一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法，通過檢測囊胚中少量滋養(yǎng)層細(xì)胞的DNA甲基化譜，以加納德形態(tài)囊胚分級中的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平平均值和模式作為篩選發(fā)育優(yōu)良囊胚的標(biāo)準(zhǔn)，待測囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化水平越接近優(yōu)良胚胎甲基化水平或狀態(tài)，胚胎發(fā)育越優(yōu)良、越適于植入母體；同時(shí)對甲基化測序結(jié)果的分析可以判斷染色體是否異常，直接剔除染色體異常的胚胎。本發(fā)明方法可以讓臨床醫(yī)生選擇既是染色體倍數(shù)正常、又是表觀遺傳圖譜更優(yōu)良的胚胎進(jìn)行胚胎移植，可以大幅提升輔助生殖技術(shù)的精準(zhǔn)性，有利于降低自然流產(chǎn)率，提高妊娠質(zhì)量，提高試管嬰兒出生率。
【專利說明】
-種篩選優(yōu)良發(fā)育囊化的無創(chuàng)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及全基因組水平的表觀遺傳信息學(xué)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種篩選優(yōu)良發(fā) 育囊胚的無創(chuàng)檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體外受精和胚胎移植（IVF-ET)俗稱"試管嬰兒"。是一種特殊的臨床輔助生殖技 術(shù)，需要把卵子和精子都拿到體外來，讓它們在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程，然后 把早期胚胎移植到女性的子宮中，在子宮中孕育成為孩子。運(yùn)種利用體外受精技術(shù)產(chǎn)生的 嬰兒也稱為試管嬰兒。植入前要對體外獲得的胚胎進(jìn)行篩選，目前臨床上有W下兩種方法：
[0003] (1)加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)（Gardner mo;rphological blastocyst grading system)。在試管嬰兒過程中囊胚培育與移植是很重要的一個(gè)步驟。而試管嬰兒囊胚質(zhì)量的 好壞是決定成功與否的重要因素。目前臨床上采用加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)，根據(jù)囊胚腔 的大小和是否解化，將囊胚的發(fā)育分為六個(gè)時(shí)期。1期:早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎總 體積的1/2; 2期:囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2; 3期:完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全 占據(jù)了胚胎的總體積;4期:擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變?。?5期:正在解出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期:解出的囊胚，囊胚全部從透明帶 中逸出。處于3至6期的囊胚，還需對其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量分級。細(xì)胞團(tuán)分級:A 級，細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密;B級，細(xì)胞數(shù)目少，排列松散;C級，細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分 級:A級，上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密;B級，上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié) 構(gòu)松散;C級，上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成。根據(jù)運(yùn)個(gè)分級方法，最好的囊胚評分應(yīng)該是第 5天的囊胚3AA，第6、7天的囊胚4AA。在ART治療中，AA級的胚胎是最理想的選擇，但臨床上只 有33 %的夫婦可W獲得AA級胚胎用于植入，52 %的患者只能獲得B*級囊胚（包含AB，BA， BB)dAA級胚胎的出生率為39%，B*級的胚胎出生率約為28%，而C*級（包含BC，CB)，出生率 為4%，其中CC級的出生率幾乎為0。
[0004] 加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)（Gardner morphological blastocyst grading system),是傳統(tǒng)的依賴顯微鏡技術(shù)，挑選形態(tài)學(xué)等級高的胚胎進(jìn)行移植的胚胎形態(tài)學(xué)，準(zhǔn) 確率差。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，只憑形態(tài)學(xué)檢測的輔助生殖治療的反復(fù)流產(chǎn)人群的流產(chǎn)率為 33.5 %，臨床妊娠率為45.8 %。因?yàn)樵嚬軏雰浩骄晒β蕿?0-30 %，為提高一次植入成功 率，一般會同次植入2-3個(gè)胚胎，因此往往會出現(xiàn)一些多胞胎的現(xiàn)象。多胞胎比單胎更具有 風(fēng)險(xiǎn)性，運(yùn)種危險(xiǎn)對于媽媽和孩子來說都存在。因此，為了保護(hù)母子的安全，=胞胎W上，原 則上需要進(jìn)行減胎術(shù)，減胎手術(shù)有10%的機(jī)會造成全部胚胎流產(chǎn)。
[0005] 所W需要新的方法提高試管嬰兒成功率，避免了因盲目地移植了多個(gè)胚胎W提高 妊娠成功率，導(dǎo)致多胎妊娠而不得不在孕期實(shí)施減胎術(shù)造成的危害及倫理道德上的沖突。
