小鼠細(xì)小病毒定量pcr檢測(cè)方法及其引物與探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域，特別是設(shè)及小鼠細(xì)小病毒的定量PCR檢測(cè)，及其所用的引物 和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的飛速發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視疫苗等生物制品的安全性，加強(qiáng) 了對(duì)其的質(zhì)量控制。生物制品的質(zhì)量控制不僅僅是對(duì)終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，還是對(duì)整個(gè)生產(chǎn) 過程的質(zhì)量控制。因此，全球各國(guó)監(jiān)管當(dāng)局要求生產(chǎn)企業(yè)在臨床試驗(yàn)被批準(zhǔn)前及生物藥和 疫苗終產(chǎn)品釋放前，生產(chǎn)流程的各個(gè)環(huán)節(jié)都必須通過繁復(fù)的安全測(cè)試W證明產(chǎn)品的一致 性、穩(wěn)定性及純度。
[0003] 曬齒類動(dòng)物及衍生的傳代細(xì)胞系CH0,廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗和治療性生物制品。 CH0細(xì)胞高度易感于小鼠細(xì)小病毒(Minute Virus of Mice,MVM)，MVM曾在日常生物藥生產(chǎn) 過程中引起原液的污染。MVM基因組為單鏈線狀DM,約5.化b，存在兩個(gè)開放閱讀框，一個(gè)編 碼衣殼蛋白，另一個(gè)編碼非結(jié)構(gòu)(non-structure，NS)蛋白。MVM可W致先天性胎兒崎形，從 而導(dǎo)致流產(chǎn)。因此，提供一種合適的檢測(cè)MVM的方法，從而擁有一個(gè)高效的細(xì)胞基質(zhì)、原液病 毒感染的排除機(jī)制，變得非常必要。
[0004] 目前常用的檢測(cè)MVM方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法、免疫酶試驗(yàn)方法和免疫巧光 試驗(yàn)方法，但運(yùn)些方法都存在操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、特異性和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。
[0005] 定量PCR，又稱定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)（Quantitative real time polymerase chain reaction)，是指用外標(biāo)法(巧光雜交探針保證特異性)通過監(jiān)測(cè)PCR過程(監(jiān)測(cè)擴(kuò)增 效率)達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時(shí)W內(nèi)對(duì)照有效排除假陰性結(jié)果(擴(kuò)增效率為 零)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種小鼠細(xì)小病毒的定量PCR檢測(cè)方法，它 簡(jiǎn)單，高效，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的小鼠細(xì)小病毒的定量PCR檢測(cè)方法，步驟包括：
[000引1)提取待測(cè)樣品DNA;
[0009] 2)制備包含Master mix、上下游引物、探針的PCR反應(yīng)液；
[0010] 3)梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；
[00川 4)試劑的陰性對(duì)照、待測(cè)樣品的陰性對(duì)照W及加入了標(biāo)準(zhǔn)品的待測(cè)樣品上樣； [0012] 5)PCR 反應(yīng)。
[001引步驟1)，待測(cè)樣品DNA模板的濃度為0.化g/yL。
[0014]步驟3)，至少5個(gè)W上十倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍一般為10~105拷貝。 [001引步驟5)，PCR反應(yīng)體系為25微升，正反向引物的終濃度分別為lOOnM，探針的終濃度 為25化M。反應(yīng)條件為：50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 15秒，60°C 1分鐘，45個(gè)循環(huán)。所述 正向引物具有如SEQ ID NO.1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO.2 所不的序列或其互補(bǔ)序列，所述換針具有如SEQ ID NO.3所不的序列或其互補(bǔ)序列。
[0016] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一對(duì)用于上述小鼠細(xì)小病毒定量PCR檢測(cè)方 法的引物對(duì)。所述引物對(duì)包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如SEQ ID NO.1所示 的序列或其互補(bǔ)序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO. 2所不的序列或其互補(bǔ)序列。
