一種菌渣培養(yǎng)促中國被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種菌渣培養(yǎng)促中國被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法。
技術(shù)背景
[0002]冬蟲夏草是冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上長出的子座(子實體)及幼蟲蟲體的復合體，屬于可食用的真菌，是我國一種傳統(tǒng)的名貴滋補中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。
[0003]野生的冬蟲夏草僅生長在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年來過度采挖，使得蟲草資源已經(jīng)瀕臨滅絕。而另一方面隨著人們生活水平的提高，對冬蟲夏草的需求卻越來越高，冬蟲夏草人工培育成為解決這一問題的有效途徑之一。因此，我國科研人員一直在進行利用冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲人工培植冬蟲夏草來替代野生冬蟲夏草的產(chǎn)業(yè)化研究。冬蟲夏草要完成產(chǎn)業(yè)化，首先必須找到它正確的菌種，然后利用冬蟲夏草菌來侵染蝙蝠蛾幼蟲，進而培植出冬蟲夏草。經(jīng)過多年的研究，冬蟲夏草菌被鑒定為中國被毛孢，又稱為蝙蝠蛾被毛孢。
[0004]人工培植冬蟲夏草主要是采用中國被毛孢的菌絲體來侵染蝙蝠蛾幼蟲，但是這種常規(guī)侵染方法的侵染率不高，使得培植冬蟲夏草的成功率受到影響，阻礙了冬蟲夏草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。隨著對人工培植冬蟲夏草技術(shù)領(lǐng)域的不斷探索，有研究表明采用中國被毛孢的分生孢子來侵染蝙蝠蛾幼蟲能夠明顯提高侵染率。因此，人工制備中國被毛孢菌分生孢子的過程就成為影響人工培植冬蟲夏草成功率的重要環(huán)節(jié)。
[0005]目前，有關(guān)中國被毛孢產(chǎn)生分生孢子的報道較少，且分生孢子的數(shù)量不高。如文獻“不同因子對冬蟲夏草真菌產(chǎn)生分生孢子的研究”(李玉玲，《食用菌》2002年第5期)，其論述了中國被毛孢在不同培養(yǎng)基、不同光照以及不同溫度下產(chǎn)生分生孢子的研究;又如文獻“不同微量元素和生長因子對冬蟲夏草分生孢子產(chǎn)量的影響”(李玲玲，羅合春，胡敏，《重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學院學報》2014年第2期)，其通過在基礎培養(yǎng)及配方中添加微量元素和氨基酸生長因子，研究了不同微量元素和生長因子對中國被毛孢孢子產(chǎn)量的影響，但是利用上述文獻中的方法所得到的分生孢子數(shù)量不高于15數(shù)量級。因此，如何通過培養(yǎng)獲得大量分生孢子，已逐漸成為人工培植冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過程中的瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種菌渣培養(yǎng)促中國被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，在分生孢子誘導階段選用一定種類的光源進行光周期刺激培養(yǎng)，該方法獲得分生孢子的周期短且產(chǎn)量高。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種菌渣培養(yǎng)促中國被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，包括以下制備步驟:
[0008](I)菌種選擇:收集冬蟲夏草子囊孢子，挑取單子囊孢子進行培養(yǎng)，得到中國被毛孢單子囊孢子菌落；
[0009](2)菌渣獲得:在菌落中挑取3-5塊菌塊接種于培養(yǎng)基中，將菌塊打碎，于恒溫搖床中培養(yǎng)10天，記為一級搖瓶;將一級搖瓶進行擴培，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，記為二級搖瓶;將二級搖瓶進行擴培，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，記為三級搖瓶;將獲得的三級搖瓶進行菌液分離，獲得的菌絲體即為菌渣；
[0010](3)菌渣生長:將菌渣分裝于無菌廣口瓶中，底部墊上吸水棉，封好瓶蓋，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長；
[0011 ] (4)分生孢子誘導:待菌渣表面布滿氣生菌絲后，在一定溫濕度下光周期刺激培養(yǎng)進行分生孢子誘導，誘導一定時間后得到大量散落的分生孢子；
[0012]所述光周期刺激培養(yǎng)為光照培養(yǎng)12小時，黑暗培養(yǎng)12小時;其中，光照的光源選自藍光、紅光、或藍光與紅光的組合。
[0013]分生孢子是微生物對于特定條件下的一種應急反應，可以理解為不利環(huán)境下，微生物為了不使自身的種屬被滅絕而產(chǎn)生的一種更為穩(wěn)定、耐受性更強的無性繁殖體，因此特定的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件相互協(xié)調(diào)才能制備得到大量的分生孢子。申請人在對中國被毛孢生長發(fā)育特點深入研究的基礎上，經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動，提供了一種菌渣培養(yǎng)促中國被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，本發(fā)明所述方法分為菌種選擇、菌渣獲得、菌渣生長和分生孢子誘導四個階段。
