一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，步驟如下：第一步，pBabe?CMV?EGFP?puro質(zhì)粒的構(gòu)建；第二步，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的建立；第三步，穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系的建立；第四步，炎癥模型的建立；第五步，具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立：將1×107個(gè)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系制成細(xì)胞懸液，采用胰島素注射器，將75μL細(xì)胞懸液自背部肋間隙注射入具有肺部炎癥的裸鼠的左肺，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即為具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型。該建立方法中使用的EGFP能夠產(chǎn)生熒光，發(fā)光強(qiáng)度并可被相應(yīng)儀器設(shè)備檢測(cè)到，從而能夠證實(shí)腫瘤的存在。
【專利說(shuō)明】
一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流行病學(xué)和臨床研究證實(shí)大約25%的成人腫瘤由慢性炎癥引起。例如，胃、肝臟及宮頸的慢性病毒或細(xì)菌感染、以及肺長(zhǎng)期暴露于煙草煙霧或其它環(huán)境化合物，均會(huì)明顯促使這些器官的慢性組織損傷及隨后的腫瘤發(fā)生。
[0003]盡管炎癥與癌癥的關(guān)系已經(jīng)明確，且被稱為“癌癥的第七大特征”，但慢性炎癥在癌癥中發(fā)揮作用的潛在機(jī)制仍未明了，慢性炎癥促進(jìn)腫瘤細(xì)胞迀移、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍有待深入研究。目前關(guān)于炎癥促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的研究仍局限于體外細(xì)胞水平，即采用各種炎癥因子處理肺癌細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移能力的影響。但體外細(xì)胞水平的研究具有一定的局限性，首先，炎癥因子種類眾多，單一的炎癥因子刺激或幾種炎癥因子的組合均難以反映活體內(nèi)的真實(shí)情況;其次，體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)的真實(shí)情況差異巨大，體內(nèi)環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞處于三維生長(zhǎng)狀態(tài)，且受到間質(zhì)細(xì)胞、新生血管生成、多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等諸多因素的影響。因此，研究炎癥對(duì)肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響，有必要建立活體的動(dòng)物模型，但目前尚無(wú)成功的范例。
[0004]建立用于研究慢性炎癥對(duì)肺癌演進(jìn)過(guò)程影響的動(dòng)物模型，需要從兩方面入手，一方面，需在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺組織上誘導(dǎo)出或移植入肺癌，建立肺原位的腫瘤模型；另一方面，需要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上誘導(dǎo)出肺慢性炎癥。兩方面相結(jié)合，方可建立具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型。
[0005]通過(guò)將人肺癌細(xì)胞注入裸鼠肺內(nèi)，可在裸鼠肺內(nèi)生長(zhǎng)出肺癌癌。目前誘導(dǎo)肺慢性炎癥較常用的是豬胰彈性蛋白酶(porcine pancreatic elastase，PPE)，可導(dǎo)致肺內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白的降解，進(jìn)而導(dǎo)致肺氣腫和慢性阻塞性肺炎。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]解決的技術(shù)問(wèn)題:針對(duì)現(xiàn)有的誘導(dǎo)肺慢性炎癥常用的豬胰彈性蛋白酶可導(dǎo)致肺內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白的降解、進(jìn)而導(dǎo)致肺氣腫和慢性阻塞性肺炎的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，該方法將裸鼠肺原位移植瘤模型與PPE誘導(dǎo)的慢性肺炎模型相結(jié)合，成功建立了具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌模型。
[0007]技術(shù)方案:一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，步驟如下:
第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒的構(gòu)建:
I)通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到pBabe-puro酶切產(chǎn)物，其中DNA為pBabe-puro質(zhì)粒，
反應(yīng)體系:
DNA,I yg10XNEbuffer3+BSA,3 yL內(nèi)切酶BamHI，I單位內(nèi)切酶EcoRI，I單位加滅菌超純水至體積30 yL反應(yīng)條件:37°C水浴2h
2)將pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含5100bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物，
3)通過(guò)下列PCR反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFPDNA片段，其中DNA模板為pEGFP-Cl質(zhì)粒，
PCR反應(yīng)體系如下:
5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+ plus) , 10 yLdNTP Mixture(各2.5 mM),4 yL
μΜ) , I yL
反向引物2:5 ’ AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3 ’( 10 μΜ) , I yLDNA模板，100 ng
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/yl),0.5 yL加滅菌超純水至體積50 yL反應(yīng)條件:
98 °C 10 sec 55 °C 15 sec 72 °C I min/kbp 30 Cycles 產(chǎn)物:1400bp
4)將CMV-EGFPDNA片段采用AxyPrep PCR清潔試劑盒進(jìn)行純化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
5)通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，其中DNA為尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
反應(yīng)體系:
DNA,I yg
10XNEbuffer3+BSA,3 yL內(nèi)切酶BamHI，I單位內(nèi)切酶EcoRI，I單位加滅菌超純水至體積30 yL反應(yīng)條件:37°C水浴2h
6)將CMV-EGFP酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含1400bp大小的DNA片段，并采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，
