(yǎng)基中的蔗糖，左接種6號菌株，右未接種細菌，作為對照。
具體實施例方式下面結合克服地黃連作障礙有益細菌的篩選對本發(fā)明作進一步的說明
地黃是一種大宗常用中藥材，其年需求量達2300-2500萬公斤?！洱R民要術》中就已經記載了 "種地黃法"。地黃栽培實踐證明，其連作障礙十分嚴重，早在明代就有記載"種植之后，其土便苦……。足十年，土味轉甜，始可復種地黃。否則味苦形瘦，不堪入藥也"。河南是傳統(tǒng)的地黃種植區(qū)，但由于連作障礙，主產地已轉移到周邊省區(qū)，如山西、河北和山東。 本實例首先通過地黃莖尖培養(yǎng)得到了地黃試管苗，其培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中添加0.2ppm的6-BA。然后利用葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基從山東適宜產區(qū)未種植過地黃的耕作層土壤中分離得到50個細菌菌株，將其分別接種于地黃試管苗基部，發(fā)現有的菌株促進試管苗的生長，有的抑制或導致試管苗死亡，還有的影響不顯著，如圖1所示。選對地黃試管苗具有促進作用的菌株作為初選有益菌。 地黃根系中含有大量水蘇糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖和果糖等。根據含量折算，用60克地黃根系的水提液替代一升MS培養(yǎng)基中的蔗糖，以評價地黃根系提取液對地黃試管苗生長的影響。結果培養(yǎng)30天后發(fā)現地黃試管苗在添加地黃根系提取液的培養(yǎng)基中逐漸枯死，難以生長，而不添加地黃根系提取液的對照組生長良好，如圖2所示。 于MS培養(yǎng)基中添加少量地黃根系提取液時，發(fā)現地黃根系提取液劑量依賴性地導致地黃試管苗葉片的抗氧化酶(SOD、 CAT、 POD和APX)活性下降，如圖3所示。
將對試管苗具有促進作用的初選有益菌接種到用地黃根系提取液替代蔗糖的MS培養(yǎng)基中時，發(fā)現有的菌株對試管苗的生長狀況無改善，而有的可使地黃試管苗恢復生長，如圖4所示。將能克服地黃根系提取物所導致脅迫作用的菌株作為再選有益菌，用于進一步篩選。 在葡萄糖銨鹽培養(yǎng)液中添加地黃根際土壤中積累比較多的6種酚酸類成分，以不加者為對照，分別接種所篩選的8個再選有益菌株，2『C培養(yǎng)12h，結果發(fā)現不添加酚酸的對照培養(yǎng)液中無酚酸的吸收峰，說明菌株本身不產生酚酸，而添加菌株者，其含量顯著下降，結果如表l所示。由于8個菌株對有機酸的降解能力各有優(yōu)勢，因此將這8個菌株均作為能夠克服地黃連作障礙的有益菌。
表l.8個有益菌株對6種酚酸的降解率(％ )
，株— 6 7 2328 一2"^ S 43 根據以上方法，從適宜產區(qū)土壤中分離得到8個有益菌，用PDA培養(yǎng)基分別斜面固體培養(yǎng)，然后經過搖床和發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，混合后作為有益細菌菌液，于地黃種植時浸種，秋季收獲時，連作地塊單產提高49.5%，與非連作地塊單產無顯著差異。
該實例充分說明利用本發(fā)明篩選的有益細菌菌株可以克服地黃的連作障礙，也
o 3
8 2
3 3
7* o
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7 3
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7
2
2 9
2 7
甲
苯
基酸酸酸酸酸
羥草啡香豆甲
對香咖了香苯
5說明本篩選方法的可行性c
權利要求
一種利用組培技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法，其特征在于，步驟如下1)建立目標作物的組織培養(yǎng)體系，得到無性繁殖的試管苗；2)從目標作物適宜種植的土壤中或目標作物體表分離得到不同的細菌菌株；3)制備作物提取物所述作物提取物是指目標作物整體或任何部位的任何溶劑所提取的溶液或其干燥物；4)在目標作物的組織培養(yǎng)體系中接種步驟2)中得到的不同細菌菌株，觀察、評價各菌株對試管苗生長發(fā)育的影響；5)在目標作物的組織培養(yǎng)體系中添加作物提取物，培養(yǎng)一段時間后，接種步驟2)中得到的不同細菌菌株，觀察、評價試管苗生長發(fā)育情況；6)在目標作物的組織培養(yǎng)體系的培養(yǎng)基中添加根際土壤常見有機酸，并接種步驟2)中得到的不同細菌菌株，定期測定培養(yǎng)基中有機酸的含量；7)綜合分析，滿足以下三個條件之一的菌株即可認為是有益細菌菌株a步驟4)中能促進試管苗生長的菌株；b步驟5)中能促進試管苗生長的菌株；或因添加作物提取物而使試管苗難以生長，接種后能使試管苗恢復生長的菌株；c步驟6)中能使有機酸含量顯著下降的菌株；確定有益細菌菌株后，采用常規(guī)細菌發(fā)酵技術生產有益菌制劑，用于大田預防和治理作物的連作障礙；以上步驟并無嚴格順序限制，可自由調整，上述1)～7)僅為方便描述，并非順序上的限制。
2. 根據權利要求1所述的利用組培技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法，其特 征在于所述步驟3)中，作物提取物為作物全株、根、莖或葉的水或有機溶劑提取液。
3. 根據權利要求1所述的利用組培技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法，其特 征在于所述步驟6)中，根際土壤常見有機酸包括對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁 香酸、香豆酸以及苯甲酸等。
4. 根據權利要求1所述的利用組培技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法，其特 征在于所述步驟7)中，綜合評價時，評價的指標包括作物試管苗的高度、顏色、重量
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用組培技術篩選克服作物連作障礙有益細菌的方法，步驟如下先建立目標作物的組織培養(yǎng)體系，并分離細菌菌株、制備作物提取物，然后向目標作物的組織培養(yǎng)體系中接種細菌菌株，并添加作物提取物，觀察其對培養(yǎng)物的影響情況，然后進行綜合分析，確定有益細菌菌株，然后采用常規(guī)細菌發(fā)酵技術生產有益菌制劑，用于大田預防和治理作物的連作障礙。本發(fā)明利用了組織培養(yǎng)技術，避免了各種環(huán)境因素的影響，不受氣候和季節(jié)的限制，篩選有益細菌的速度得到了顯著的提高；本發(fā)明以土壤菌株對目標作物殘體脅迫的緩解能力以及對酚酸類成分的降解能力作為評價指標，所確定有益菌的針對性顯著增強。
文檔編號C09K17/00GK101691600SQ20091001945
公開日2010年4月7日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權日2009年10月20日
發(fā)明者劉峰, 溫學森, 王雪翠, 馬成濤 申請人:山東大學