[0006] (2)胚胎植入前基因篩查，即第S代試管嬰兒（pre-implantation genetic screening/diagnosis ,PGS/PGD)。1990年，英國化ndyside成功地用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技 術(shù)分析卵裂球?qū)π赃B鎖性疾病攜帶者進(jìn)行胚胎性別篩選后的妊娠分娩，完成了世界上第一 例PGS，開創(chuàng)了產(chǎn)前篩查的新紀(jì)元。進(jìn)入90年代，植入前篩查技術(shù)有了飛速發(fā)展。1994年， Monne用巧光原位雜交(fluorescent in situ hybridization,FISH)技術(shù)，在植入前篩查 染色體非整倍體及胚胎性別獲得成功。此后，多重PCR，巧光PCR，多色FI甜等技術(shù)陸續(xù)發(fā)展。 1998年FI甜開始應(yīng)用于染色體平衡易位的PGS。通過選擇正常和平衡配子或胚胎，PGS可顯 著降低染色體易位導(dǎo)致的反復(fù)自然流產(chǎn)率。同年，商業(yè)化供應(yīng)的能同時(shí)篩查13，18,21，X和Y 五條染色體的五色探針也開始用于PGS中進(jìn)行高齡婦女卵子和胚胎的非整倍體篩選。1999 年W來陸續(xù)開展的間期核轉(zhuǎn)換（interphase nuclerconversion)技術(shù)，比較基因組雜交 (comparative genomic hybr i d i zat i on，CGH)，全基因組擴(kuò)增（who I e genome amplification，WGA)技術(shù)相繼用于PGS，進(jìn)一步促進(jìn)了該技術(shù)的研究和應(yīng)用。2010年W來， 高通量測序技術(shù)化igh-throughput sequencing)開始飛速發(fā)展，一次對幾十萬到幾百萬條 DNA分子進(jìn)行序列測定，對一個(gè)胚胎的基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，將PGS帶入全 新的領(lǐng)域。國內(nèi)外對PGS技術(shù)的研究熱情一直沒有停止過，目前PGS主要應(yīng)用于W下遺傳病 的診斷:a.染色體數(shù)目異常;b.胚胎性別診斷;C.基因缺失型遺傳病;d.胚胎單基因病檢查。
[0007] 目前，美國有約12%的生育期婦女需要借助輔助生殖技術(shù)ART生育子代。在自然受 孕的人群中，也有相當(dāng)一部分由于胚胎發(fā)育異常而流產(chǎn)。在ART術(shù)后，大部分胚胎發(fā)育異常 而流產(chǎn)?；蚪M不穩(wěn)定性，例如各種基因突變，染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常等，是導(dǎo)致流產(chǎn)的一 個(gè)重要原因。為排除基因缺陷的早期胚胎，臨床上采用植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù) (preimplantation genetic dia即osis，PGD)。運(yùn)種技術(shù)是采用顯微操作的方法從植入前 胚胎的滋養(yǎng)層中分離出數(shù)個(gè)細(xì)胞，對運(yùn)幾個(gè)細(xì)胞進(jìn)行基因組檢測。PGD技術(shù)目前被廣泛用于 臨床，被稱為"第=代試管嬰兒"，大大降低了接受輔助生殖治療的反復(fù)流產(chǎn)人群的流產(chǎn)率， 提局了臨床妊娠率。
[0008] PGS胚胎植入前基因篩查，只針對染色體數(shù)目或是DNA序列發(fā)生改變的遺傳性疾病 有篩查作用。臨床上還有大部分不孕或流產(chǎn)并不是由于DNA序列的改變導(dǎo)致的，仍有大部分 的胚胎流產(chǎn)是沒有任何已知的原因。
[0009] 表觀遺傳信息在動物發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。機(jī)體內(nèi)的所有細(xì)胞共用一 套DNA序列，然而在表觀基因組的調(diào)控下，使得細(xì)胞分化成不同的種類，形成不同的器官。也 就是說，在胚胎早期發(fā)育過程中不同發(fā)育階段的細(xì)胞必須遵循特定的表觀基因組模式，運(yùn) 種模式確保了胚胎的全能性，指導(dǎo)其向正確的方向分化發(fā)育。哺乳動物早期胚胎發(fā)育的過 程中會出現(xiàn)全基因組水平的DNA去甲基化。人為地敲除甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMTs或是Tet3的基因 序列，阻止DNA甲基化重編程，可W導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明目的在于提供一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法，基于胚胎植入前表 觀基因組篩查技術(shù)（preimplantation epigenetic examination,陽GE)，該方法是世界上 首次使用表觀遺傳信息的方法來鑒定胚胎的狀態(tài)，在體外培養(yǎng)階段的囊胚中，分離出幾個(gè) 滋養(yǎng)層細(xì)胞，運(yùn)幾個(gè)細(xì)胞對整個(gè)胚胎是無創(chuàng)傷性的，但可W代表整個(gè)胚胎的甲基化狀態(tài)W 及各條染色體的倍數(shù)狀態(tài)。
[0011] 在胚胎發(fā)育成桑權(quán)胚后，桑權(quán)胚進(jìn)一步分裂，同時(shí)宮腔中的分泌液通過透明帶滲 入細(xì)胞而逐漸形成一囊腔，成為囊胚腔。包圍在囊胚腔外的為扁平細(xì)胞層，該層細(xì)胞個(gè)體較 小的，將演變?yōu)樘ケP的一部分，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞。聚集在胚胎的一端，個(gè)體較大的細(xì)胞，稱為 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass,ICM)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞是一種未分化的細(xì)胞，具 有發(fā)育全能性，將來發(fā)育成胎兒的各種組織。由于滋養(yǎng)層細(xì)胞將來發(fā)育成胎膜和胎盤，所W 做基因診斷時(shí)，通常取少量滋養(yǎng)層細(xì)胞檢測，運(yùn)樣不會影響正常胎盤的形成，更不會影響胎 兒發(fā)育。
[0012]本發(fā)明采用"one-tube"方法構(gòu)建微量細(xì)胞全基因組甲基化文庫，之后對樣品進(jìn)行 全基因組甲基化測序。將AA級胚胎的平均甲基化水平作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，即臨床植入前胚胎無 創(chuàng)檢測的定量標(biāo)準(zhǔn)。被測胚胎的甲基化狀態(tài)越接近標(biāo)準(zhǔn)值，證明其發(fā)育狀態(tài)越優(yōu)良，發(fā)育成 為正常胎兒的潛能越大，越適合移植。同時(shí)，對測量的甲基化結(jié)果進(jìn)行分析，可W判斷各個(gè) 胚胎基因組中染色體倍數(shù)是否異常，而染色體不正常的胚胎不能被用作胚胎移植。因此，通 過本發(fā)明的方法，可W讓臨床醫(yī)生選擇不僅是染色體倍數(shù)正常、而且是表觀遺傳圖譜更優(yōu) 良的胚胎進(jìn)行胚胎移植。
