精氨酸脫亞氨酶4的新型抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了1種精氨酸脫亞氨酶4(PAD4)的新型抑制劑，該化合物與PAD4之間的解離常數(shù)KD值為112μM。
【專利說明】
精氨酸脫亞氨酶4的新型抑制劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于藥物化合物領(lǐng)域，更具體地，涉及精氨酸脫亞氨酶4 (PAD4)的抑制劑及 其結(jié)合PAD4的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種嚴(yán)重的威脅人類健康的慢性 自身免疫性疾病。目前治療RA的方法是緩解癥狀，如抗炎、消腫和止痛等。非甾體抗炎藥 (NSAIDs)作為一線抗RA藥，減少組織疼痛和炎癥，包括阿司匹林、塞來昔布、美洛昔康和可 的松(糖皮質(zhì)激素)等。NSAIDs藥物能減輕臨床癥狀但不能根治炎癥，無法阻止關(guān)節(jié)破壞、組 織損傷等，需要與其他抗風(fēng)濕藥物聯(lián)合使用才能有效控制病情。改善病情抗風(fēng)濕藥 (DMARDs)作為二線抗RA藥，用于緩解或阻止RA軟骨和關(guān)節(jié)的損傷，包括甲氨蝶呤、羥化氯喹 等。DMARDs類藥物通常起效慢，影響RA患者的自身機(jī)體免疫過程。目前的治療藥物對RA的免 疫病理機(jī)制無決定性影響，不能從根本上治療治療RA，因此發(fā)展針對RA發(fā)病機(jī)理的藥物是 必要的。
[0003] 近年來發(fā)現(xiàn)，PAD4是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新靶點(diǎn)。PAD4是將蛋白質(zhì)多肽鏈中的 精氨酸催化成瓜氨酸的修飾酶之一。研究表明（Zhang Y. 2013)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi) PAD4蛋白顯著表達(dá)，使RA患者體內(nèi)多種蛋白發(fā)生瓜氨酸化，例如滑膜中纖維蛋白和抗凝血 酶的瓜氨酸化。進(jìn)而形成瓜氨酸化蛋白/多肽抗原表位(citrullinated protein/peptide antigen，CPA)，刺激RA患者自我免疫形成抗瓜氨酸化蛋白抗體。抗瓜氨酸化蛋白抗體視多 種蛋白和多肽為目標(biāo)，在自身免疫性關(guān)節(jié)炎中有致病作用。PAD4是鈣離子依賴性酶，含有5 個(gè)Ca 2+結(jié)合位點(diǎn)，由663個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為TAkDajADA具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，N-結(jié)構(gòu)域 和C-結(jié)構(gòu)域。PAD4的催化活性位點(diǎn)位于C-結(jié)構(gòu)域，包含四個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基Asp350、 His471、Asp473和Cys645。研究表明（Arita K.，2004)Ca2+的結(jié)合引起PAD4構(gòu)象的改變，從而 形成活性位點(diǎn)裂隙，該裂隙可容納組蛋白N-末端肽和2個(gè)Ca 2+結(jié)合位點(diǎn)。PAD4可催化單甲基 精氨酸殘基和肽?；彼崦搧啺鞭D(zhuǎn)化為瓜氨酸，不能轉(zhuǎn)化二甲基精氨酸。
[0004] 目前靶向PAD4抑制劑開發(fā)均是針對活性催化位點(diǎn)，分為不可逆類抑制劑和可逆類 抑制劑。不可逆類抑制劑主要是鹵脒類，包括氟脒(F-amidine)和鹵脒(Cl-amidine)，IC5〇為 1.9~22yM。而氫脒類抑制劑是PAD4的可逆性抑制劑，說明PAD4活性位點(diǎn)需要吸電子離去基 團(tuán)（鹵素）與硫醇反應(yīng)，從而增加脒基碳原子的親電性?，F(xiàn)有的可逆性抑制劑(紫杉醇、鏈霉 素、米諾環(huán)素等），除GSK199和GSK484以外（IC 5q為200nM和50nM) (Lewis，H.D?，2015)，抑制活 性均較弱，IC5〇值在毫摩爾級別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供化合物NSC299189以及結(jié)合PAD4蛋白的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了 一種結(jié)構(gòu)式如下的化合物：
[0008]上述化合物是萘醌類化合物，并且含有一個(gè)2-[2-(2-羥基乙氨基）乙氨基]取代 基。
[0009 ]本發(fā)明提供了上述化合物與PAD4結(jié)合的用途。
[0010] 上述化合物的羥基與PAD4的活性口袋內(nèi)Asp473和His471殘基形成兩個(gè)氫鍵。上述 化合物的氨基與PAD4活性口袋內(nèi)Asp350形成氫鍵。上述化合物的萘醌基團(tuán)伸向溶劑化區(qū) 域，與PAD4活性口袋內(nèi)Arg374和Arg345殘基形成兩個(gè)氫鍵。
[0011]實(shí)驗(yàn)表明，以上化合物可與PAD4蛋白結(jié)合，解離常數(shù)為KD = 218yM，可以用于發(fā)展 抗RA的抑制劑。
【附圖說明】
