一種體外皮膚模型及角質(zhì)形成細(xì)胞長效培養(yǎng)液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種體外皮膚模型及角質(zhì)形成細(xì)胞長效培養(yǎng)液。
【背景技術(shù)】
[0002]體外皮膚模型是應(yīng)用組織工程技術(shù)在體外通過對種子細(xì)胞的條件化培養(yǎng)而構(gòu)建而成的一塊皮膚組織，該組織與人體皮膚在組織結(jié)構(gòu)及部分生物學(xué)功能上有著高度的相似性，因此被廣泛應(yīng)用于化妝品、藥品等產(chǎn)品及原料的功效性和安全性評價(jià)、檢測。目前常見的體外皮膚模型有:表皮模型，含真皮層、表皮層的全層皮膚模型，含有黑色素細(xì)胞的表皮模型等。
[0003]市售的體外皮膚模型在構(gòu)建完成后，直接保存在構(gòu)建培養(yǎng)液中，其宣傳的使用期限多以3天為主，但都推薦在模型構(gòu)建完成后24小時(shí)內(nèi)使用，因?yàn)槠つw模型為活細(xì)胞產(chǎn)品，會(huì)持續(xù)生長、分化，長時(shí)間的增殖分化必然會(huì)改變皮膚模型的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，從而導(dǎo)致測試結(jié)果不準(zhǔn)確；另外，根據(jù)某些測試目的的不同，需要延長模型的培養(yǎng)、處理時(shí)間，仍難以避免出現(xiàn)上述問題。構(gòu)建培養(yǎng)液的培養(yǎng)體系僅能支持皮膚模型正常生發(fā)，但無法滿足構(gòu)建完成后的皮膚模型維持結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性，因此開發(fā)一種可以用于體外皮膚模型培養(yǎng)、保存用的培養(yǎng)液意義重大。
[0004]角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮中的主要細(xì)胞，具有干細(xì)胞特性，能在不同培養(yǎng)條件刺激下分化成表皮基底層細(xì)胞、棘層細(xì)胞、顆粒層細(xì)胞及角質(zhì)層細(xì)胞，形成與正常表皮結(jié)構(gòu)高度一致的四層結(jié)構(gòu)。一般體外皮膚模型構(gòu)建成功后的測試培養(yǎng)周期不超過3天就會(huì)出現(xiàn)活力下降及組織過度分化的現(xiàn)象。正常分離出來的角質(zhì)形成細(xì)胞多采用K-SFM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在體外擴(kuò)增傳代不超過10代就會(huì)出現(xiàn)老化，甚至死亡的現(xiàn)象，尤其是在含血清的培養(yǎng)體系中，其老化死亡速度更快。
[0005]為延緩或重新恢復(fù)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化能力，保證體外皮膚模型結(jié)構(gòu)及活力滿足測試要求，唯有通過表皮細(xì)胞的去分化技術(shù)。一類是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)給已分化細(xì)胞通過病毒轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)入oct4，sox2，C-Myc及klf4 4種基因，經(jīng)過體外誘導(dǎo)使終末分化細(xì)胞重新具有干細(xì)胞特性，即誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS Cell);另一類是通過非轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過核移植、體細(xì)胞克隆，過氧化氫處理及熱刺激等方法使細(xì)胞去分化。但上述方法僅限于理論研究，技術(shù)難度較大，會(huì)導(dǎo)致成本倍增，不利于產(chǎn)業(yè)化操作，而且處理方法會(huì)對構(gòu)建的模型產(chǎn)生損傷，造成模型測試結(jié)果的不準(zhǔn)確。
[0006]針對以上問題，學(xué)者們通過研究發(fā)現(xiàn)，改變表皮細(xì)胞所處的微環(huán)境，有可能使已分化細(xì)胞去分化而逆轉(zhuǎn)成表皮干細(xì)胞，例如，通過給培養(yǎng)液中添加表皮細(xì)胞生長因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(β-FGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等多種因子，可以使分化的表皮細(xì)胞重新呈現(xiàn)干細(xì)胞特性。添加干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞提取液也能起到相似的作用。
[0007]通過上述處理，雖然能夠使已經(jīng)發(fā)生分化的細(xì)胞重新呈現(xiàn)分化前的狀態(tài)，同時(shí)對老化及損傷的細(xì)胞的也有一定的復(fù)壯作用，從而保證體外皮膚模型繼續(xù)保持一定的增殖分化能力，但是在正常的培養(yǎng)液中，模型也會(huì)保持正常的生長速度，甚至更快，所以單純添加上述因子或含有上述因子的混合物并不能實(shí)現(xiàn)延長模型培養(yǎng)期限的目的，無法平衡增殖與分化之間的速度。