7)采用T4DNA連接酶和快速連接試劑盒，將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，
8)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選，得到抗性篩選后的單克隆菌落，
9)將抗性篩選后的菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒；
第二步，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的建立:
將pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒與輔助包裝原件載體質(zhì)粒VSVG和pMDL g/p RRE用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，即得逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，其中質(zhì)粒的質(zhì)量比例如下:pBabe-CMV-EGFP-puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1 ；
第三步，穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系的建立:
將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)加入肺癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染細(xì)胞，受感染的細(xì)胞的EGFP基因可整合至細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，以終濃度4yg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，建立得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系；
第四步，炎癥模型的建立:
①稱取豬胰彈性蛋白酶粉劑0.0lg溶于ImL生理鹽水中，即為PPE工作液，其中PPE工作液的工作濃度為0.125mg/50yL，適用于重量為20-35g裸鼠，
②采用胰島素注射器，將50yLPPE工作液于裸鼠環(huán)甲膜處注入裸鼠氣管，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即得到具有肺部炎癥的裸鼠，即為炎癥模型；
第五步，具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立:
①將IX 17個(gè)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為50yL，細(xì)胞密度為I X 107/50yL，再與50yL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，
②采用胰島素注射器，將75yL細(xì)胞懸液自背部肋間隙注射入具有肺部炎癥的裸鼠的左肺，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即在裸鼠體內(nèi)建立具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌模型，即為具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型。
[0008]上述所述的第一步的2)中采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是:
①在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積；
②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3個(gè)凝膠體積的BufferDE-A，混合均勻后于75°C加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化；
③再加入0.5個(gè)凝膠體積的BufferDE-B，混合均勻，得到混合液；
④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，000 Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑤將制備管置回2mL離心管，加入500 yL Buffer W1，在12，000Xg離心力下離心30S，棄濾液；
⑥再將制備管置回2mL離心管，加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心30 S，棄濾液，再加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑦將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心Imin;
⑧將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在制備膜中央加入25-30 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心Imin洗脫DNA，即完成純化。
[0009]上述所述的第一步的4)中采用AxyPrep PCR清潔試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是: ①在PCR、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加3個(gè)體積的BufferPCR-A,Buffer PCR-A，不足100 yL時(shí)加至100 yL，接著混勻，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12，000Xg離心I min，棄濾液；
②將制備管置回2mL離心管，加700 yLBuffer W2，12 ,OOOXg離心I min，棄濾液;
③將制備管置于離心管中，將制備管置回2mL離心管，加400 yL Buffer W2，12，OOOXg 離心I min;
④將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在制備管膜中央加25-30 yLEluent或去離子水，室溫靜置I min，12,OOOXg離心I min洗脫DNA。
[0010]上述所述的第一步的7)中將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的具體步驟是:
①將50ng純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物混合，加蒸餾水至總體積為10 μ?；
②加入10 μ? 2XQuick Ligat1n Buffer，混勾；
③加入Iμ I Quick T4 DNA連接酶，混勻；
④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20°C的環(huán)境中。
[0011 ]上述所述的第一步的8)中抗性刪選的具體步驟是:
①取一管感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，在冰上溶解后加入3yL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min;
②將管靜置于42°C中水浴90s后，迅速轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴l-2min;
③在管中加入900yL LB，在37°C中水浴1min;
④將管置于搖床中，在37°C、轉(zhuǎn)速210rpm下?lián)u菌45min;
⑤將100yL已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于氨芐青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37°C培養(yǎng)16-20h，即完成抗性篩選。
[0012]上述所述的第一步的9)中陽(yáng)性克隆篩選的具體步驟是:
(I)菌落PCR篩選:
