一種水線草中耳草酮a的提取分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水線草中耳草酮A的提取分離 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命的的重大疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，惡性腫瘤已成為城鄉(xiāng)居民的首 要死因，而且呈現(xiàn)年輕化合逐年上升趨勢(shì)，全國(guó)癌癥的平均5年存活率僅為25 %左右，可見(jiàn) 腫瘤的預(yù)防和治療十分迫切。藥物治療是腫瘤的主要治療手段，雖然目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)十 種抗腫瘤藥物，有效延長(zhǎng)了患者生命或者提高了患者生存質(zhì)量，但是腫瘤的藥物研究還是 面臨著巨大挑戰(zhàn)，抗癌藥物多有細(xì)胞毒藥物，副作用多；而中藥有幾千年的人體毒性實(shí)驗(yàn)的 基礎(chǔ)，從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的抗腫瘤活性化合物一直是研究熱點(diǎn)。
[0003] 水線草，又名傘房花耳草，為茜草科一年生草本植物，耳草屬植物水線草Hedyotis corymbosa(L.)的干燥全草?？唷⒑?，入肺、大腸二經(jīng);具有清熱解毒之功效，常用于燙傷，與 常山、馬鞭草混合煎服能治瘧疾。目前臨床上，水線草的主要用途是與白花蛇舌草混用治療 癌癥(南京新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典.上海.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977: 535 .)，但其抗腫瘤物 質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。
[0004] 水線草中主要含的化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜及其苷類和三萜酸類。耳草酮A、雞屎藤苷 甲酯(雞矢藤苷甲酯)都為環(huán)烯醚萜類，從水線草中分離得到，且都不存在于白花蛇舌草中。 2007年，研究者首次從水線草分離得到耳草酮A，現(xiàn)代研究從水線草中分離的耳草酮對(duì)P-多 蛋白糖介導(dǎo)的多向性抗藥的人體肝細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)耳草酮能夠明顯地選擇性地抑制R-HepG2和HepG2增殖，而且對(duì)正常的人體肝細(xì)胞WRL-68沒(méi)有影響，表明耳草酮A有很好的抗腫 瘤活性(Grace Gar-Lee Yue,Julia Kin-Ming Lee,Ling Cheng,Ben Chung-Lap Chan,Lei Jiang,Kwok-Pui Fung,Ping-Chung Leung and Clara Bik-San Lau.(2012).Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human hepatoma cells by hedyotiscone A,a compound isolated from Hedyotis corymbosa.Xenobiotica,42(6): 562-570. )〇
[0005] 目前尚未檢索到水線草中耳草酮A提取分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種水線草中耳草酮A的提取分離方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] -種水線草中耳草酮A的提取分離方法，包括以下步驟：
[0009] 1)將水線草用醇溶劑進(jìn)行提取，得到水線草醇提物；
[0010] 2)將所得水線草醇提物分別用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯反復(fù)多次萃取;取乙酸乙 酯萃取部位，濃縮得精提浸膏；
[0011] 3)將所述精提浸膏用甲醇超聲溶解，過(guò)濾，濾液硅膠拌樣后經(jīng)正相硅膠柱層析，用 洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液;所述洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯洗脫劑，和二氯甲烷-石 油醚洗脫劑；
[0012] 4)將步驟3)所得洗脫液采用柱層析分離法或制備液相分離法或刮板法進(jìn)一步純 化，制得耳草酮A;
[0013] 所述柱層析分離法包括將步驟3)所得洗脫液采用葡聚糖凝膠柱層析，以甲醇作為 洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，制得耳草酮A;