[0008]研究表明甘醇酸有促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，溶解角質(zhì)層，抑止表皮細(xì)胞過度分化，逆轉(zhuǎn)早期腫瘤細(xì)胞惡性等作用。研究表明低劑量I X 10—7M維甲酸可以顯著降低如Kl，K10，K11等與表皮細(xì)胞分化有關(guān)的角蛋白的表達(dá)，能從一定程度上控制皮膚的過度分化，平衡增殖分化速度。
[0009]中國專利200810169475.8中提到通過改變熱刺激條件和生長因子干預(yù)的方法可使表皮細(xì)胞去分化轉(zhuǎn)變?yōu)楸砥じ杉?xì)胞。該方法需對表皮細(xì)胞熱激處理后，然后在生長因子的作用下，繼續(xù)孵育培養(yǎng)7?14天，首先前期處理時(shí)間過長，對于體外皮膚模型的生產(chǎn)周期及成本會(huì)顯著增加;其次干細(xì)胞構(gòu)建后期數(shù)量會(huì)急劇減少而得不到補(bǔ)充，不能從根本解決構(gòu)建后期模型活力降低及過度分化的問題。
[0010]中國專利200910078302.X及201010196382.1中均提及，體外皮膚模型培養(yǎng)液系統(tǒng)僅限于皮膚模型的構(gòu)建培養(yǎng)，用此類培養(yǎng)基，可保證體外皮膚模型生發(fā)成正常的結(jié)構(gòu)，對于保存期間及正常使用期間的結(jié)構(gòu)變化不能有效控制，而在此期間發(fā)生的模型屏障功能及其他精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化對模型測試結(jié)果的準(zhǔn)確性又有很大的影響;對于需要長期培養(yǎng)、處理的體外皮膚模型，應(yīng)用上述培養(yǎng)體系將會(huì)因組織活力下降、組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變化而無法實(shí)現(xiàn)。
[0011]目前還未見有一種培養(yǎng)液能夠支持含有表皮細(xì)胞的體外皮膚模型長效培養(yǎng)，因此本發(fā)明對延長體外皮膚模型應(yīng)用時(shí)間，拓寬體外皮膚模型應(yīng)用領(lǐng)域，以及表皮細(xì)胞相關(guān)疾病研究等方面有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明目的在于，主要針對體外皮膚模型在體外長效培養(yǎng)過程中，會(huì)出現(xiàn)活力下降及過度分化而導(dǎo)致無法應(yīng)用于測試的問題，本發(fā)明在體外皮膚模型基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，通過胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物與甘醇酸的協(xié)同作用，提供一種可用于體外皮膚模型及角質(zhì)形成細(xì)胞長效培養(yǎng)的培養(yǎng)液。
[0013]本發(fā)明目的主要通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種體外皮膚模型及角質(zhì)形成細(xì)胞長效培養(yǎng)用培養(yǎng)液，組分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加了胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物和甘醇酸。
[0014]所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液是K-SFM或M⑶Β153或體積比為I: 3的F12和DMEM混合培養(yǎng)液，其中添加了 5~50yg/ml 的BPE，5?50ng/ml的EGF，l~20yg/ml的膜島素，0.01?0.0.Smmol /ml 的CaCl2o
[0015]所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物的濃度為0.01?30mg/ml;
所述甘醇酸的濃度為I X 10—9?I X 10—5mol/L;
一種體外皮膚模型及角質(zhì)形成細(xì)胞長效培養(yǎng)液的配制方法如下:
在K-SFM、MCDB153、體積比為I: 3混合的F12和DMEM三種培養(yǎng)液中的任意一種中，依次添加終濃度為5?50yg/ml的BPE，5?50ng/ml 的EGF，I?20yg/ml的膜島素，0.01?0.05mmol/ml的CaCl2，制備完成基礎(chǔ)培養(yǎng);將胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物按照終濃度為0.01?30mg/ml添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，然后添加甘醇酸，終濃度I X 10—9?I X 10—5mol/L，混合均勻后用0.22μπι的濾膜過濾除菌后即可用于體外皮膚模型的長效培養(yǎng)或者角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0016]體外皮膚模型及角質(zhì)形成細(xì)胞長效培養(yǎng)液的使用方法: 將構(gòu)建培養(yǎng)成功后的體外皮膚模型中的培養(yǎng)液棄去，加入長效培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，每24小時(shí)換液I次，可以連續(xù)培養(yǎng)7天。在此期間可隨時(shí)終止培養(yǎng)，根據(jù)檢測要求直接進(jìn)行后續(xù)檢測操作。