挑取單克隆菌落，置于300yL含氨芐青霉素的LB中，在37°C、轉(zhuǎn)速280 rpm下?lián)u菌6_8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase進(jìn)行PCR篩選，得到菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克??；
(2)酶切鑒定:
取菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，并采用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，能切出1400bp片段的即為酶切鑒定陽(yáng)性的克隆；
(3)測(cè)序鑒定:
取酶切鑒定陽(yáng)性的克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Clustalx軟件與EGFP序列進(jìn)行比對(duì)，序列匹配即構(gòu)建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒。
[0013]上述所述的(2)中采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒的具體步驟是:
①取1-4mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆的菌液，在12，000 X g離心力下離心I min，棄盡上清液；
②加入250yL Buffer SI懸浮細(xì)菌進(jìn)行沉淀；
③加入250yL Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)混合4_6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；④加350yL Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，在12，000Xg離心力下離心10 min；
⑤吸取步驟④中的離心上清液并轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，000 Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑥將制備管置回離心管，加入500yL Buffer Wl，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑦將制備管置回離心管，加入700yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液，再加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液;
⑧將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心I min;
⑨將制備管移入1.5mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心I min，即完成質(zhì)粒的提取。
[0014]上述所述的第二步中逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)建立的具體步驟是:
①接種293T細(xì)胞至匯合度為70-90%時(shí)轉(zhuǎn)染，得到細(xì)胞培養(yǎng)液；
②使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine3000試劑；
③使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒、VSVG質(zhì)粒和pMDLg/p RRE質(zhì)粒，然后添加P3000試劑，混勻，得到預(yù)混液；
④在已稀釋的Lipofectamine3000試劑中加入等量的預(yù)混液，室溫孵育5min，得到DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；
⑤將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；
⑥轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72h，分別收集富含逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的上清液，上清液通過(guò)超離心濃縮病毒，即得到逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。
[0015]上述所述的具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型，其應(yīng)用價(jià)值還在于，可以在體內(nèi)水平研究某個(gè)基因是否參與了炎癥促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。具體來(lái)說(shuō)，先在肺癌細(xì)胞系中對(duì)目的基因進(jìn)行干預(yù)(采用敲除、敲減、過(guò)表達(dá)等方法改變目的基因的表達(dá)水平，或?qū)δ康幕蜻M(jìn)行基因突變)，再將干預(yù)后和未干預(yù)的細(xì)胞分別植入裸鼠建立移植瘤模型，并用PPE誘導(dǎo)慢性炎癥。通過(guò)比較進(jìn)行和未進(jìn)行目的基因干預(yù)的肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移能力的差異，即可證實(shí)目的基因是否參與了炎癥促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。
[0016]有益效果:本發(fā)明提供的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，該建立方法中使用的EGFP能夠被激光器激發(fā)產(chǎn)生熒光，其發(fā)光強(qiáng)度并可被相應(yīng)儀器設(shè)備(小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，IVIS; Lumina II，PerkinElmer公司)檢測(cè)到，從而能夠證實(shí)腫瘤的存在，并評(píng)估腫瘤的大小。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)炎癥組和對(duì)照組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響檢測(cè)結(jié)果圖。
[0018]圖2為處死炎癥組和對(duì)照組的裸鼠取出腫瘤后的稱重結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下實(shí)施例中所使用的pBabe-puro質(zhì)粒購(gòu)自Addgene公司，酶切反應(yīng)采用NEB公司限制性內(nèi)切酶。
[0020]AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。
[0021]pEGFP-Cl質(zhì)粒購(gòu)自Clontech公司，PCR反應(yīng)采用TAKARA公司的PrimerSTAR HS DNApolymerase,PrimerSTAR HS DNA polymerase購(gòu)自TAKARA公司。
[0022]AxyPrep PCR清潔試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。
[0023]尚未酶切的CMV-EGFPDNA片段以pEGFP_Cl質(zhì)粒為模板，用PCR反應(yīng)體系做出。
[0024]T4 DNA連接酶和快速連接試劑盒購(gòu)自NEB公司。
[0025]感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞購(gòu)自Tiangeng公司。
[0026]質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。
[0027]質(zhì)粒VSVG和pMDLg/p RRE購(gòu)自Addgene公司，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Lifetechnologies 公司。