[OOU]本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，W加德納形態(tài)囊胚分級中形態(tài)優(yōu)良的AA級的胚胎全基因組甲基 化水平非常一致（圖1);而形態(tài)學(xué)一般的B*胚胎中部分胚胎的全基因組甲基化水平與AA級 水平一致、部分胚胎的甲基化水平與AA級胚胎的水平差別較大（圖2);形態(tài)學(xué)差的C*胚胎中 絕大多數(shù)胚胎全基因組甲基化水平都與AA級胚胎的甲基化水平有明顯差別（圖1)?？傊?，形 態(tài)學(xué)分型越差的和AA級相比，包含甲基化水平差別的胚胎的比例越大。
[0014] 同時(shí)，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)所有的AA級胚胎的甲基化模式(DNA methylation pattern) 十分相似（圖3、圖4)，（即相同的基因組區(qū)域，不同的胚胎中呈現(xiàn)相同的高甲基化或是低甲 基化的狀態(tài)）。而低質(zhì)量的胚胎呈現(xiàn)出各種不同的狀態(tài)（圖3、圖4)。
[0015] 本發(fā)明證明了人類早期胚胎發(fā)育過程中會出現(xiàn)全基因組水平的表觀遺傳信息的 不穩(wěn)定，運(yùn)是導(dǎo)致出生率降低的重要因素之一，基因組DNA甲基化譜在胚胎發(fā)育的過程中起 著至關(guān)重要的作用，甲基化有問題的胚胎中一些關(guān)鍵基因的調(diào)控區(qū)域甲基化出現(xiàn)了問題 (圖5、圖6)。甲基化水平符合或接近標(biāo)準(zhǔn)的囊胚是胚胎移植的最理想選擇?？蒞通過PEGE檢 測，篩選出甲基化水平更接近AA級的胚胎進(jìn)行植入，直接對胚胎的表觀遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析， 判斷胚胎是否發(fā)育異常，篩選出更加適合移植的胚胎?？蒞潛在地大幅提升輔助生殖技術(shù) 的精準(zhǔn)性，提高"試管嬰兒"的妊娠成功率，降低自然流產(chǎn)率，提高妊娠質(zhì)量，提高試管嬰兒 出生率(圖7)。
[0016] 而且，無創(chuàng)傷的獲取幾個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞而測量的甲基化水平可W代表整個(gè)胚胎的 DNA甲基化水平（圖8)。因此，本檢測方法首選無創(chuàng)傷的獲取滋養(yǎng)層中的幾個(gè)細(xì)胞，進(jìn)而測量 運(yùn)幾個(gè)細(xì)胞的甲基化圖譜。W加納德形態(tài)囊胚分級中的AA級胚胎的甲基化水平平均值0.3 ±0.02作為篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的標(biāo)準(zhǔn)。對同一父母來源的多個(gè)胚胎，甲基化水平越接近0.3 的胚胎越適合胚胎的移植。
[0017] 過去檢測胚胎是否可W移植的一個(gè)重要指標(biāo)是胚胎的染色是否異常，測量的甲基 化圖譜，同時(shí)可W判定胚胎的各個(gè)染色體的倍數(shù)是否正常。例如使用甲基化圖譜的數(shù)據(jù)，發(fā) 現(xiàn)很多胚胎的染色體發(fā)生了錯(cuò)誤(表2)，例如對樣品S-25-4CC的染色體分析（圖9)，發(fā)現(xiàn)第4 號一個(gè)大片段多了一個(gè)拷貝、而第9號染色體中一個(gè)大片段少了一個(gè)拷貝，說明此胚胎不能 用于胚胎的移植。
[0018] 總之，通過無創(chuàng)傷的獲取滋養(yǎng)層中的幾個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行甲基化圖譜的測量，可W獲得 甲基化水平指標(biāo)、甲基化模式、W及染色體的狀態(tài)，從而可W讓臨床醫(yī)生選擇既是染色體倍 數(shù)正常、又是表觀遺傳圖譜更優(yōu)良的胚胎進(jìn)行胚胎移植。
[0019] 具體地，本發(fā)明提供一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法，對待檢囊胚滋養(yǎng)層 細(xì)胞基因組進(jìn)行甲基化檢測，W加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化 水平為標(biāo)準(zhǔn)，甲基化水平接近或等于該標(biāo)準(zhǔn)的，則待檢囊胚發(fā)育優(yōu)良，所述加德納形態(tài)囊胚 分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎是指44、48、84、86級囊胚。
[0020] 本發(fā)明提供的一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法還包括W加德納形態(tài)囊胚 分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化模式(DNA methylation pattern)為標(biāo)準(zhǔn)。
[0021] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法還包括根據(jù)甲基 化測序結(jié)果，判斷囊胚各個(gè)染色體倍數(shù)是否正常，若為標(biāo)準(zhǔn)二倍體則待測囊胚染色體正常。
[0022] 本發(fā)明提供了上述無創(chuàng)檢測方法在提高妊娠率中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明提供了一種提高試管嬰兒出生率的方法，篩選滋養(yǎng)層細(xì)胞甲基化水平接近 或等于加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平值的囊胚進(jìn)行移植， 所述加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎是指44、48、84、88級囊胚。
[0024] -種提高試管嬰兒出生率的方法，還包括根據(jù)滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化測序結(jié)果，篩 選待測囊胚的甲基化測序結(jié)果顯示所有染色體均為標(biāo)準(zhǔn)二倍體的囊胚進(jìn)行移植。
