4);2Primer Reverse: 5 '-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3 '（序列5)。
[0052] W上述149例腫瘤患者腫瘤的基因組DM為模板，分別用上述引物對(duì)1和引物對(duì)2進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0化3] PCR擴(kuò)增體系如表1所示：
[0054]表1、擴(kuò)增體系
[0化5]
[0化6] PCR反應(yīng)條件如表2所示：[0057] 表2、反應(yīng)條件
[0化引 [0化9]
[0060]對(duì)獲得的所有引物的PCR產(chǎn)物分別測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn):BRAF基因的（未突變的野生型 BRAF基因核巧酸序列為序列表中序列1)體細(xì)胞變異與ACTH型垂體腺瘤密切相關(guān)，具體結(jié)果 如下：
[0061 ]在總共149例腫瘤中，發(fā)現(xiàn)有23例腫瘤存在BRAF基因突變（15.44%)，共有巧巾突變 類型:第1種突變方式為將序列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核巧酸分子由A突變 為T(雜合突變），第巧巾突變方式為將序列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核巧酸分 子由A突變?yōu)門(純合突變）。其中，14例患者為第1種突變方式;9例患者為第巧中突變方式。 [0062] BRAF突變型患者中腫瘤平均直徑為1.171cm，午夜血清皮質(zhì)醇濃度均值9ug/ul，手 術(shù)全切率100%，其中，呈侵襲性生長(zhǎng)腫瘤的比例為4.35% ;BRAF野生型患者，該組腫瘤的平 均直徑為1.〇14畑1，午夜血清皮質(zhì)醇濃度均值41.17雌/111，手術(shù)全切率88%，其中，呈侵襲性 生長(zhǎng)腫瘤的比例為13.49%。
[0063] 因此，可W通過BRAF基因是否發(fā)生突變檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者 的腫瘤亞型，具體方法如下：
[0064] 檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因或其部分片段序列，
[0065] 若所述待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因全長(zhǎng)或其部分片段序列與BRAF 基因野生型全長(zhǎng)序列或?qū)?yīng)部分片段序列不一致，則待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤為或候 選為ACTH型垂體腺瘤突變型;若所述待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因全長(zhǎng)或其部 分片段序列與所述BRAF基因野生型全長(zhǎng)序列或?qū)?yīng)部分片段序列一致，則待測(cè)ACTH型垂體 腺瘤患者腫瘤為或候選為ACTH型垂體腺瘤野生型；
[0066] ACTH型垂體腺瘤野生型的BRAF基因的核巧酸序列為序列表中序列1。
[0067] 上述檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因或其部分片段序列方法如下：
[0068] 1)直接測(cè)序待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因或其部分片段序列；
[0069] 2)用引物對(duì)1和引物對(duì)2分別擴(kuò)增待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因不同 部分片段；
[0070] 引物對(duì)1由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分 子組成；
[0071] 引物對(duì)袖序列表中序列4所示的單鏈DNA分子和序列表中序列5所示的單鏈DNA分 子組成。
[0072] 實(shí)施例2、BRAF基因是否突變?cè)谳o助鑒定ACTH型垂體腺瘤亞型中的應(yīng)用
[0073] 對(duì)150例已經(jīng)經(jīng)過病理檢測(cè)的非ACTH型垂體腺瘤患者(包括無激素型、泌乳素型、 生長(zhǎng)激素型各50例）腫瘤和實(shí)施例1的149例ACTH型垂體腺瘤患者(來源于復(fù)旦大學(xué)附屬華 山醫(yī)院，患者均知情同意)腫瘤進(jìn)行BRAF基因突變檢測(cè)，具體方法如下：
[0074] 提取各垂體腺瘤患者腫瘤的基因組DNA，用實(shí)施例1的引物對(duì)1和引物對(duì)2分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。
[0075] 測(cè)序結(jié)果如下：150例非ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核巧酸序列均 與序列1所示的BRAF基因全長(zhǎng)或其部分片段序列一致，150例非ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤均 為ACTH型垂體腺瘤野生型；
[0076] 實(shí)施例1的149例ACTH型垂體腺瘤患者中22例患者的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核巧酸序列與 序列1所示的BRAF基因全長(zhǎng)或其部分片段序列不一致，為ACTH型垂體腺瘤突變亞型患者，占 到總數(shù)的15.83 %。
[0077] 因此，可W通過BRAF基因是否發(fā)生突變輔助檢測(cè)待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤的ACTH型 垂體腺瘤亞型，具體方法如下：
[0078] 檢測(cè)待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因全長(zhǎng)或其部分片段序列與BRAF基因野生 型全長(zhǎng)序列或?qū)?yīng)部分片段序列不一致，則待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤候選為ACTH型垂體腺瘤 突變亞型;若所述待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因全長(zhǎng)或其部分片段序列與BRAF基因野 生型全長(zhǎng)序列或?qū)?yīng)部分片段序列一致，則待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤候選為ACTH型垂體腺瘤 野生型;BRAF基因野生型序列為序列表中序列1。
[0079] 上述方法中，輔助檢測(cè)待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因或其部分片段序列方法 如下：
[0080] 1)直接測(cè)序待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因或其部分片段序列；
[0081] 2)用引物對(duì)1和引物對(duì)2分別擴(kuò)增待測(cè)垂體腺瘤患者腫瘤中BRAF基因不同部分片 段；
[0082] 引物對(duì)1由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分 子組成；
