專利名稱：膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療領(lǐng)域，特別涉及醫(yī)療領(lǐng)域中的尿路上皮腫瘤的動(dòng)物建模技術(shù)。
背景技術(shù)：
為了更好地探索人類疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找預(yù)防及治療方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)已愈 來愈受到人們的關(guān)注。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有許多自發(fā)或誘發(fā)性疾病，能局部或全部地反映人類 類似疾病過程與特點(diǎn)，因此可用于研究相關(guān)的人類疾病。如突變系SHR大鼠，其自發(fā)性高血 壓的變化與人類相似，并伴有高血壓性心血管病變，如腦血栓、梗死等癥狀。貓是弓形蟲的 宿主，是弓形蟲研究中是一個(gè)很好的材料。同時(shí)，在研究白化病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等方 面，也較為理想。非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可感染其他動(dòng)物不可復(fù)制的人類傳染病，如脊髓灰 質(zhì)炎、腦炎、肝炎、麻疹、痢疾、瘧疾等。因此，可作為研究這些疾病發(fā)生、發(fā)展過程及疫苗研 制的理想動(dòng)物。目前，為了能更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)人體膀胱腫瘤的研究，需要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上模擬人患膀 胱腫瘤的模型。而將人腫瘤細(xì)胞接種于動(dòng)物皮下或腹腔的造模方法不能模擬腫瘤在原位器 官中的生長(zhǎng)狀態(tài)。其他的在活體膀胱原位制作浸潤(rùn)性膀胱腫瘤的方法主要有以下2種1.采用手術(shù)為裸小鼠接種人膀胱尿路上皮腫瘤細(xì)胞該方法為手術(shù)切開膀胱，再 將腫瘤細(xì)胞接種至膀胱。2.采用經(jīng)尿道為裸小鼠接種人膀胱尿路上皮腫瘤細(xì)胞該方法為經(jīng)尿道穿刺膀 胱壁，接種腫瘤細(xì)胞。然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用第一種方法不但操作復(fù)雜，會(huì)招致動(dòng)物傷口感 染，而且裸小鼠費(fèi)用昂貴；而第二種方法并非直視下接種，因小鼠膀胱小而薄，極易穿破膀 胱，操作難度大，失敗率極高，而且同樣存在裸小鼠費(fèi)用昂貴的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，使得尿 路上皮腫瘤能自發(fā)性地生長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的原位器官上，從而得到模擬人患膀胱腫瘤的理想 模型。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng) 物模型建立方法，包含以下步驟對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膀胱灌注化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲；通過控制N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間獲得在膀胱原位 的不同分期的尿路上皮腫瘤。本發(fā)明實(shí)施方式與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要區(qū)別及其效果在于用化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲灌注實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膀胱進(jìn)而誘發(fā)膀胱自發(fā)性生長(zhǎng)的 尿路上皮腫瘤，通過控制N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間可獲得在 膀胱原位的不同分期的尿路上皮腫瘤。由于腫瘤是自發(fā)性生長(zhǎng)于膀胱，區(qū)別于腹腔或皮下移植的腫瘤，因而更接近人患膀胱腫瘤時(shí)器官的病理生理狀態(tài)，最接近人的患病狀態(tài)，是模 擬人患膀胱腫瘤的理想模型。適合對(duì)在體器官腫瘤的研究，例如(1)可以觀察藥物、區(qū)域 熱療等方法治療后腫瘤及機(jī)體的病理改變、病理生理改變。(2)適合針對(duì)腫瘤在盆腔局部浸 潤(rùn)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的研究。進(jìn)一步地，通過給予插尿管，灌注致癌劑，即可誘發(fā)膀胱自發(fā)性生長(zhǎng)的尿路上皮腫 瘤，不但操作簡(jiǎn)單，而且成功率高。進(jìn)一步地，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雌性大鼠。由于鼠的基因組和人類在相當(dāng)程度上同源系，因 此是最好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。而選用雌性大鼠不但成本低，可以保證研究所需動(dòng)物數(shù)量，從而 獲得比較多的動(dòng)物模型數(shù)量，而且更便于尿道插管，避免了雄性大鼠因有陰莖骨阻礙導(dǎo)致 尿道插管困難，損傷尿道而導(dǎo)致尿道出血、感染、狹窄。進(jìn)一步地，為每只所述雌性大鼠灌注aiig的所述N-甲基亞硝基脲，隔周灌注一次， 灌注4次，之后繼續(xù)飼養(yǎng)1周，在第8周即可獲得淺表性尿路上皮腫瘤。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，通過 該方法獲得淺表性尿路上皮腫瘤的成功率為100%。進(jìn)一步地，為每只所述雌性大鼠灌注aiig的所述N-甲基亞硝基脲，隔周灌注一次， 灌注6次，之后繼續(xù)飼養(yǎng)4周，在第16周即可獲得浸潤(rùn)性尿路上皮腫瘤。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，通過 該方法獲得浸潤(rùn)性尿路上皮腫瘤的成功率為100%。