[0025] 本發(fā)明提供一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的試劑盒，其為囊胚甲基化測序的試劑盒，W 加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平為標(biāo)準(zhǔn)，甲基化水平接近或 等于該標(biāo)準(zhǔn)的，則待檢囊胚發(fā)育優(yōu)良，所述加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚 胎是指44、48、84、86級囊胚。
[0026] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的試劑盒為囊胚甲基化測序的試 劑盒，當(dāng)待測囊胚的甲基化測序結(jié)果顯示所有染色體均為標(biāo)準(zhǔn)二倍體時(shí)，待測囊胚為發(fā)育 優(yōu)良囊胚。
[0027] 優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒的檢測對象為囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞。
[0028] 本發(fā)明提供了加納德形態(tài)囊胚分級中的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平值在制備篩 選優(yōu)良發(fā)育囊胚的試劑盒中的應(yīng)用，所述加德納形態(tài)囊胚分級中的形態(tài)優(yōu)良胚胎是指AA、 AB、BA、BB級囊胚。
[0029] 具體地，采用本發(fā)明實(shí)施例的甲基化測序方法對待檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的基因組進(jìn) 行甲基化測序，檢測待檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化水平，若甲基化水平在0.3±0.2范圍內(nèi)， 則待檢囊胚發(fā)育優(yōu)良。
[0030] 優(yōu)選地，待檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化水平在0.3 ±0.02范圍內(nèi)，則待檢囊胚發(fā)育 優(yōu)良。
[0031] 再優(yōu)選地，待檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化模式(DNA methylation pattern)接近 AA級囊胚的模式，則待檢囊胚發(fā)育優(yōu)良。
[0032] 更優(yōu)選地，本發(fā)明篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法還包括根據(jù)甲基化測序得到 的數(shù)據(jù)，判斷囊胚各個(gè)染色體倍數(shù)是否正常，若為標(biāo)準(zhǔn)二倍體則待測囊胚染色體正常。
[0033] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種提高試管嬰兒出生率的方法，采用本發(fā)明實(shí)施例的甲基 化測序方法，篩選滋養(yǎng)層細(xì)胞甲基化水平為0.3 ± 0.2的囊胚進(jìn)行移植。
[0034] 優(yōu)選地，篩選滋養(yǎng)層細(xì)胞甲基化水平為0.3 ± 0.02的囊胚進(jìn)行移植。
[0035] 更優(yōu)選地，還包括根據(jù)滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化測序結(jié)果，篩選所有染色體均為標(biāo)準(zhǔn) 二倍體的囊胚進(jìn)行移植。
[0036] 本發(fā)明提供一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的試劑盒，采用本發(fā)明實(shí)施例的甲基化測序方 法，當(dāng)待測囊胚的甲基化水平平均值為0.3 ± 0.2、甲基化模式接近AA級囊胚的模式和/或待 測囊胚的甲基化測序結(jié)果顯示所有染色體均為標(biāo)準(zhǔn)二倍體時(shí)，待測囊胚發(fā)育優(yōu)良。
[0037] 優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒當(dāng)待測囊胚的甲基化水平平均值為0.3±0.02、甲基化模式 接近AA級囊胚的模式和/或待測囊胚的甲基化測序結(jié)果顯示所有染色體均為標(biāo)準(zhǔn)二倍體 時(shí)，待測囊胚發(fā)育優(yōu)良。
[0038] 本發(fā)明試劑盒其檢測對象為囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞。
[0039] 本發(fā)明還提供了加納德形態(tài)囊胚分級中的AA級胚胎的甲基化水平值在制備篩選 優(yōu)良發(fā)育囊胚的試劑盒中的應(yīng)用。采用本發(fā)明實(shí)施例的甲基化檢測方法，檢測到AA級胚胎 的甲基化水平值為0.3 ± 0.02。待檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化水平越接近0.3，則待檢囊胚 越適合胚胎移植。
[0040] 本方法還可W同時(shí)檢測胚胎中各條染色體的狀態(tài)，染色體中沒有出現(xiàn)拷貝數(shù)變化 的胚胎才能用于胚胎移植，即都是標(biāo)準(zhǔn)的二倍體胚胎才可W用于移植。
[0041] 本發(fā)明中，一種甲基化測序，同時(shí)獲得兩種指標(biāo)，即胚胎DNA甲基化的圖譜(含DNA 甲基化水平)和胚胎各條染色體的狀態(tài)，通過同時(shí)綜合兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行胚胎的篩選，用于胚胎 的輔助生殖。對比過去的方法具有巨大的優(yōu)勢。
[0042] 本發(fā)明方法是對植入前胚胎的發(fā)育狀態(tài)和發(fā)育潛能的量化篩選。本發(fā)明方法和傳 統(tǒng)的形態(tài)學(xué)篩選具有相同的應(yīng)用范圍，適合所有形態(tài)學(xué)分型的胚胎，包括AA級，B*級或者C* 級，但該方法更加客觀，準(zhǔn)確。同時(shí)，該技術(shù)可W用于所有胚胎的篩查，該技術(shù)有望大幅提升 輔助生殖技術(shù)的精準(zhǔn)性，降低手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，減輕患者痛苦，進(jìn)一步提高試管嬰兒成功率。本發(fā) 明的有益效果具體表現(xiàn)在：
[0043] 1、本發(fā)明方法是基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和PGS基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步對發(fā)育優(yōu)良的胚胎進(jìn)行 量化篩選，提高試管嬰兒成功率，降低流產(chǎn)率。
