一個用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明所屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 2, 5-二酮哌嗪類化合物（DKP)，又稱環(huán)二肽。該類化合物是由兩個氨基酸通過肽 鍵縮合環(huán)合而形成的，是自然界中存在最小的環(huán)肽類化合物，并且廣泛存在于自然界，在 人、脊椎動物、無脊椎動物、細(xì)菌和真菌中均有發(fā)現(xiàn)。2, 5-二酮哌嗪類化合物擁有兩個氫鍵 給體和兩個氫鍵受體，因為氫鍵是受體與藥物相互作用的主要方式之一，因而DKP的六元 環(huán)在藥物化學(xué)中是一個重要的藥效團(tuán)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的許多有活性的天然產(chǎn)物中含有DKP的六 元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有多種生物活性如廣譜抗菌活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)免疫能力（劉友濤.幾種 2, 5-二酮哌嗪類化合物的合成及其生物活性研究.2011)。本發(fā)明的發(fā)明人以亮氨酸與酪 氨酸為原料合成的環(huán)酪-亮二肽不僅具有廣譜的抗菌活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)免疫功能，還 發(fā)現(xiàn)了創(chuàng)面修復(fù)的功能。
[0003] 創(chuàng)面是正常皮膚組織在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫 以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚組織完整性的 破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚組織的正常功能受損。常見的創(chuàng)面有燒燙傷、 潰瘍、擦傷等。大范圍、深度的創(chuàng)面為外界的致病菌提供了一個類似營養(yǎng)基的場所，這也是 創(chuàng)面容易感染的原因。而環(huán)二肽是由兩個氨基酸殘基通過肽鍵連接形成的肽在經(jīng)過縮合成 環(huán)狀的最小的環(huán)肽，在體內(nèi)可被二肽酶水解而成兩個游離氨基酸。在體內(nèi)腸粘膜細(xì)胞上存 在著吸收二肽的耗能主動運(yùn)轉(zhuǎn)體系，因此二肽比氨基酸更易于被吸收。將具有一定生理活 性的環(huán)二肽應(yīng)用到創(chuàng)面中，可以有目的的降低創(chuàng)面的感染，提高機(jī)體的自身免疫能力，在外 界與機(jī)體的雙重作用下對創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)。
[0004] 未見以亮氨酸、酪氨酸合成的環(huán)酪-亮二肽在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用的報道出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于創(chuàng)面修復(fù)的環(huán)二肽。
[0006] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽為環(huán)酪-亮二肽。
[0007] 本發(fā)明所述的環(huán)二肽的制備方法為：
[0008] 1.亮氨酸的甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入適量的 亮氨酸，在室溫下攪拌。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到亮氨酸的甲酯鹽酸鹽。
[0009] 2.中和縮合：取進(jìn)行Boc氨基保護(hù)的酪氨酸與亮氨酸的甲酯鹽酸鹽在含有 THF(四氫呋喃）、吡陡、（Boc)20、DMAP (催化劑）的條件下進(jìn)行中和縮合反應(yīng)得到N-叔丁 氧羰基-酪氨酰亮氨酸甲酯固體；
[0010] 3.脫保護(hù)：在EtoAc (乙酸乙酯）和HC1的飽和溶液的作用下對步驟2中得到的 N-叔丁氧羰基-酪氨酰亮氨酸甲酯進(jìn)行氨基脫保護(hù)處理，得到酪氨酰亮氨酸甲酯；
[0011] 4.環(huán)化：將步驟3中得到的酪氨酰亮氨酸甲酯與甲醇混合，用NaHC03調(diào)節(jié)pH后， 加熱回流18小時，過濾，柱層析純化，得到環(huán)酪-亮二肽。
[0012] 有益效果：本發(fā)明所述的環(huán)酪-亮二肽通過小鼠燒燙傷實(shí)驗與小鼠潰瘍實(shí)驗，結(jié) 果顯示本發(fā)明所述的環(huán)酪-亮二肽具有良好的創(chuàng)面修復(fù)作用，且具有治療效果明顯，創(chuàng)面 愈合速度快、疤痕淺等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下是結(jié)合具體試驗對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0014] 實(shí)施例1本發(fā)明中所述的環(huán)二肽（環(huán)酪-亮二肽）的制備方法
[0015] 主要藥品試劑：甘氨酸、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的丙氨酸