圖1是根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法 流程圖。
具體實(shí)施例方式在以下的敘述中，為了使讀者更好地理解本申請(qǐng)而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基于以下各實(shí)施方式的種種變化 和修改，也可以實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方案。為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施 方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明第一實(shí)施方式涉及一種膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，具體 流程如圖1所示。在步驟110中，選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在本實(shí)施方式中，選擇6周齡的雌性大鼠(如近交 系F344大鼠、Wistar大鼠、SD大鼠均可)，體重(150±8)g。接著，在步驟120中，配制化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲的溶液。具體地說，將-20 V 冷凍保存的N-甲基亞硝基脲(N-methyl-nitroso-urea，簡(jiǎn)稱“MNU”)置于4°C放置12小 時(shí)，使用時(shí)將M NU溶解于50mM枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)配成濃度為(10mg/ml)的MNU 溶液。接著，在步驟130中，對(duì)雌性大鼠的膀胱灌注化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲。通過 控制N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間獲得在膀胱原位的不同分期的 尿路上皮腫瘤。在本實(shí)施方式中，以獲得的尿路上皮腫瘤為浸潤(rùn)性尿路上皮腫瘤為例進(jìn)行 具體說明。
首先，進(jìn)行1.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30mg/kg)。然后，仰臥位固定四肢， 尿道口周圍以絡(luò)合碘消毒，選用硬膜外麻醉用導(dǎo)管IOcm長(zhǎng)，石蠟油潤(rùn)滑后以鈍頭插入尿道 3cm進(jìn)入膀胱，用Iml皮試注射器抽出膀胱內(nèi)尿液，大鼠膀胱容量約為0. :3ml，導(dǎo)尿后給予每 只大鼠膀胱灌注MNU 0. 2ml (即每只大鼠每次灌注^iigMNU)，隔周灌注一次，灌注6次 (即每只大鼠一共灌注iangM NU)之后繼續(xù)飼養(yǎng)4周，即第16周即可得到浸潤(rùn)性尿路上皮 腫瘤，不但操作簡(jiǎn)單，而且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，采用該方法獲得的在原位器官(即膀胱)發(fā)生的浸 潤(rùn)性尿路上皮腫瘤的成功率為100%。在本實(shí)施方式中，由于腫瘤是自發(fā)性生長(zhǎng)于膀胱，區(qū)別于腹腔或皮下移植的腫瘤， 因而更接近人患膀胱腫瘤時(shí)器官的病理生理狀態(tài)，最接近人的患病狀態(tài)，是模擬人患膀胱 腫瘤的理想模型。適合對(duì)在體器官腫瘤的研究，例如(1)可以觀察藥物、區(qū)域熱療等方法 治療后腫瘤及機(jī)體的病理改變、病理生理改變。(2)適合針對(duì)腫瘤在盆腔局部浸潤(rùn)以及遠(yuǎn)處 轉(zhuǎn)移情況的研究。而且，由于本實(shí)施方式中采用雌性大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，不但成本低，可以保證研究 所需動(dòng)物數(shù)量，從而獲得比較多的動(dòng)物模型數(shù)量，而且更便于尿道插管，避免了雄性大鼠因 有陰莖骨阻礙導(dǎo)致尿道插管困難，損傷尿道而導(dǎo)致尿道出血、感染、狹窄。此外，可以理解，也可以選用其他類型的雌性大鼠，甚至也可以其他類型的實(shí)驗(yàn) 鼠，如雄性大鼠、裸小鼠等等。雖然在成本或操作簡(jiǎn)易度上不如選用雌性大鼠，但也可以基 本達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ａ硗?，本?shí)施方式中灌注的化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲為濃度為的N-甲基 亞硝基脲溶液。但在實(shí)際應(yīng)用中，也可以通過其他方法配置N-甲基亞硝基脲溶液，所配置 的N-甲基亞硝基脲溶液也可以是0.8%、1. 2%等其他濃度，只需適當(dāng)調(diào)整灌注的溶液量， 保證每只大鼠每次灌注^IigMNU即可。本發(fā)明第二實(shí)施方式涉及一種膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法。第二 實(shí)施方式與第一實(shí)施方式基本相同，區(qū)別主要在于在第一實(shí)施方式中，通過控制N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng) 時(shí)間的方式，獲得的是浸潤(rùn)性尿路上皮腫瘤。然而在本第二實(shí)施方式中，通過控制N-甲基 亞硝基脲的膀胱灌注量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間的方式，獲得的是淺表性尿路上皮腫瘤。具體地說，采用與第一實(shí)施方式中類似的方法，為每只雌性大鼠灌注2mg濃度為 的N-甲基亞硝基脲的溶液，隔周灌注一次。