[0044] 與傳統(tǒng)依賴顯微鏡技術(shù)，挑選形態(tài)學(xué)等級高的胚胎進(jìn)行移植的胚胎形態(tài)學(xué)相比， 本發(fā)明方法更加客觀，避免了形態(tài)學(xué)分型中人為的不確定性，很多形態(tài)學(xué)的檢測更加依賴 醫(yī)護(hù)人員的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)。同時(shí)，形態(tài)學(xué)的好壞不能完全代表基因組和表觀基因組的狀態(tài)，無法 準(zhǔn)確預(yù)測囊胚的發(fā)育狀態(tài)和潛能。而本發(fā)明方法可直接對胚胎的表觀遺傳信息進(jìn)行測量和 分析，準(zhǔn)確判斷胚胎是否具有標(biāo)準(zhǔn)的DNA甲基化圖譜，是否具備正常發(fā)育成胎兒的潛能，同 時(shí)也檢測了染色體是否正常，篩選出發(fā)育良好的和染色體正常的胚胎。本PEGE方法，在國際 上首次提出了使用表觀遺傳學(xué)信息進(jìn)行篩選胚胎、進(jìn)行移植前檢測的概念。
[0045] 2、本發(fā)明PEGE方法優(yōu)于目前正在使用的PGS方法
[0046] PGD/PGS是國際上對胚胎的DNA序列和染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的常用方法，判斷胚胎 是否存在染色體異常。但對正常的無染色體異?；蜻z傳性疾病的大多數(shù)人群沒有作用，無 法提升大多數(shù)人群ART術(shù)后的妊娠率和嬰兒出生率。而本發(fā)明篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢 巧巧法適用于所有人群，同時(shí)也能夠檢測染色體的異常。因此本PEGE方法既完成了已有PGS 方法檢測染色體是否存在不等倍性的問題，同時(shí)又篩選了胚胎發(fā)育表觀狀態(tài)更好的胚胎， 因此本方法明顯的好于已有的PGS方法。因此本PEGE方法將來應(yīng)用于臨床有望成為植入前 胚胎最常規(guī)、最基礎(chǔ)、最精確的篩選的手段。
[0047] 3、避免多胎妊娠，減少實(shí)施減胎術(shù)
[004引因?yàn)樵嚬軏雰浩骄晒β蕿?0%-30%，為提高一次植入成功率，一般會同次植入 2-3個(gè)胚胎，因此往往會出現(xiàn)一些多胞胎的現(xiàn)象。多胞胎比單胎更具有風(fēng)險(xiǎn)性，運(yùn)種危險(xiǎn)對 于媽媽和孩子來說都存在。權(quán)威調(diào)查發(fā)現(xiàn)雙胞胎的剖宮產(chǎn)率78.45%，早產(chǎn)占47.07%，合并 癥和并發(fā)癥占39.7%。雙胞胎W及多胞胎的母親更容易在懷孕期間發(fā)生糖尿病、高血壓等 妊娠期綜合征，而且產(chǎn)后出血的概率也要高，同時(shí)也比較容易發(fā)生早產(chǎn)。早產(chǎn)的孩子大都會 發(fā)生先天性肺部疾病，而且運(yùn)種疾病將是終生的。為了保護(hù)母子的安全，=胞胎W上，原則 上需要進(jìn)行減胎術(shù)，但減胎手術(shù)有10%的機(jī)會造成全部胚胎流產(chǎn)。本發(fā)明方法能夠避免同 次植入多個(gè)胚胎產(chǎn)生多胎妊娠的現(xiàn)象，減少了受孕母親的痛苦，保證了抑制胚胎的成活率 和妊娠的成功率。
【附圖說明】
[0049] 圖1為形態(tài)學(xué)分型等級最高的AA級胚胎和等級低劣的CC或CB級胚胎的甲基化水平 圖。AA-I和CB-I的胚胎是來自同一對夫婦，AA-3和CC-6也是來源同一對夫婦。結(jié)果顯示AA的 甲基化水平在0.30±0.02間，而CC或CB的甲基化水平整體上與AA差別非常大。
[0050] 圖2為6例BB或BA級胚胎的甲基化水平圖。兩條虛線代表五個(gè)AA級胚胎甲基化水平 的SD誤差。結(jié)果顯示3例的甲基化水平與AA類似(88-3、88-4、88-5)，3例的甲基化水平與八八 差異非常大(BA-l、BB-2、BB-6)。
[0051] 圖3為基于每個(gè)胚胎CpG甲基化模式進(jìn)行的主成份分析圖（PCA分析KAA級胚胎的 甲基化模式非常相似，而CC或CB的甲基化模式離AA的差別較大，而且各個(gè)胚胎之間的狀態(tài) 也差別較大。
[0052] 圖4為5例AA級別胚胎和7例CB或CC級胚胎中，不同基因組功能元件的平均甲基化 水平。5例AA級胚胎各個(gè)功能元件的甲基化水平類似;而7例CC或CB級胚胎的各個(gè)功能元件 的甲基化水平差異非常大，而且多數(shù)胚胎與AA有較大差別。
[0053] 圖5為不同形態(tài)學(xué)分型胚胎的甲基化重編程的功能分析圖。形態(tài)學(xué)分型等級高的 和等級低的胚胎之間相比，差異甲基化區(qū)域的功能富集分析。啟動子位于DMRs區(qū)域的基因 采用DAVID GO富集分析?；騼?nèi)部DMRs區(qū)域的順式作用元件通過GREAT tools分析。GO分析 P值<0.05的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示發(fā)生錯(cuò)誤甲基化的區(qū)域常常發(fā)生在對細(xì)胞生存非常重 要的基礎(chǔ)代謝基因上、或與發(fā)育尤其是神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因上，說明正常的甲基化圖譜對 胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。
[0054] 圖6為不同的胚胎中IDH2基因附近的增強(qiáng)子呈現(xiàn)不同的甲基化狀態(tài)圖。圖中顯示 等級高和等級低的胚胎的平滑甲基化水平延伸基因區(qū)上下化b的區(qū)域。樣品AA1、AA2、AA3的 增強(qiáng)子周圍甲基化狀態(tài)類似，而樣品CC5和CC6的增強(qiáng)子甲基化狀態(tài)出現(xiàn)問題。黑色的短條 代表CpG位點(diǎn)。
[005引圖7為各種級別胚胎中甲基化水平在0.3±0.02范圍內(nèi)比例，W及不同級別胚胎的 出生率。用C*的出生率代替CC和C*的出生率，因此圖中的C*胚胎的出生率高于CC和C*的合 計(jì)的出生率。此圖說明，甲基化狀態(tài)好的胚胎也傾向于獲得更好的出生率。
[0056]圖8為無創(chuàng)獲取的幾個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化水平類似于全胚胎的甲基化水平圖。 BB-7-TE和CC-8-TE分別是從胚胎BB-7和CC-8中取出的幾個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞。
[0057] 圖9為利用甲基化圖譜的結(jié)果分析染色體拷貝數(shù)。樣品S-25的第五號染色體的一 個(gè)片段多出了一個(gè)拷貝，第9號染色體的一個(gè)片段少了一個(gè)拷貝。說明此胚胎染色體出現(xiàn)異 常，不可W用作胚胎移植。