[0014] 或者所述柱層析分離法包括將步驟3)所得洗脫液經(jīng)0DS反相柱層析，以甲醇作為 洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，制得耳草酮A;
[0015] 所述制備液相分離法包括將步驟3)所得洗脫液進(jìn)制備液相，以甲醇水為流動(dòng)相進(jìn) 行洗脫，收集洗脫液，制得耳草酮A;所述制備液相采用LC-3000高效液相Thermo C18(250 X 21.2mm)制備柱；
[0016] 所述刮板法包括將步驟3)所得洗脫液通過(guò)薄層硅膠板分離，制得耳草酮A
[0017] 上述水線草中耳草酮A的提取分離方法，其中：
[0018] 步驟1)中優(yōu)選先將水線草粉碎再進(jìn)行提取，優(yōu)選為60-80目；所述提取溫度優(yōu)選為 60-80°C;所述醇溶劑為乙醇或甲醇溶劑，優(yōu)選為甲醇溶劑;所述醇溶劑的濃度為50%_70% (質(zhì)量濃度），優(yōu)選70 % (質(zhì)量濃度）；更優(yōu)選為70 %的甲醇（質(zhì)量濃度）；所述提取方法為回流 提取、超聲提取、浸漬提取等方法中的一種或幾種;優(yōu)選為回流提取;所述醇溶劑的用量為 水仙草重量的5-15倍，優(yōu)選為10倍。
[0019] 為盡量將水仙草中雞矢藤甲酯提取出來(lái)，步驟1)優(yōu)選包括將水線草粉碎至60-80 目，加入5-15倍重量的70 %甲醇（質(zhì)量濃度），攪勻，先超聲提取0.5-lh，然后回流提取l-3h， 提取溫度為60_8(TC ;過(guò)濾;濾渣按上述方法再次進(jìn)行超聲提取、回流提取;共提取三次，合 并濾液，減壓濃縮得到水線草醇提物(即粗提浸膏）。
[0020] 步驟2)所述石油醚萃取優(yōu)選為將步驟1)所得水線草醇提物用石油醚萃取3-5次， 所述水線草醇提物與石油醚的用量(重量)比例為1-3:4-6;萃取后保留水部位。
[0021] 步驟2)所述正丁醇萃取優(yōu)選為將所述水部位部位用正丁醇萃取3-5次，所述水部 位與正丁醇的用量(重量)比例為1-3:4-6;萃取后保留正丁醇萃取部位。
[0022]步驟2)所述乙酸乙酯萃取優(yōu)選為將所述正丁醇萃取部位用乙酸乙酯萃取3-5次， 所述正丁醇萃取部位與乙酸乙酯的用量(重量)比例為1-3:4-6;萃取后保留乙酸乙酯部位。 [0023]最后取乙酸乙酯萃取部位，濃縮(例如減壓濃縮)得精提浸膏。
[0024]按上述方法萃取處理后，最大限度地去除了所述水線草醇提物中雜質(zhì)。
[0025]步驟3)優(yōu)選將所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超聲溶解，再進(jìn)行過(guò)濾。
[0026]步驟3)所述梯度洗脫包括以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，分別以石油醚-乙酸乙酯 (體積比）為7:1，5:1，2:1進(jìn)行第一次梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯為5:1的洗脫液;再以 石油醚-二氯甲烷為洗脫劑，分別以石油醚-二氯甲烷(體積比）為2:1，1:1，1:2進(jìn)行第二次 梯度洗脫，收集石油醚-二氯甲烷1:1的洗脫液。
[0027]本發(fā)明所述第二次梯度洗脫是指收集第一次洗脫液，硅膠拌樣經(jīng)正相硅膠柱層 析，進(jìn)行第二次洗脫。
[0028]步驟3)優(yōu)選采用100-200目的正相硅膠柱層析。
[0029]本發(fā)明所述0DS反相柱是指十八烷基硅烷填料反相柱。
[0030] 步驟4)所述制備液相分離法為先將步驟3)所得洗脫液經(jīng)0.22M1微孔濾膜過(guò)濾，再 取濾液進(jìn)制備液相。所述洗脫劑為65%甲醇水。所述制備液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250X21.2mm)制備柱。
[0031] 具體地，步驟4)所述制備液相分離法包括將步驟3)所得洗脫液經(jīng)0.22wii微孔濾膜 過(guò)濾，取濾液進(jìn)制備液相，以65 %甲醇水為洗脫劑等度洗脫，收集洗脫液，制得耳草酮A;所 述制備液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250 X 21.2mm)制備柱柱。
[0032] 具體地，所述刮板法包括將步驟3)第二次梯度洗脫所得石油醚-二氯甲烷為1:1的 洗脫液濃縮，通過(guò)在薄層硅膠板上點(diǎn)樣，進(jìn)行洗脫定量，以正己烷：乙酸乙酯= 2:1為展開(kāi)劑 展開(kāi)，置紫外光燈(365nm)下檢視定位后，將在硬板薄層板上樣品區(qū)帶的吸附劑定量刮下， 用溶劑進(jìn)行洗脫、定量，得到化合物耳草酮。
[0033] 較佳地，本發(fā)