[0028]豬膜彈性蛋白酶(porcinepancreatic elastase，PPE)購(gòu)自 solarb1公司(活性:彡30u/mg，為粉劑)。
[0029]實(shí)施例1
一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，步驟如下:
第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒的構(gòu)建:
1)通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到pBabe-puro酶切產(chǎn)物，其中DNA為pBabe-puro質(zhì)粒，
反應(yīng)體系:
DNA,I yg
10XNEbuffer3+BSA,3 yL內(nèi)切酶BamHI，I單位內(nèi)切酶EcoRI，I單位加滅菌超純水至體積30 yL反應(yīng)條件:37°C水浴2h;
2)將pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含5100bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物，其中采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是:
①在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積；
②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3個(gè)凝膠體積的BufferDE-A，混合均勻后于75°C加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化；
③再加入0.5個(gè)凝膠體積的BufferDE-B，混合均勻，得到混合液；
④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，
000Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑤將制備管置回2mL離心管，加入500 yL Buffer W1，在12，000Xg離心力下離心30S，棄濾液；
⑥再將制備管置回2mL離心管，加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心30 S，棄濾液，再加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑦將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心Imin; ⑧將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備膜中央加入25-30 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心Imin洗脫DNA，即完成純化；
3)通過(guò)下列PCR反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFPDNA片段，其中DNA模板為pEGFP-Cl質(zhì)粒，
PCR反應(yīng)體系如下:
5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+ plus) , 10 yLdNTP Mixture(各2.5 mM),4 yL
μΜ) , I yL
反向引物2:5 ’ AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3 ’( 10 μΜ) , I yLDNA模板，100 ng
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/yl),0.5 yL加滅菌超純水至體積50 yL反應(yīng)條件:
98 °C 10 sec 55 °C 15 sec 72 °C I min/kbp 30 Cycles 產(chǎn)物:1400bp;
4)將CMV-EGFPDNA片段采用AxyPrep-96 PCR清潔試劑盒進(jìn)行純化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，其中采用AxyPr印PCR清潔試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是:
①在PCR、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加3個(gè)體積的BufferPCR-A,Buffer PCR-A，不足100 yL時(shí)加至100 yL，接著混勻，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12，000Xg離心I min，棄濾液；
②將制備管置回2mL離心管，加700 yLBuffer W2，12 ,OOOXg離心I min，棄濾液;
③將制備管置于離心管中，將制備管置回2mL離心管，加400 yL Buffer W2，12，OOOXg 離心I min;
④將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在制備管膜中央加25-30 yLEluent或去離子水，室溫靜置I min，12,000 Xg離心I min洗脫DNA;
5)通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，其中DNA為尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
反應(yīng)體系:
DNA,I yg
10XNEbuffer3+BSA,3 yL內(nèi)切酶BamHI，I單位內(nèi)切酶EcoRI，I單位加滅菌超純水至體積30 yL反應(yīng)條件:37°C水浴2h;
6)將CMV-EGFP酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含1400bp大小的DNA片段，并采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物； 7)采用T4DNA連接酶和快速連接試劑盒，將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，其中將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的具體步驟是:
①將50ng純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物混合，加蒸餾水至總體積為10 μ?；
②加入10 μ? 2XQuick Ligat1n Buffer，混勾；
③加入Iμ I Quick T4 DNA連接酶，混勻；
④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20°C的環(huán)境中；
8)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選，得到抗性篩選后的單克隆菌落，其中抗性刪選的具體步驟是:
①取一管感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，在冰上溶解后加入3yL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min;
②將管靜置于42°C中水浴90s后，迅速轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴l-2min;
③在管中加入900yL LB，在37°C中水浴1min;
④將管置于搖床中，在37°C、轉(zhuǎn)速210rpm下?lián)u菌45min;
⑤將100yL已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于氨芐青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37°C培養(yǎng)16-20h，即完成抗性篩選；
9)將抗性篩選后的菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒，其中陽(yáng)性克隆篩選的具體步驟是:
(I)菌落PCR篩選:
挑取單克隆菌落，置于300yL含氨芐青霉素的LB中，在37°C、轉(zhuǎn)速280 rpm下?lián)u菌6_8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase進(jìn)行PCR篩選，得到菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克?。?br> (2)酶切鑒定:
取菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，并采用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，能切出1400bp片段的即為酶切鑒定陽(yáng)性的克隆，其中采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒的具體步驟是:
①取1-4mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆的菌液，在12，000 X g離心力下離心I min，棄盡上清液；
②加入250yL Buffer SI懸浮細(xì)菌進(jìn)行沉淀；
③加入250yL Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)混合4_6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350yL Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，在12，000Xg離心力下離心10 min；
⑤吸取步驟④中的離心上清液并轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，
000Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑥將制備管置回離心管，加入500yL Buffer Wl，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液；
⑦將制備管置回離心管，加入700yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液，再加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液;
⑧將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心I min; ⑨將制備管移入1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心I min，即完成質(zhì)粒的提?。?br> (3)測(cè)序鑒定:
取酶切鑒定陽(yáng)性的克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Clustalx軟件與EGFP序列進(jìn)行比對(duì)，序列匹配即構(gòu)建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒。
[0030]第二步，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的建立:
①接種293T細(xì)胞至匯合度為70-90%時(shí)轉(zhuǎn)染；
②使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine3000試劑；
③使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒、VSVG質(zhì)粒和pMDLg/p RRE質(zhì)粒，然后添加P3000試劑，混勻，得到預(yù)混液，其中質(zhì)粒的質(zhì)量比例如下:pBabe-CMV-EGFP-puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1；
④在已稀釋的Lipofectamine3000試劑中加入等量的預(yù)混液，室溫孵育5min，得到DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；
⑤將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；
⑥轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72h，分別收集富含逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的上清液，上清液通過(guò)超離心濃縮病毒，即得到逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。
[0031]第三步，穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系的建立:
將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)加入肺癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染細(xì)胞，受感染的細(xì)胞的EGFP基因可整合至細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，以終濃度4yg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，建立得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系；
第四步，炎癥模型的建立:
①稱取豬胰彈性蛋白酶粉劑0.0lg溶于ImL生理鹽水中，即為PPE工作液，其中PPE工作液的工作濃度為0.125mg/50yL，適用于重量為20-35g裸鼠，
②采用胰島素注射器，將50yLPPE工作液于裸鼠環(huán)甲膜處注入裸鼠氣管，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即得到具有肺部炎癥的裸鼠，即為炎癥模型；
第五步，具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立:
①將IX 17個(gè)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為50yL，細(xì)胞密度為I X 107/50yL，再與50yL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，
②采用胰島素注射器，將75yL細(xì)胞懸液自背部肋間隙注射入具有肺部炎癥的裸鼠的左肺，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即在裸鼠體內(nèi)建立具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌模型，即為具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型。
[0032]對(duì)比例I
本對(duì)比例直接在裸鼠肺接種腫瘤胞，未進(jìn)行PPE處理(即不誘導(dǎo)形成炎癥)。
[0033]將實(shí)施例1中的進(jìn)行PPE處理的裸鼠命名為炎癥組，對(duì)比例I中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的未進(jìn)行PPE處理的裸鼠命名為對(duì)照組，炎癥組和對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的裸鼠各為25只。
[0034]采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)炎癥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。得到的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，炎癥組腫瘤體積明顯大于對(duì)照組。說(shuō)明炎癥促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)。(**P〈0.01，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。)