[0016] 制備環(huán)酪-亮二肽（tyr-leu)的過程：
[0017] (1)亮氨酸甲酯鹽酸鹽的制備：向適量甲醇與二氯亞砜的混合液中加入亮氨酸 l〇g，在室溫下攪拌20h。TLC跟蹤反應(yīng)完成，減壓旋干溶劑，得到亮氨酸甲酯鹽酸鹽15. 1 lg。
[0018] (2)中和縮合反應(yīng)：向100ml無水四氫呋喃中加入步驟⑴中得到的亮氨酸甲酯 鹽酸鹽、經(jīng)Boc氨基保護(hù)的酪氨酸20g、吡啶20ml、DMAP (4-二甲氨基吡啶），待全部混合后， 在氬氣的保護(hù)下加入無水四氫呋喃的（Boc)20,室溫下攪拌10小時。TLC跟蹤反應(yīng)完成，柱 層析純化（石油醚：乙酸乙酯=4:1)，旋干溶劑得到N-叔丁氧羰基-酪氨酰亮氨酸甲酯固 體 23.91g。
[0019] (3)Boc保護(hù)氨基脫保護(hù)處理：取步驟（2)中得到的N-叔丁氧羰基-酪氨酰亮氨 酸甲酯，加入乙酸乙酯鹽酸（HCl/EtOAc)的飽和溶液2. 5L，冰水浴下攪拌1. 5h，冰水浴中減 壓蒸掉溶劑，以甲醇-乙醚重結(jié)晶得酪氨酰亮氨酸甲酯固體22. 12g。
[0020] (4)環(huán)酪-亮二肽的制備：將步驟（3)中得到的酪氨酰亮氨酸甲酯加入到0. 9L甲 醇中，用NaHC03調(diào)節(jié)pH為7-8,加熱回流18h，過濾，柱層析純化（乙酸乙酯：甲醇=2:1)， 最后得到環(huán)釀 _殼二膚固體15. 49g。
[0021] 以下通過實(shí)驗對上述實(shí)施例1制備的環(huán)二肽做進(jìn)一步的應(yīng)用說明。
[0022] 實(shí)驗例1本發(fā)明所述的環(huán)二肽在潰瘍中的應(yīng)用
[0023] 1、實(shí)驗材料
[0024] 1. 1樣品：按實(shí)施例1制得樣品：環(huán)酪-亮二肽（tyr-leu)
[0025] 1. 2實(shí)驗動物：KM小鼠，18~22g，90只，雌雄各半。SD大鼠，200~220g，144只， 雌雄各半。
[0026] 1. 3實(shí)驗試劑：鹽酸雷尼替丁膠囊、達(dá)喜（鋁碳酸鎂片）
[0027] 2、樣品對胃潰瘍粘膜的保護(hù)功能評價方法
[0028] 2. 1無水乙醇致小鼠胃粘膜損傷模型試驗
[0029] 30只KM小鼠按性別與體重隨機(jī)分組（詳見表1)，各組給予相應(yīng)的藥物，各組小鼠 給藥連續(xù)10天，第9天給藥后禁食24h，自由飲水。每組的小鼠在末次給藥3h后，所有小鼠 給予0. 2ml無水乙醇進(jìn)行灌胃，1小時后處死動物，結(jié)扎幽門，1%甲醛固定，觀察并評定潰 瘍指數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)：條索狀損傷的長度大于1mm者，測定其長度，每毫米計1分，其寬度大于1mm 者計分加倍，長度與寬度均小于1mm，計〇. 5分，將計分相加即為該鼠的潰瘍指數(shù)）并計算潰 瘍抑制百分率。重復(fù)試驗3次。
[0030] 2. 2乙酸致大鼠慢性胃潰瘍模型試驗
[0031] 除假手術(shù)組（12只），其余大鼠采用10 %醋酸按0. 05ml/只平刺于胃漿膜下 0. 4-0. 5_造模。術(shù)后造模大鼠進(jìn)一步分組（詳見表2)，并于第2日開始給藥，每日1次， 各組給藥14天，末日給藥后禁食禁水一夜后處死動物。以游標(biāo)卡尺測定潰瘍最大長徑及垂 直于最大長徑的最大寬徑。計算潰瘍指數(shù)（潰瘍指數(shù)=潰瘍最大長徑X垂直于最大長徑 的最大寬徑）及潰瘍抑制率。重復(fù)試驗3次。
[0032] 3、樣品對胃潰瘍粘膜的保護(hù)功能評價結(jié)果
[0033] 3. 1樣品對無水乙醇致小鼠胃粘膜損傷的影響
[0034] 表1樣品對無水乙醇致小鼠胃粘膜損傷的影響（無土S:)(第一次）
[0035]
[0036] 注：*:與對照組比較P〈0. 01 :與陽性組比較P〈0. 05
[0037] 結(jié)果顯示，與對照組比較，實(shí)施例1制備的環(huán)酪-亮二肽可使無水乙醇致小鼠胃粘 膜損傷的潰瘍指數(shù)明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（p〈0.01)。從表1中的結(jié)果顯示，使用實(shí)施例 1制備的環(huán)酪-亮二肽給小鼠給藥10天后的潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率與鹽酸雷尼替丁膠囊 的陽性組小鼠在給藥10天后的潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率進(jìn)行比較，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義 (P〈0. 05)。實(shí)驗結(jié)果中還顯示本發(fā)明所述的環(huán)酪-亮二肽對無水乙醇致胃粘膜損傷有較好 的保護(hù)作用。
[0038] 其余兩次的重復(fù)試驗結(jié)果與表1中的結(jié)果趨勢一樣，不做進(jìn)一步說明。
[0039] 3. 2樣品對乙酸致大鼠慢性胃潰瘍模型的影響
[0040] 表2樣品對乙酸致大鼠慢性胃潰瘍模型的影響（T 土S )(第一次）
[0041]
[0042] 注：*表示與模型組比較P〈0. 05 ;#表示與陽性組比較P〈0. 05
[0043] 由表2顯示，實(shí)施例1制備的環(huán)酪-亮二肽對大鼠的潰瘍指數(shù)與模型組比較有明 顯改善，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈〇. 05);實(shí)施例1制備的環(huán)酪-