[0017] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之Ξ是提供一條用于上述小鼠細(xì)小病毒定量PCR檢測(cè)方 法的探針。所述探針具有如SEQ ID NO.3所示的序列或其互補(bǔ)序列。
[001引本發(fā)明采用化qMan探針的定量PCR方法檢測(cè)小鼠細(xì)小病毒，相比傳統(tǒng)的MVM檢測(cè)方 法，不僅具有更高的特異性和靈敏性，而且簡(jiǎn)單易操作，檢測(cè)耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性 好，適合生物生產(chǎn)過程中各個(gè)階段的MVM感染測(cè)試，例如動(dòng)物來(lái)源的原輔料、原液和臨床試 驗(yàn)產(chǎn)品批次，特別是原料測(cè)試中包含的主細(xì)胞庫(kù)(Master cell bank,MCB)、工作細(xì)胞庫(kù) (Working cell bank,WCB)、最終生產(chǎn)細(xì)胞化nd of Production,EPC)等等。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā) 明詳述如下：
[0020] 本實(shí)施例的小鼠細(xì)小病毒的定量PCR檢測(cè)方法，具體步驟為：
[0021] 步驟1，用蛋白酶K/SDS消化、多次酪/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法，或者使用其它商 業(yè)化試劑盒，提取待測(cè)樣品的DNA，并將DNA模板的濃度調(diào)整為0.化g/yL。如果DNA濃度很低， 則W最小體積的1 X TE緩沖液重懸DNA。
[0022] 步驟2，制備包含有1 XMaster mix、上游引物(終濃度為lOOnM)、下游引物(終濃度 為lOOnM)、探針(終濃度為250nM)的PCR反應(yīng)液。所用引物和探針的序列如下：
[002；3] MVM正向引物:TTACAACGAGGAGCGGAAACTAC (沈Q ID N0.1)
[0024] MVM反向引物：CTGTGGTTTCCCATTCCATGT (沈Q ID NO. 2)
[0025] MVM探針:TGGGACCAAAGCGAG (沈Q ID NO.3)
[0026] 步驟3,稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。至少5個(gè)十倍梯度稀釋，一般標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為10~lO5拷貝。 本實(shí)施例使用含有MVM基因組NS-1基因區(qū)域的、自定義合成（載體pTC57-Amp，載體大小約 270化P，克隆位點(diǎn)為5 ' EcoRV、3 ' EcoRV)的質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0027] 步驟4,上樣。包括:試劑的陰性對(duì)照（指含有除DNA模板W外所有組分的反應(yīng)孔）， 測(cè)試樣品的陰性對(duì)照（一般為從朋和皿K 293細(xì)胞中純化的DNA)，陽(yáng)性對(duì)照（即標(biāo)準(zhǔn)品），W 及加入了標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)試品（用來(lái)監(jiān)控PCR的干擾情況）。
[00%]步驟5,采用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。通常反應(yīng)體系為25微升，反應(yīng)條 件為50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，其后的95°C 15秒和60°C 1分鐘共45個(gè)循環(huán)。
[0029] 步驟6,結(jié)果分析。在結(jié)果符合W下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，認(rèn)為檢測(cè)是有效的：
[0030] 1)滲雜了 1000拷貝MVM DNA標(biāo)準(zhǔn)品的朋或皿K 293(對(duì)照)DNA，必須顯示高于背景 的巧光信號(hào)；
[0031] 2)100拷貝的MVM DNA標(biāo)準(zhǔn)品，必須顯示高于背景的巧光信號(hào)；
[0032] 3)高于等于檢測(cè)極限(L0D)的巧光信號(hào)，在試劑對(duì)照里必須不可檢測(cè)到；
[0033] 4)高于等于檢測(cè)極限化0D)的巧光信號(hào)，在沒有滲雜的朋或皿K 293(對(duì)照）的DNA 樣品里必須不可檢測(cè)到；
[0034] 5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2,必須大于等于0.90。
[0035] 在檢測(cè)有效的情況下，按照不同情況給出不同的結(jié)果報(bào)告：
[0036] 1)如果在PCR擴(kuò)增的沒有滲雜的測(cè)試樣品DNA的所有重復(fù)(孔）中，巧光信號(hào)都低于 L0D，表明在該樣品里，對(duì)所用引物和探針特異的MVM序列沒有達(dá)到可檢測(cè)量的存在。結(jié)果將 報(bào)告為"陰伴'。