處死裸鼠后，取出腫瘤并稱重。稱重結(jié)果如圖2所示，炎癥組腫瘤明顯大于對(duì)照組。說(shuō)明炎癥促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)。(**p〈0.01,與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于步驟如下: 第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro 質(zhì)粒的構(gòu)建: 1)通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到pBabe-puro酶切產(chǎn)物，其中DNA為pBabe-puro質(zhì)粒， 反應(yīng)體系: DNA,I yg 10XNEbuffer3+BSA,3 yL 內(nèi)切酶BamHI，I單位 內(nèi)切酶EcoRI，I單位 加滅菌超純水至體積30 yL 反應(yīng)條件:37°C水浴2h 2)將pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含5100bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物， 3)通過(guò)下列PCR反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFPDNA片段，其中DNA模板為pEGFP-Cl質(zhì)粒， PCR反應(yīng)體系如下: 5XPrimeSTAR Buffer(Mg2+ plus) , 10 yL dNTP Mixture(各2.5 mM),4 yL μΜ)，I yL 反向引物2:51八6八八1'1'(:7^(:11^丁八0八6(:111^0^丁3’(10 μΜ) , I yL DNA模板，100 ng PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 υ/μ1)，0.5 yL 加滅菌超純水至體積50 yL 反應(yīng)條件:98 °C 10 sec55 °C 15 sec72 °C I min/kbp30 Cycles產(chǎn)物:1400bp 4)將CMV-EGFPDNA片段采用AxyPrep PCR清潔試劑盒進(jìn)行純化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段， 5)通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，其中DNA為尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段， 反應(yīng)體系: DNA,I yg 10XNEbuffer3+BSA,3 yL 內(nèi)切酶BamHI，I單位 內(nèi)切酶EcoRI，I單位 加滅菌超純水至體積30 yL 反應(yīng)條件:37°C水浴2h 6)將CMV-EGFP酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含1400bp大小的DNA片段，并采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物， 7)采用T4DNA連接酶和快速連接試劑盒，將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物， 8)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選，得到抗性篩選后的單克隆菌落， 9)將抗性篩選后的菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒； 第二步，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的建立: 將pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒與輔助包裝原件載體質(zhì)粒VSVG和pMDL g/p RRE用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，即得逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，其中質(zhì)粒的質(zhì)量比例如下:pBabe-CMV-EGFP-puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1 ； 第三步，穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系的建立: 將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)加入肺癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染細(xì)胞，受感染的細(xì)胞的EGFP基因可整合至細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，以終濃度4yg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，建立得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系； 第四步，炎癥模型的建立: ①稱取豬胰彈性蛋白酶粉劑0.0lg溶于ImL生理鹽水中，即為PPE工作液，其中PPE工作液的工作濃度為0.125mg/50yL，適用于重量為20-35g裸鼠， ②采用胰島素注射器，將50yLPPE工作液于裸鼠環(huán)甲膜處注入裸鼠氣管，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即得到具有肺部炎癥的裸鼠，即為炎癥模型； 第五步，具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立: ①將IX 17個(gè)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肺癌細(xì)胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為50yL，細(xì)胞密度為I X 107/50yL，再與50yL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用， ②采用胰島素注射器，將75yL細(xì)胞懸液自背部肋間隙注射入具有肺部炎癥的裸鼠的左肺，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，即在裸鼠體內(nèi)建立具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌模型，即為具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的2)中采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是: ①在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積； ②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3個(gè)凝膠體積的BufferDE-A，混合均勻后于75°C加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化； ③再加入0.5個(gè)凝膠體積的BufferDE-B，混合均勻，得到混合液； ④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，000 Xg離心力下離心I min，棄濾液； ⑤將制備管置回2mL離心管，加入500 yL Buffer W1，在12，000Xg離心力下離心30S，棄濾液； ⑥再將制備管置回2mL離心管，加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心30 s，棄濾液，再加入700 v-L Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液； ⑦將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心Imin; ⑧將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備膜中央加入25-30 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心Imin洗脫DNA，即完成純化。