所述 反應(yīng)容器中，氫氧化鈉和二硫蘇糖醇的摩爾配比為(0.2-0.25) :(0.03-0.05)。所述反應(yīng)容 器中，氫氧化鈉和二硫蘇糖醇的摩爾配比為具體可為〇. 2:0.05或0.25:0.03。所述反應(yīng)容器 具體可為1.5ml EP管。所述A組件具體可為含有1.6 X l(T6m〇l氫氧化鈉和0.4 X l(T6m〇l二硫 蘇糖醇的1.5ml EP管。所述A組件具體可為含有2 X 1〇Λιο1氫氧化鈉和0.24 X 1〇Λιο1二硫 蘇糖醇的1.5ml ΕΡ管。
[0033] 所述B-1組分具體可為B-1組件。所述B-1組件為裝有硫酸氫鈉的反應(yīng)容器。所述反 應(yīng)容器具體可為1.5ml EP管。所述B-1組件具體可為含有0.352 X 10_6mol硫酸氫鈉的1.5ml EP管。
[0034] 所述B-2組分具體可為B-2組件。所述B-2組件為裝有海藻糖和甘露醇的反應(yīng)容器。 所述反應(yīng)容器中，海藻糖和甘露醇的質(zhì)量配比具體可為90: 70。所述反應(yīng)容器具體可為 1.5ml EP管。所述B-1組件具體可為含有1.08 X 10-3g海藻糖和0.84 X 10-3g甘露醇的1.5ml EP管。
[0035] 所述生物為微生物或動物。所述微生物具體可為鴨瘟病毒或人類皰疹病毒。所述 動物可為人。
[0036] 本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述的試劑盒在提取生物核酸中的應(yīng)用。所述生物為微生 物或動物。所述微生物具體可為鴨瘟病毒或人類皰疹病毒。所述動物可為人。
[0037] 步驟（1)中，反應(yīng)溫度可為室溫(20°C)至105°C。步驟（1)中：如反應(yīng)溫度偏低，會導(dǎo) 致反應(yīng)時間過長;如反應(yīng)溫度較高，雖然可縮短反應(yīng)時間，但對配套儀器裝置要求較高且有 可能導(dǎo)致預(yù)埋在微流控芯片上的生物試劑的活性受到影響。綜合考慮，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為 50。〇75。(：。
[0038] 液態(tài)形式的試劑普遍存在需要低溫保存和運(yùn)輸?shù)膯栴}。本發(fā)明提供的試劑盒中的 組分可以以固態(tài)形式預(yù)先包埋于微流控芯片內(nèi)或其他密閉容器中，便于保存及運(yùn)輸，同時 也簡化了使用時的操作。
[0039] 唾液、痰液等臨床樣品中富含大量粘蛋白，利用常規(guī)堿裂解法裂解，存在裂解時間 長且裂解后的樣品擴(kuò)增不理想等問題，組分A成功克服了上述問題，可以有效快速裂解富含 大量粘蛋白或其他雜蛋白的臨床樣品（例如血清、唾液、淚液、痰液或尿液）。將步驟（1)得到 的裂解產(chǎn)物與組分B混勻，可直接作為模板，用于后續(xù)的核酸反應(yīng)操作(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增等），無需進(jìn)行離心純化、簡便快速。本發(fā)明極大程度上解決了因流程復(fù) 雜而難以集成到微流控芯片的問題。
[0040] 本發(fā)明提供的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：步驟簡單;成本低廉;反應(yīng)條件溫和;試劑保存 容易;所得到的核酸提取物無需純化步驟即可應(yīng)用于后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)，幾乎不會造成核酸的 損失，便于集成到微流控芯片內(nèi)。
【附圖說明】
[0041] 圖1為實(shí)施例1的檢測結(jié)果。
[0042]圖2為實(shí)施例2的檢測結(jié)果。
[0043]圖3為實(shí)施例3的檢測結(jié)果。
[0044]圖4為實(shí)施例4的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0046] 鴨痕病毒：美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture collection)即 ATCC，毒株編號VR-684。
[0047] 實(shí)施例1、提取鴨瘟病毒核酸 [0048] 一、試劑盒的制備
[0049] 分別制備三個試劑盒，每個試劑盒由獨(dú)立包裝的A液和B液組成。
[0050] 試劑盒I中，A液為含有0. lmol/L氫氧化鈉和0.01m〇l/L二硫蘇糖醇的水溶液，B液 為0.08mol/L硫酸氫鈉水溶液。
[00511 試劑盒II中，A液為含有0.2mol/L氫氧化鈉和0.05mol/L二硫蘇糖醇的水溶液，B液 為0.44mol/L硫酸氫鈉水溶液。
[0052] 試劑盒III中，A液為含有0.5mol/L氫氧化鈉和0. lmol/L二硫蘇糖醇的水溶液，B液 為0.8mol/L硫酸氫鈉水溶液。
[0053]二、試劑盒的應(yīng)用 [0054] 1、制備待測樣本液
[0055]取濃度為IX 108個拷貝/ml的鴨瘟病毒原液，用無菌水稀釋至1000倍體積，作為待 測樣本液。
[0056] 2、將10yL試劑盒I中的A液與90yL待測樣本液混合，65°C靜置反應(yīng)30min，得到反應(yīng) 體系I;將10yL試劑盒II中的A液與90yL待測樣本液混合，65°C靜置反應(yīng)15min，得到反應(yīng)體 系II;將10yL試劑盒III中的A液與90yL待測樣本液混合，65°C靜置反應(yīng)5min，得到反應(yīng)體系 III。