[0017]將消化好的原代角質(zhì)形成細(xì)胞或傳代的角質(zhì)形成細(xì)胞，直接采用長效培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每24小時(shí)換液一次，擴(kuò)增至第十二代，期間可根據(jù)檢測及研究需要直接使用。
[0018]本發(fā)明中的基礎(chǔ)培養(yǎng)液含有體外皮膚模型培養(yǎng)所需基本物質(zhì)，可以保證體外皮膚模型正常生長。所使用的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物中，含有各種細(xì)胞因子，且經(jīng)過超濾濃縮處理后，有效因子及活性成分的含量得到了富集，這些因子及活性成分對于維持干細(xì)胞微環(huán)境，細(xì)胞損傷修復(fù)，以及促使分化細(xì)胞重新獲得分化能力上有極大的作用。其中干細(xì)胞生長因子(SCGF)對于激活和維持干細(xì)胞增殖、分化能力，堿性成纖維生長因子(β-FGF)可促進(jìn)內(nèi)皮樣細(xì)胞增殖，同時(shí)對損傷細(xì)胞有較好的修復(fù)作用。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)對于細(xì)胞是一多功能蛋白質(zhì)，可以影響多種細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等功能，轉(zhuǎn)化生長因子-1KTGF-β)是TGF家族的一員，可以通過SMAD信號通路和/或DAXX信號通路發(fā)揮其生物學(xué)功能。除上述因子外，干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物中還含有其他各種細(xì)胞生長因子如表皮生長因子(EGF)，神經(jīng)生長因子(NGF)，肝細(xì)胞生長因子(HGF)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，血小板源性生長因子(PDGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，這些都是干細(xì)胞生長必不可少的因子，對于維持干細(xì)胞生長環(huán)境有重要的作用。通過上述因子的作用，激活與細(xì)胞增殖、分化調(diào)節(jié)有關(guān)的最主要的MAPK通路，延緩或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞老化狀態(tài)，同時(shí)也可以修復(fù)細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞增殖、分化活力。
[0019]研究表明，甘醇酸除了對表皮有去角質(zhì)、抗增殖作用。其最基本的作用可能是在與組織蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)角質(zhì)生成細(xì)胞的分化過程。
[0020]本發(fā)明通過胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物及甘醇酸兩者的協(xié)同作用，保證了體外皮膚模型在體外長效培養(yǎng)過程中的組織活力及結(jié)構(gòu)完整，從而保證正常的模型生物學(xué)功能。其中胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物中含有細(xì)胞生長及去分化的各種因子，如TGF、EGF、FGF、SCGF等，這些因子可以有效提高組織內(nèi)細(xì)胞活性，修復(fù)損傷細(xì)胞，延緩或逆轉(zhuǎn)已分化細(xì)胞狀態(tài)，增加組織內(nèi)活細(xì)胞及有增殖分化能力細(xì)胞的數(shù)量，從而為正常組織的培養(yǎng)時(shí)間的延長提供基礎(chǔ)；同時(shí)為了保證組織不會(huì)因?yàn)榛盍υ鰪?qiáng)而隨培養(yǎng)時(shí)間增長出現(xiàn)過度增殖的現(xiàn)象，添加一定量的甘醇酸，通過其對表皮細(xì)胞增殖分化的抑制作用及對角質(zhì)層的溶解作用，達(dá)到增殖與分化的完美平衡，從而實(shí)現(xiàn)延長體外皮膚模型的體外培養(yǎng)時(shí)間，為后期測試及相關(guān)研究提供可靠地條件支持。
[0021 ]目前還未見將胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液提取物及甘醇酸用于體外皮膚模型及角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)報(bào)道，因此，本專利組合應(yīng)用以上兩種物質(zhì)，開發(fā)一種新型長效培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液能有效的平衡體外皮膚模型及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及分化速度，能延長體外皮膚模型構(gòu)建成功后的有效檢測時(shí)間，從常規(guī)3天有效檢測時(shí)間延長至7天，同時(shí)可提升常規(guī)3天有效期內(nèi)模型質(zhì)量，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，極大的滿足不同檢測條件的時(shí)間要求，拓展體外皮膚模型應(yīng)用