【具體實(shí)施方式】
[0058] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0059] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0060] 實(shí)施例1人類囊胚中全基因組水平的DNA甲基化不穩(wěn)定的發(fā)現(xiàn)
[0061] 本發(fā)明收集了通過加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)分級的等級最高的AA級和等級低劣 的CC，BC或CB級的囊胚，運(yùn)些囊胚來自合作單位北京大學(xué)第S醫(yī)院和廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第 =醫(yī)院，患者做輔助生殖手術(shù)中，體外會同時(shí)培樣幾個(gè)囊胚，之后選擇形態(tài)最優(yōu)良的進(jìn)行移 植，其余的囊胚經(jīng)患者本人同意，簽訂知情同意書后，捐獻(xiàn)用于該課題科學(xué)研究。對每一個(gè) 囊胚，進(jìn)行單堿基分辨率的全基因組甲基化測序。本發(fā)明的"one-tube"實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0062] 1、樣品準(zhǔn)備
[0063] 滋養(yǎng)層細(xì)胞從胚胎中分離出后，在不超過扣1的胚胎專用培養(yǎng)液或者PBS中保存在 200iU管中，迅速凍存在-80 °C中。
[0064] 2、細(xì)胞裂解
[0065] 表1細(xì)胞裂解緩沖液
[0066]
[0067] 將凍存的樣品取出，室溫融化后，直接離屯、，4°C 3000g離屯、5min。56°C蛋白消化 1.5h，然后75°C蛋白酶滅活30min。
[0068] 3、DNA 打斷
[0069] 加入未甲基化的Lamda DNA，比例為每1000 pg樣品DNA中加入5pg Lamda DNA。用超 純水，將樣品量補(bǔ)平至50]il。打斷條件:S2,50]il，400bp condition。體積濃縮至30]il。
[0070] 4、End-Repai;r 末端補(bǔ)平 [0071 ]準(zhǔn)備反應(yīng)緩沖液如下：
[0072]
[0073] f下一步，或者凍存至-20°C或 更低藍(lán)
[0074]
[0075]
[0076]
[0077] f下一步，或者凍存至-20°C或 更低藍(lán) [007引
[0079]
[0080]
[0081] 充分混合，16°C反應(yīng)過夜（至少化）。接著進(jìn)行下一步，或者凍存至-20°C或更低溫 度。
[0082] 7、使用甲基化建庫試劑盒。
[0083] 按照說明書配制適用于50ul樣品的CT Conversion Reagent。準(zhǔn)備Bisulfite Conversion mixture女曰下：
[0084]
[0085] 充分混合，把每份樣品平均分配到兩個(gè)管子里（7化I每管），啟動如下程序:98°C， 10min;64°C，化；4°C最多放置化。將試劑盒中的柱頭放到收集管上，加入600ul binding buffer, W及0.扣I Carrier RNA。將150山樣品加入上一步binding buffer中。用槍頭輕輕 吹打混勻，合上管蓋放置5min。至少100(K)rpm，離屯、Imin。將收集管中的試劑重新加到柱頭 中，再次離屯、Imin。丟掉離屯、下的試劑。柱頭加入IOOiil Wash Buffer，至少10000巧m，離屯、 Imin。柱頭加入200山 De-sulphonation Buffer，室溫放置 15到20min。至少10000巧m，離屯、 Imin。丟掉離屯、下的試劑。柱頭加入lOOul Wash Buffer，至少1000 Orpm，離屯、Imin。重復(fù)第 27步，丟掉收集管中的試劑，將柱頭放到新的1.5mL離屯、管中。加入1化1超純水，室溫放置 IOmin。至少1000 Orpm，離屯、Imin。重復(fù)第29步。離屯、下的樣品即為Bi Siilf ite處理后的DNA。 接著進(jìn)行下一步，或者凍存至-20°C或更低溫度。
[00化]8、第一輪PCR擴(kuò)增
[0087]使用PCR擴(kuò)增試劑盒。準(zhǔn)備如下擴(kuò)增緩沖液：
[008引
[0089] 按照如下循環(huán)步驟擴(kuò)增：981：453;98°(：153,651：3〇3,721：3〇3，共6個(gè)循環(huán)；721： lmin〇4°C 保持。
[0090] 接著進(jìn)行下一步，或者凍存至-20°C或更低溫度。
[0091] 9、向上一步DNA樣品中加入等體積(SOiil)AMPure XP Beads,充分混勻，離屯、。37°C 靜置lOmin。將管子放在磁架上，靜置5min。使用200ul的75%乙醇洗磁珠，然后吸棄上清。空 氣中驚磁珠2min，使乙醇揮發(fā)。用IOmM Tris-肥1(抑8.5)重懸磁珠，簡單離屯、后，靜 置5min，然后放置在磁力架上靜置5min。收集上清至新的2(K)山離屯、管中，接著進(jìn)行下一步， 或者凍存至-20°C或更低溫度。
[0092] 10、第二輪 PCR 擴(kuò)增
[0093] 使用PCR擴(kuò)增試劑盒。準(zhǔn)備如下擴(kuò)增緩沖液：
[0094]
[0095]
[0096] 按照如下循環(huán)步驟擴(kuò)增:98 °C 45s; 98 °C 15s，65 °C 30s，72 °C 30s，共13-16 個(gè)循環(huán);72 °Clmin;4°C保持。接著進(jìn)行下一步，或者凍存至-20°C或更低溫度。
[0097] 11、膠回收
[009引將DNA樣本跑瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度為2%，電壓控制在90V。按照測序要求，切下 適當(dāng)大小的DNA片段，進(jìn)行膠回收。最后一步DNA洗脫時(shí)，使用無菌超純水，分3次，共洗脫50y Io
[0099] 12、去除接頭
[0100] 向上一步DNA樣品中加入0.8x(4化l)AMPureXPBeads，充分混勻，離屯、。37°C靜置 lOmin。將管子放在磁架上，靜置5min，等待磁珠被吸附。小屯、地吸取上清并丟棄，不要吸掉 磁珠。使用20化1的75 %乙醇洗磁珠，然后吸棄上清?？諝庵畜@磁珠2min，使乙醇揮發(fā)。用 15ul IOmM Tris-HCl(抑8.5)重懸磁珠，簡單離屯、后，靜置5min，然后放置在磁力架上靜置 5min。收集上清至新的1.5mL離屯、管中，凍存至-20°C。此樣品即為待測序的DNA樣本。