與第一實(shí)施方式不同的是，在第一實(shí)施方式中灌注6次，而在本實(shí)施方式中只需灌注4次(即每只大鼠一共灌注8mgM NU)，之后繼續(xù)飼 養(yǎng)1周，在第8周即可獲得淺表性尿路上皮腫瘤。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，通過該方法獲得淺表性尿路 上皮腫瘤的成功率為100%。由此可見，本實(shí)施方式不但操作簡(jiǎn)單，而且通過控制MNU膀胱灌注量及動(dòng)物的生 長(zhǎng)時(shí)間，獲得在原位器官(即膀胱)發(fā)生的淺表性尿路上皮腫瘤的成功率也極高。雖然通過參照本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了圖示和描述，但 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該明白，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作各種改變，而不偏離本發(fā) 明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，其特征在于，包含以下步驟對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膀胱灌注化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲；通過控制所述N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間獲得在膀胱 原位的不同分期的尿路上皮腫瘤。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，其特征在于， 所述不同分期的尿路上皮腫瘤為淺表性尿路上皮腫瘤和浸潤(rùn)性尿路上皮腫瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，其特征在于， 所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雌性大鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，其特征在于， 通過以下控制所述N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間的方式，獲 得淺表性尿路上皮腫瘤為每只所述雌性大鼠灌注ang的所述N-甲基亞硝基脲，隔周灌注一次，灌注4次，之后 繼續(xù)飼養(yǎng)1周，在第8周即可獲得淺表性尿路上皮腫瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，其特征在于， 通過以下控制所述N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間的方式，獲 得浸潤(rùn)性尿路上皮腫瘤為每只所述雌性大鼠灌注ang的所述N-甲基亞硝基脲，隔周灌注一次，灌注6次，之后 繼續(xù)飼養(yǎng)4周，在第16周即可獲得浸潤(rùn)性尿路上皮腫瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法，其特征在于， 所述雌性大鼠為近交系F344大鼠、Wistar大鼠或SD大鼠。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法， 其特征在于，在對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膀胱灌注化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲之前，還包含以下步 驟將-20°C冷凍保存的N-甲基亞硝基脲置于4°C放置12小時(shí)，使用時(shí)將N-甲基亞硝基 脲溶解于50mM枸櫞酸緩沖液，配成濃度為1 %的N-甲基亞硝基脲溶液，其中所述枸櫞酸緩 沖液的氫離子濃度指數(shù)PH值為6. 0 ；所述灌注的化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲為所述濃度為的N-甲基亞硝基脲溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法， 其特征在于，在所述對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膀胱灌注化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲的步驟中，包含以 下子步驟對(duì)所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物插尿管，通過所插的尿管灌注所述N-甲基亞硝基脲。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)療領(lǐng)域，公開了一種膀胱原位的尿路上皮腫瘤動(dòng)物模型建立方法。本發(fā)明中，用化學(xué)致癌劑N-甲基亞硝基脲灌注實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膀胱進(jìn)而誘發(fā)膀胱自發(fā)性生長(zhǎng)的尿路上皮腫瘤，通過控制N-甲基亞硝基脲的膀胱灌注量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)間可獲得在膀胱原位的不同分期的尿路上皮腫瘤。由于腫瘤是自發(fā)性生長(zhǎng)于膀胱，區(qū)別于腹腔或皮下移植的腫瘤，因而更接近人患膀胱腫瘤時(shí)器官的病理生理狀態(tài)，最接近人的患病狀態(tài)，是模擬人患膀胱腫瘤的理想模型。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102038961SQ200910201608
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日
發(fā)明者劉紅耀, 張旭, 米振國(guó) 申請(qǐng)人:劉紅耀, 張旭, 米振國(guó)