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的4)中采用AxyPrep PCR清潔試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是: ①在PCR、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加3個(gè)體積的BufferPCR-A,Buffer PCR-A，不足100 yL時(shí)加至100 yL，接著混勻，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12，000Xg離心I min，棄濾液； ②將制備管置回2mL離心管，加700 yLBuffer W2，12 ,OOOXg離心I min，棄濾液; ③將制備管置于離心管中，將制備管置回2mL離心管，加400 yL Buffer W2，12，OOOXg 離心I min; ④將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在制備管膜中央加25-30 yLEluent或去離子水，室溫靜置I min，12,OOOXg離心I min洗脫DNA。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的7)中將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的具體步驟是: ①將50ng純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物混合，加蒸餾水至總體積為10 μ?； ②加入10 μ? 2 XQuick Ligat1n Buffer，混勾； ③加入Iμ I Quick T4 DNA連接酶，混勻； ④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20°C的環(huán)境中。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的8)中抗性刪選的具體步驟是: ①取一管感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，在冰上溶解后加入3yL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min; ②將管靜置于42°C中水浴90s后，迅速轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴l-2min; ③在管中加入900yL LB，在37°C中水浴1min; ④將管置于搖床中，在37°C、轉(zhuǎn)速210rpm下?lián)u菌45min; ⑤將100yL已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于氨芐青霉素平板上； ⑥倒置平板，在37°C培養(yǎng)16-20h，即完成抗性篩選。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的9)中陽(yáng)性克隆篩選的具體步驟是: (I)菌落PCR篩選: 挑取單克隆菌落，置于300yL含氨芐青霉素的LB中，在37°C、轉(zhuǎn)速280 rpm下?lián)u菌6_8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase進(jìn)行PCR篩選，得到菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克??； (2)酶切鑒定: 取菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，并采用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，能切出1400bp片段的即為酶切鑒定陽(yáng)性的克??； (3)測(cè)序鑒定: 取酶切鑒定陽(yáng)性的克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Clustalx軟件與EGFP序列進(jìn)行比對(duì)，序列匹配即構(gòu)建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述(2)中采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒的具體步驟是: ①取1-4mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆的菌液，在12,OOOXg離心力下離心I min，棄盡上清液； ②加入250yL Buffer SI懸浮細(xì)菌進(jìn)行沉淀；③加入250yL Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)混合4_6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液； ④加350yL Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，在12,000 Xg離心力下離心10 min； ⑤吸取步驟④中的離心上清液并轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2mL離心管中，在12，000 Xg離心力下離心I min，棄濾液； ⑥將制備管置回離心管，加入500yL Buffer Wl，在12,000 X g離心力下離心I min，棄濾液； ⑦將制備管置回離心管，加入700yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液，再加入700 yL Buffer W2，在12，000Xg離心力下離心I min，棄濾液; ⑧將制備管置回2mL離心管中，在12，000Xg離心力下離心I min; ⑨將制備管移入1.5mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 yL Eluent或去離子水，室溫靜置I min，在12，000Xg離心力下離心I min，即完成質(zhì)粒的提取。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的肺癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第二步中逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)建立的具體步驟是: ①接種293T細(xì)胞至匯合度為70-90%時(shí)轉(zhuǎn)染； ②使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine3000試劑； ③使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒、VSVG質(zhì)粒和pMDLg/p RRE質(zhì)粒，然后添加P3000試劑，混勻，得到預(yù)混液； ④在已稀釋的Lipofectamine3000試劑中加入等量的預(yù)混液，室溫孵育5min，得到DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物； ⑤將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中； ⑥轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72h，分別收集富含逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的上清液，上清液通過(guò)超離心濃縮病毒，即得到逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK106086076SQ201610515462
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月4日
【發(fā)明人】李偉, 段衛(wèi)明, 吳夢(mèng)瑤, 龔斐然
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)附屬第醫(yī)院, 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院