[0101] 通過上述步驟獲得了 DNA甲基化文庫，庫檢合格后即可進(jìn)行測序。獲得的囊胚全基 因組甲基化測序數(shù)據(jù)首先通過Bismark比對軟件與人參考序列化gl9)進(jìn)行比對。唯一比對 到人基因組參考序列上的測序片段(read)在去掉PCR重復(fù)片段W及雙端片段重合區(qū)域后， 根據(jù)比對信息，分為Was ton鏈片段和Crick鏈片段。通過Samtoo Is軟件，分別提取來自 Waston鏈片段上的胞喀晚（切tosine)和化ick鏈片段上的腺嚷嶺(Guanline)的甲基化信 息，然后合并兩條鏈上的信息得到每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平。全基因組甲基化水平為各個(gè) CpG位點(diǎn)甲基化水平的平均值。
[0102] 研究發(fā)現(xiàn)被檢測的五個(gè)AA級囊胚的甲基化水平都很接近，而在7個(gè)被檢測的低等 級胚胎中，有6個(gè)胚胎的全基因組甲基化水平嚴(yán)重偏離AA級胚胎的平均值，并且他們之間的 差異也很明顯。和高等級的胚胎相比，運(yùn)些低等級的胚胎有的是過度去甲基化，而另外一些 是去甲基化不夠充分(見圖1)。而6例BB或BA級別的胚胎有3個(gè)甲基化水平與AA類似，是較好 的候選移植胚胎，而有3個(gè)胚胎甲基化水平不是非常適合胚胎的移植(圖2)。
[0103] 進(jìn)一步通過生物信息學(xué)DNA甲基化模式主成分分析(PCA)方法顯示，5個(gè)AA級胚胎 的甲基化模式都很類似，可W聚類在一起，（圖3中圓圈表示），而7個(gè)低等級的胚胎都分散在 圓圈之外，甲基化模式和AA級胚胎的相差較大。
[0104] 不同胚胎相同的功能原件區(qū)甲基化狀態(tài)的比較分析發(fā)現(xiàn)，相同功能區(qū)域，五個(gè)AA 級胚胎的甲基化模式相似，而在低等級的胚胎中，同一功能區(qū)域的甲基化狀態(tài)各不相同（圖 4)?？梢?，人類胚胎早期發(fā)育的過程中會出現(xiàn)全基因組水平的表觀基因組不穩(wěn)定，AA級的胚 胎全基因組甲基化水平非常一致（即相同的基因組區(qū)域，不同的胚胎中呈現(xiàn)相同的高甲基 化或是低甲基化的狀態(tài)），形態(tài)學(xué)分級較低的B*和C*的胚胎全基因組甲基化水平出現(xiàn)了不 同程度的偏差，形態(tài)學(xué)分型等級越低的和AA級相比其甲基化水平差別越大。由于臨床上AA 級胚胎的出生率是最高的，并且甲基化水平也很一致，因此認(rèn)為AA級胚胎的甲基化模式是 最正確的，可W指導(dǎo)早期胚胎的正常發(fā)育。
[0105] 實(shí)施例2不正確的甲基化重編程影響調(diào)節(jié)胚胎早期發(fā)育的信號通路
[0106] 對高級別胚胎和低級別胚胎中甲基化狀態(tài)不同的區(qū)域進(jìn)行基因功能的分析(gene ontology)。
[0107] 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異甲基化區(qū)域(DMR)位于基因啟動子的運(yùn)些基因主要富集在胚 胎發(fā)育相關(guān)的許多通路上，例如細(xì)胞周期，DNA新陳代謝、DNA修飾、染色體定位、RNA編輯、 DNA修復(fù)、細(xì)胞周期等（圖5)。差異甲基化區(qū)域位于基因內(nèi)部的運(yùn)些基因主要富集在特定組 織的發(fā)育，例如神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)元的分化和命運(yùn)決定、脊髓的結(jié)構(gòu)、mRNA的穩(wěn)態(tài)等(圖5)。
[0108] 結(jié)果還顯示，在級別最低的CC級胚胎中增強(qiáng)子區(qū)域的甲基化往往發(fā)生錯(cuò)誤的重編 程。差異甲基化區(qū)域位于增強(qiáng)子的運(yùn)些基因富集在發(fā)育和代謝相關(guān)的通路上。圖6展示的是 IDH2基因的增強(qiáng)子及附近區(qū)域在不同胚胎中的甲基化狀態(tài)，AA級的胚胎該區(qū)域均呈現(xiàn)低甲 基化狀態(tài)，而CC級胚胎則呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)。增強(qiáng)子區(qū)域的高甲基化造成了 IDH2基因表達(dá) 量的大幅降低。
[0109] 實(shí)施例3植入前囊胚的甲基化水平和ART術(shù)后的嬰兒出生率的關(guān)系
[0110] 本實(shí)施例將AA級囊胚的平均甲基化水平0.3 ± 0.02作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，即臨床植入前 囊胚無創(chuàng)檢測的定量標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在形態(tài)學(xué)檢測的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步精確的篩查正常 發(fā)育囊胚的全新的臨床指標(biāo)。
[0111] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證該指標(biāo)精確性，本發(fā)明又收集了 6個(gè)B*級的囊胚（圖2)，結(jié)果顯示 B*級樣品中有3個(gè)樣品的甲基化水平明顯偏離AA級囊胚的平均甲基化水平0.3運(yùn)一標(biāo)準(zhǔn)。在 圖1中顯示5例AA級樣品中也有1個(gè)樣品偏離標(biāo)準(zhǔn)，而檢測的7個(gè)C*級胚胎，其中有6例均偏離 標(biāo)準(zhǔn)，則各級囊胚甲基化水平符合標(biāo)準(zhǔn)的比例分別為AA級約80%，B*級約50%，C*級約14% (圖7)。圖7的結(jié)果顯示，各級囊胚中甲基化水平符合標(biāo)準(zhǔn)的樣品比例和該級臨床上嬰兒的 出生率呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。
[0112] 本實(shí)施例結(jié)果說明基因組DNA甲基化譜在胚胎發(fā)育的過程中起著至關(guān)重要的作 用，甲基化水平符合或接近標(biāo)準(zhǔn)的囊胚是胚胎移植的最理想選擇。
[0113] 實(shí)施例4植入前表觀基因組檢查可W通過顯微操作技術(shù)從囊胚中分離幾個(gè)滋養(yǎng)層 細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)