[0083] 引物對(duì)袖序列表中序列4所示的單鏈DNA分子和序列表中序列5所示的單鏈DNA分 子組成。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患 者腫瘤亞型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)為如下1)或2)或3): 1) 擴(kuò)增所述BRAF基因的引物； 2) 含有所述1)的PCR試劑組； 3) 含有所述1)或所述2)的試劑盒。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述擴(kuò)增所述BRAF基因的引物為引物 對(duì)1和/或引物對(duì)2; 所述引物對(duì)1由序列2所示的單鏈DNA和序列3所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)2由序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA組成。4. 檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)，為如下1)或2)或3): 1) 擴(kuò)增所述BRAF基因的引物； 2) 含有所述1)的PCR試劑組； 3) 含有所述1)或所述2)的試劑盒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)，其特征在于:所述擴(kuò)增所述BRAF基因的引物為引物對(duì)1 和/或引物對(duì)2; 所述引物對(duì)1由序列2所示的單鏈DNA和序列3所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)2由序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA組成。6. -種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤亞型的試劑盒，包括權(quán)利要求4 或5所述的物質(zhì)中的引物對(duì)1和/或引物對(duì)2。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含數(shù)據(jù)處理裝置;所述 數(shù)據(jù)處理裝置內(nèi)設(shè)模塊;所述模塊具有如下功能:根據(jù)待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因是 否發(fā)生突變確定所述待測(cè)患者為ACTH型垂體腺瘤突變型還是ACTH型垂體腺瘤野生型， 若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因發(fā)生突變，則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂體腺瘤 突變型； 若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因未發(fā)生突變，則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂體腺 瘤野生型； 所述ACTH型垂體腺瘤突變型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序列1所 示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段不完全一致； 所述ACTH型垂體腺瘤野生型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序列1所 示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段完全一致。8. -種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤亞型的方法，是檢測(cè)待測(cè)患者腫 瘤組織中的BRAF基因是否發(fā)生突變，根據(jù)待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因是否發(fā)生突變確 定所述待測(cè)患者為ACTH型垂體腺瘤突變型還是ACTH型垂體腺瘤野生型， 若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因發(fā)生突變，則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂體腺瘤 突變型； 若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因未發(fā)生突變，則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂體腺 瘤野生型； 所述ACTH型垂體腺瘤突變型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序列1所 示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段不完全一致； 所述ACTH型垂體腺瘤野生型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序列1所 示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段完全一致。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述檢測(cè)待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因 是否發(fā)生突變的方法為如下A)或B): A) 直接測(cè)序； B) 用能夠擴(kuò)增所述BRAF基因的引物擴(kuò)增所述待測(cè)患者的基因組DNA。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述擴(kuò)增所述BRAF基因的引物為引物對(duì)1 和/或引物對(duì)2; 所述引物對(duì)1由序列2所示的單鏈DNA和序列3所示的單鏈DNA組成； 所述引物對(duì)2由序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA組成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種BRAF基因檢測(cè)物在制備ACTH型垂體腺瘤分子病理診斷及分型產(chǎn)品中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明：BRAF基因突變?yōu)锳CTH型垂體腺瘤所特有，其他類型的垂體腺瘤中未見該基因突變，可作為ACTH型垂體腺瘤一個(gè)特異性的分子病理診斷標(biāo)記物。根據(jù)BRAF基因是否突變可進(jìn)一步將ACTH垂體腺瘤分為兩種亞型，即BRAF突變型和野生型，前者平均體積偏小，侵襲度小，午夜血清皮質(zhì)醇濃度小于或等于22ug/dl；后組平均體積偏大，侵襲度大，午夜血清皮質(zhì)醇濃度大于22ug/dl。因此可以通過檢測(cè)BRAF基因是否突變判斷ACTH垂體腺瘤的不同亞型，從而及時(shí)采取不同的臨床治療策略。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105506116
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610005084
【發(fā)明人】師詠勇, 趙曜, 黃傳新, 陳劍華, 宋智健, 馬增翼, 張啟麟, 間學(xué)敏, 李士其, 王鏞斐, 葉紅英, 葉釗
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué), 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年1月5日