[0012] 附圖是NSC299189的結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不意于限制本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0014] NSC299189化合物（2-[2-(2_羥基乙氨基）乙氨基]萘醌）（2-[2-(2_ hydroxyethylamino)ethylamino]naphthalene_l，4_dione)來自于NCI數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明通過 基于氟脒和PAD4反應(yīng)的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬、藥效團(tuán)模型、分子對接和體外化 合物篩選，發(fā)現(xiàn)了新結(jié)構(gòu)類型的PAD4蛋白抑制劑NSC29918LNSC299189化合物的結(jié)構(gòu)如下 所示：
[0016] NSC299189 的分子式：C14H16N2O3。
[0017] NSC299189 的分子量：260。
[0018] NSC299189是萘醌類化合物，并且含有一個(gè)2-[2-(2_羥基乙氨基）乙氨基]取代基。
[0019] NSC299189化合物通過與PAD4活性位點(diǎn)結(jié)合從而阻止其發(fā)揮轉(zhuǎn)化精氨酸為瓜氨酸 的活性。
[0020] NSC299189化合物與PAD4的解離常數(shù)KD=112yM，有進(jìn)一步優(yōu)化成抗RA候選藥物的 潛力。
[0021] NSC299189結(jié)合PAD4蛋白的能力是通過自身的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的。NSC299189結(jié) 構(gòu)中的羥基與PAD4的活性口袋內(nèi)Asp473和His471殘基形成兩個(gè)氫鍵。氨基與PAD4活性口袋 內(nèi)Asp350形成氫鍵。并且該化合物的萘醌基團(tuán)伸向溶劑化區(qū)域，與PAD4活性口袋內(nèi)Arg374 和Arg345殘基形成兩個(gè)氫鍵。從而加強(qiáng)了化合物NSC299189與PAD4蛋白的親和力。
[0022]在抗PAD4蛋白生物活性評估中，由于我們沒有直接的PAD4活性檢測方法，所以我 們運(yùn)用了表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR)技術(shù)，檢測了化合物和PAD4 蛋白間的結(jié)合活性。
[0023] 1.試驗(yàn)材料
[0024] Biacore T200光學(xué)生物傳感器（Biacore Life Sciences，GE Healthcare)CM5生 物傳感芯片
[0025] 10mM醋酸鈉 (pH 5.0)
[0026] 緩沖液：50mm HEPES，pH 8.0,300mM NaCl，2mM DTT，20mM CaC12,和5%DMS0。
[0027] 2.試驗(yàn)方法
[0028] 2.1藥物配制
[0029] 藥物:---(DMS0 儲(chǔ)存液，10mM)
[0030] 含有5%DMS0的HEPES緩沖液做2倍濃度梯度稀釋。試驗(yàn)藥物終濃度為500yM，250y M，62 ? 5yM，31 ? 25虛，15 ? 63虛，7 ? 8lyM。體系中DMS0終濃度為5 %。
[0031] 2.2試驗(yàn)程序
[0032] 2.2.1用10mM的醋酸鈉(pH 5.0)將PAD4蛋白稀釋成濃度為50μg/ml，采用氨基偶聯(lián) 方式將稀釋后的PAD4固定到CM5生物傳感芯片上。
[0033] 2.2.2每個(gè)濃度(7.81~500yM)的化合物以30yL/min的恒定流速，注射到PAD4蛋白 表面，注射時(shí)間為60s。
[0034] 2.2.3緩沖液（50111111冊？￡5印11 8.0,300111]\1他(：1，2111]\101'1'，20111]\1〇&(：12，和5% DMS0)持續(xù)沖洗芯片表面300s，解離化合物。
[0035] 2.2.4選取31.25yM濃度做重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0036] 2.2.5收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用Biacore T200評估軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算得出化合物 和PAD4的解離常數(shù)Kd值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種結(jié)構(gòu)式如下的化合物：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是萘醌類化合物，并且含有 一個(gè)2-[2-(2_羥基乙氨基）乙氨基]取代基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物的結(jié)合PAD4蛋白的用途。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述化合物的羥基與PAD4的活性口袋內(nèi) Asp473和His471殘基形成兩個(gè)氫鍵。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述化合物的氨基與PAD4活性口袋內(nèi) Asp350形成氫鍵。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述化合物的萘醌基團(tuán)伸向溶劑化區(qū)域， 與PAD4活性口袋內(nèi)Arg374和Arg345殘基形成兩個(gè)氫鍵。
【文檔編號(hào)】C07C225/28GK105820058SQ201610116096
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月1日
【發(fā)明人】林建平, 李冬梅, 魏宇
【申請人】南開大學(xué)