[0037] 2)如果在PCR擴(kuò)增的沒有滲雜的測(cè)試樣品DNA的任意二個(gè)重復(fù)(孔）中，特異的巧光 信號(hào)等于或高于L0D;相比之下，陰性對(duì)照沒有運(yùn)樣的巧光信號(hào)，表明在該樣品里，存在MVM DNA。結(jié)果報(bào)告為"陽(yáng)伴'。
[0038] 3)如果等于或高于L0D的特異巧光信號(hào)，只在PCR擴(kuò)增的沒有滲雜的測(cè)試樣品DNA 的一個(gè)重復(fù)(孔)中檢測(cè)到，結(jié)果將報(bào)告為"陽(yáng)性候選:要求確認(rèn)"。
[0039] 4)如果在滲雜了 100和1000拷貝MVM DNA標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)試樣品中，都沒有檢測(cè)到高于 背景的巧光信號(hào)，結(jié)果報(bào)告為："測(cè)試品干擾PCR反應(yīng)"。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 小鼠細(xì)小病毒的定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟包括： 1) 提取待測(cè)樣品DNA; 2) 制備包含Mas ter mix、正向引物、反向引物和探針的PCR反應(yīng)液； 3) 梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品； 4) 試劑的陰性對(duì)照、待測(cè)樣品的陰性對(duì)照以及加入了標(biāo)準(zhǔn)品的待測(cè)樣品上樣； 5. PCR反應(yīng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)，待測(cè)樣品DNA模板的濃度為0. lyg/ yL〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，5個(gè)以上十倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為10~105拷貝。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)，PCR反應(yīng)體系為25微升，引物的終 濃度為ΙΟΟηΜ，探針的終濃度為250nM。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)，PCR反應(yīng)條件為:50°C 2分鐘;95°C 10分鐘;95°C 15秒，60°C 1分鐘，45個(gè)循環(huán)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述正向引物具有如SEQ ID NO. 1所示的 序列或其互補(bǔ)序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述探針 具有如SEQ ID NO.3所示的序列或其互補(bǔ)序列。8. 用于小鼠細(xì)小病毒定量PCR檢測(cè)方法的引物對(duì)，其特征在于，包括正向引物和反向引 物，所述正向引物具有如SEQ ID NO.1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO.2所示的序列或其互補(bǔ)序列。9. 用于小鼠細(xì)小病毒定量PCR檢測(cè)方法的探針，其特征在于，所述探針具有如SEQ ID NO. 3所示的序列或其互補(bǔ)序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小鼠細(xì)小病毒的定量PCR檢測(cè)方法，步驟包括：1)提取待測(cè)樣品DNA；2)制備包含Master？mix、上下游引物、探針的PCR反應(yīng)液；3)梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；4)試劑的陰性對(duì)照、待測(cè)樣品的陰性對(duì)照以及加入了標(biāo)準(zhǔn)品的待測(cè)樣品上樣；5)PCR反應(yīng)。本發(fā)明還公開了上述方法所用的引物對(duì)和探針的序列。本發(fā)明采用TaqMan探針的定量PCR方法檢測(cè)小鼠細(xì)小病毒，相比傳統(tǒng)的MVM檢測(cè)方法，不僅具有更高的特異性和靈敏性，而且簡(jiǎn)單易操作，檢測(cè)耗時(shí)短，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適合生物生產(chǎn)過程中各個(gè)階段的MVM感染測(cè)試。
【IPC分類】C12Q1/70, C12N15/11, C12R1/93, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105506187
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610091937
【發(fā)明人】錢學(xué)敏, 姜東秀, 劉大鈞
【申請(qǐng)人】蘇州藥明康德檢測(cè)檢驗(yàn)有限責(zé)任公司, 無(wú)錫藥明康德生物技術(shù)股份有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年2月19日