[0114] 在臨床中，植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)技術(shù)已經(jīng)擁有了20多年的應(yīng)用歷史，采用活組 織檢測的方法從囊胚中剝離幾個(gè)細(xì)胞，用于基因突變和染色體異常等疾病的診斷。本實(shí)施 例從各測試囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)中分離出幾個(gè)細(xì)胞，用實(shí)施例1中述及的"One Tube"極 少量細(xì)胞全基因組甲基化文庫的構(gòu)建方法，分別構(gòu)建不同囊胚的TE甲基化文庫，同時(shí)將不 同囊胚的剩余細(xì)胞做平行的甲基化文庫。之后用Hiseq測序平臺進(jìn)行檢測，圖8中顯示TE來 源的少量細(xì)胞甲基化水平類似于該囊胚的整體甲基化水平，但可代表整個(gè)囊胚的甲基化 譜。因此，可W用運(yùn)種無創(chuàng)的活組織檢測方法來篩選植入前胚胎甲基化譜更加優(yōu)良的囊胚。
[0115] 實(shí)施例5胚胎染色體不等倍性的檢測
[0116] 目前被廣泛使用PGD/PGS是對胚胎的DNA序列和染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，判斷胚胎是 否存在染色體異常。而本發(fā)明的DNA甲基化全基因測序結(jié)果也可W對染色體倍數(shù)進(jìn)行判斷， 染色體異常算法基于對染色體片段的測序深度進(jìn)行檢測。比對之后的囊胚全基因組甲基化 序數(shù)據(jù)，剔除GC含量W及比對偏好性等因素之后，W-兆堿基（IMb)為單位計(jì)算測序深 度。然后通過隱馬爾科夫鏈模型(MM)根據(jù)測序深度相似性對染色體進(jìn)行分割。測序深度出 現(xiàn)極高或極低的區(qū)域表明此區(qū)段存在染色體加倍或缺失。表2結(jié)果顯示在36例胚胎中有17 個(gè)胚胎有染色體異常，不適合胚胎的移植。W樣品S-25為例，其第五號染色體的一個(gè)片段多 出了一個(gè)拷貝，第9號染色體的一個(gè)片段少了一個(gè)拷貝（圖9)。
[0117] 因此本發(fā)明PEGE方法既完成了已有PGS方法檢測染色體是否存在不等倍性的問 題，同時(shí)又篩選了胚胎發(fā)育表觀狀態(tài)更好的胚胎，因此本方法明顯的好于已有的PGS方法。 因此本PEGE方法將來應(yīng)用于臨床有望成為植入前胚胎最常規(guī)、最基礎(chǔ)、最精確的篩選的手 段。使用本發(fā)明PEGE方法可W同時(shí)檢測染色體的異常問題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17例胚胎的染色體存 在倍數(shù)的異常，運(yùn)些胚胎完全不能用于胚胎的移植。
[0118] 表2本發(fā)明方法對17例胚胎的染色體倍數(shù)檢測情況 rnii<5i

[0120]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的無創(chuàng)檢測方法，其特征在于，對待檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞基因 組進(jìn)行甲基化檢測，以加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平為標(biāo) 準(zhǔn)，甲基化水平接近或等于該標(biāo)準(zhǔn)的，則待檢囊胚發(fā)育優(yōu)良，所述加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng) 評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎是指2. 如權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)檢測方法，其特征在于，還包括以加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng) 評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化模式為標(biāo)準(zhǔn)。3. 如權(quán)利要求1-2任一所述的無創(chuàng)檢測方法，其特征在于，還包括根據(jù)甲基化測序結(jié) 果，判斷囊胚各個(gè)染色體倍數(shù)是否正常，若為標(biāo)準(zhǔn)二倍體則待測囊胚染色體正常。4. 權(quán)利要求1-3任一所述的無創(chuàng)檢測方法在提高妊娠率中的應(yīng)用。5. -種提高試管嬰兒出生率的方法，其特征在于，篩選滋養(yǎng)層細(xì)胞甲基化水平接近或 等于加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平值和/或甲基化模式的 囊胚進(jìn)行移植，所述加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎是指AA、AB、BA、BBS 囊胚。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括根據(jù)滋養(yǎng)層細(xì)胞的甲基化測序結(jié)果， 篩選所有染色體數(shù)目均為標(biāo)準(zhǔn)二倍體的囊胚進(jìn)行移植。7. -種篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚的試劑盒，其特征在于，其為囊胚甲基化測序的試劑盒，以加 德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平為標(biāo)準(zhǔn)，甲基化水平接近或等 于該標(biāo)準(zhǔn)的，則待檢囊胚發(fā)育優(yōu)良，所述加德納形態(tài)囊胚分級系統(tǒng)評判出的形態(tài)優(yōu)良胚胎 是指8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其為囊胚甲基化測序的試劑盒，當(dāng)待測囊 胚的甲基化測序結(jié)果顯示所有染色體均為標(biāo)準(zhǔn)二倍體時(shí)，待測囊胚為發(fā)育優(yōu)良囊胚。9. 如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其檢測對象為囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞。10. 加德納形態(tài)囊胚分級中的形態(tài)優(yōu)良胚胎的甲基化水平值在制備篩選優(yōu)良發(fā)育囊胚 的試劑盒中的應(yīng)用，所述加德納形態(tài)囊胚分級中的形態(tài)優(yōu)良胚胎是指
【文檔編號】C12Q1/68GK105861658SQ201610225668
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】劉江, 喬杰, 李國強(qiáng), 于洋, 范勇, 李從儒
【申請人】中國科學(xué)院北京基因組研究所, 北京大學(xué)第三醫(yī)院, 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院