[0014]本發(fā)明中選用冬蟲夏草單子囊孢子作為菌種，相對于其他組織分離的菌種具有穩(wěn)定性好、活力強、特別是發(fā)酵出來的菌絲體量多的優(yōu)點，通過對菌絲多級擴培，能夠極大的提高分生孢子的數(shù)量。
[0015]本發(fā)明中所述菌渣獲得階段，在一些實施方式中，所述搖瓶培養(yǎng)基的配方，由以下質(zhì)量百分比的組分組成:蠶蛹粉0.5%，蛋白胨0.5-1.5%，酵母粉1-2%;葡萄糖2-4%，無水硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鋅0.0013%，天門冬氨酸0.1%，維生素C0.1%，純牛奶8%。
[0016]本發(fā)明中所述菌渣獲得階段，在一些實施方式中，菌塊打碎后在搖床中的培養(yǎng)條件為:在120rpm下，20 °C恒溫培養(yǎng)。
[0017]本發(fā)明中所述菌渣生長階段的溫度控制在15_20°C;在一些實施方式中，所述菌渣生長階段的溫度為15°C ;在另一些實施方式中，所述菌渣生長階段的溫度為18°C ;在又一些實施方式中，所述菌渣生長階段的溫度為20°C。同時，所述菌渣生長階段的濕度控制在60-80%，所述菌渣的生長時間控制在15-25天，優(yōu)選為20天。
[0018]在所述分生孢子誘導階段，申請人重點對溫度和光源的選擇進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，低溫有助于刺激分生孢子的產(chǎn)生，優(yōu)選地，誘導分生孢子的溫度控制在5-10°C;在一些實施方式中，所述誘導分生孢子的溫度為5°C ;在另一些實施方式中，所述誘導分生孢子的溫度為8°C;在又一些實施方式中，所述誘導分生孢子的溫度為10°C。同時，所述誘導分生孢子的濕度控制在70-90%。進行光照周期刺激培養(yǎng)時，光源種類的選擇對分生孢子的誘導時間有重要影響。相同培養(yǎng)條件下，選擇一定的光源，調(diào)整誘導時間，可獲得最大數(shù)量的分生孢子。在一些實施方式中，所述光源為藍光，誘導時間為20天;在另一些實施方式中，所述光源為紅光，誘導時間為20天;在又一些實施方式中，所述光源為藍光與紅光的組合，誘導時間為15天;在又一些實施方式中，所述光源為藍光與紅光的組合，誘導時間為10天。
[0019]除非明確說明，否則，本發(fā)明引用的所有范圍包括端值，例如，“溫度為15-20°C”，表示溫度范圍為15°C <T<20°C。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在于:
[0021](I)本發(fā)明中選用從新鮮冬蟲夏草中分離的單子囊孢子作為菌種，相對于其他組織分離的菌種具有穩(wěn)定性好、活力強、特別是發(fā)酵出來的菌絲體量多的優(yōu)點，通過對菌絲多級擴培，能夠極大的提高分生孢子的數(shù)量。
[0022](2)通過對光源進行選擇，可以在提高分生孢子數(shù)量的基礎上，縮短分生孢子的誘導時間，使中國被毛孢產(chǎn)分生孢子的周期更短。
[0023](3)本發(fā)明提供的菌渣培養(yǎng)促中國被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法，周期短，產(chǎn)量高，對人工培植冬蟲夏草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明中菌渣生長階段布滿氣生菌絲的圖片。
[0025]圖2為實施例3制備的大量中國被毛孢腎形分生孢子的鏡檢圖。
【具體實施方式】
[0026]以下所述的是本發(fā)明的【具體實施方式】，本發(fā)明所保護的不限于以下【具體實施方式】。應當指出，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說在此發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的基礎上，做出的若干變形和改進，都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例中所用的原料如無特殊說明，均可以通過商業(yè)途徑獲得。
[0027]實施例1
[0028]培養(yǎng)基配方(質(zhì)量百分比):蠶蛹粉0.5%，蛋白胨1%，酵母粉2%，葡萄糖2%，無水硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鋅0.0013%，天門冬氨酸0.1%，維生素C0.1%，純牛奶8%。
[0029]收集野生新鮮冬蟲夏草子囊孢子，通過體視鏡挑取單子囊孢子進行培養(yǎng)，經(jīng)過純化培養(yǎng)之后獲得中國被毛孢單子囊孢子菌落試管斜面;選取長勢良好的中國被毛孢單子囊孢子菌落試管斜面，并挑取數(shù)塊0.5cm2左右大小的菌塊接種于能獲得大量菌絲體的培養(yǎng)基中，用無菌勾楽器將菌塊均勾打碎，于120rpm，20°C恒溫搖床中培養(yǎng)10天，記為一級搖瓶，將一級搖瓶進行擴培，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，記為二級搖瓶，以此類推，將獲得的三級搖瓶在潔凈區(qū)進行菌液分離，獲得的菌絲體即為菌渣;將菌渣分裝于500ml無菌廣口瓶中，底部墊上吸水棉，裝量約為廣口瓶體積的二分之一，用紗布以及封口膜封好瓶蓋，放置于溫度為15°C、濕度為60%的培養(yǎng)箱中生長;25天后，菌渣表面完全生長透徹，布滿氣生菌絲，再在溫度為8°C、濕度為80%的條件下，紅光培養(yǎng)12小時，黑暗培養(yǎng)12小時，誘導分生孢子，誘導20天后即可得到大量散落的中國被毛孢腎形分生孢子。
[0030]經(jīng)無菌水沖洗培養(yǎng)基斜面得到懸浮液，用細胞計數(shù)法對懸浮液進行統(tǒng)計和鏡檢，鏡檢可明顯看到大量散落的中國被毛孢菌種腎形分生孢子，統(tǒng)計結(jié)果中分生孢子總數(shù)為111數(shù)量級。
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