[0057] 3、將3體積份反應(yīng)體系I與2體積份試劑盒I中的B液混合，得到核酸提取液I;將3體 積份反應(yīng)體系II與2體積份試劑盒II中的B液混合，得到核酸提取液II;將3體積份反應(yīng)體系 III與2體積份試劑盒III中的B液混合，得到核酸提取液III。
[0058] 4、取4yL步驟3得到的核酸提取液（核酸提取液I、核酸提取液II或核酸提取液 III)，與21yL PCR擴(kuò)增試劑混勻，然后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)（反應(yīng)條件：94°C2min;94°C 15s、55 °C 30s，40 個循環(huán)）。
[0059] PCR擴(kuò)增試劑為廣州維伯鑫生物科技有限公司的"鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒 (PCR-熒光探針法)"中的組件。
[0060] 采用每個試劑盒時設(shè)置三個重復(fù)處理。
[0061] 結(jié)果如圖1所示，用試劑盒I得到的測試結(jié)果為圖1(a)，用試劑盒II得到的測試結(jié) 果為圖1(b)，用試劑盒III得到的測試結(jié)果為圖1(c)。三組測試曲線中待測樣本液的ct值均 有明顯梯度，每組待測樣本液中的三個重復(fù)處理的檢測曲線基本一致，說明本發(fā)明提供的 試劑組分及其提取方法可直接用于對不同濃度的鴨瘟病毒進(jìn)行準(zhǔn)確定量的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
[0062] 實(shí)施例2、從唾液中提取人類皰疹病毒核酸 [0063] 一、試劑盒的制備
[0064]試劑盒包括A管和B管。
[0065]制備試劑盒IV，由A管和B管組成。
[0066] A管：將8yL的A液(A液為含有0.2mol/L氫氧化鈉和0.05m〇VL二硫蘇糖醇的水溶 液)加入1.5ml EP管中，然后干燥至無水，得到含有1.6 X ΙΟΛιοΙ氫氧化鈉和0.4 X 10_6mol 二硫蘇糖醇的1.5ml ΕΡ管。
[0067] B管:將0.8yL的B液(B液為0.44mol/L硫酸氫鈉水溶液)加入1.5ml EP管中，然后干 燥至無水，得到含有〇. 352 X 10-6mol硫酸氫鈉的1.5ml EP管。
[0068]二、試劑盒的應(yīng)用
[0069] 1、已經(jīng)醫(yī)院確診感染人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr virus)的患者(知情同 意的志愿者），取唾液。
[0070] 2、取80μ1唾液，加入A管中，65°C靜置反應(yīng)30min。
[0071 ] 3、完成步驟2后，吸取A管中的所有液相，加入B管中，充分混勻。
[0072] 4、完成步驟3后，取B管中的所有液相，與等溫擴(kuò)增試劑混合(B管中的所有液相與 等溫擴(kuò)增試劑的體積比為3:2)，然后注入到預(yù)先包埋人皰疹病毒4型引物的微流控芯片內(nèi)， 然后將芯片放入恒溫擴(kuò)增微流控芯片核酸分析儀內(nèi)，完成擴(kuò)增反應(yīng)。
[0073] 等溫擴(kuò)增試劑，參見文獻(xiàn)"Rapid detection of Epstein-Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplification method"，Seiko Iwata,Yukiko Shibata, Jun-ichi Kawada,Shinya Hara,Yukihiro Nishiyama,Tsuneo Morishima,Masaru Ihira, Tetsushi Yoshikawa,Yoshizo Asano,Hiroshi Kimura，Journal of Clinical Virology 37(2006)128-133。
[0074] 人皰疫病毒4型引物，參見文獻(xiàn)"Rapid detection of Epstein-Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplification method"，Seiko Iwata,Yukiko Shibata， Jun-ichi Kawada,Shinya Hara,Yukihiro Nishiyama,Tsuneo Morishima,Masaru Ihira， Tetsushi Yoshikawa,Yoshizo Asano,Hiroshi Kimura，Journal of Clinical Virology 37(2006)128-133。
[0075] 微流控芯片，參見實(shí)用新型專利"多指標(biāo)檢測的微流控芯片"（申請日： CN201420103225.5;公開（公告）號：CN 203750554U)。
[0076] 恒溫擴(kuò)增微流控芯片核酸分析儀:晶^^RTisochipTM-A恒溫擴(kuò)增微流控芯片核酸 分析儀，博奧生物集團(tuán)有限公司。
[0077] 擴(kuò)增反應(yīng)的條件:65°C，60min。
[0078] 進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。
[0079] 結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，本發(fā)