Braf基因檢測(cè)物在制備acth型垂體腺瘤分子病理診斷及分型產(chǎn)品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及BRAF基因檢測(cè)物在制備ACTH型垂體腺瘤分子病理診斷及分型產(chǎn)品中 的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 垂體瘤(Pitu;Ua巧adenomas)是人體最常見(jiàn)的神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，也是最常見(jiàn)的 腦腫瘤之一(發(fā)病率占第2位）。按其不同的內(nèi)分泌特性，可分為泌乳素型、生長(zhǎng)激素型、促腎 上腺皮質(zhì)激素型，促甲狀腺激素型、無(wú)激素型W及混合型等若干亞型。腫瘤通過(guò)異常分泌各 種激素，導(dǎo)致患者出現(xiàn)不孕不育、肢端肥大、Cushing綜合癥、甲亢等顯著的內(nèi)分泌素亂癥 狀。垂體瘤發(fā)病隱匿，生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)患者出現(xiàn)臨床癥狀前往就診時(shí)，腫瘤往往已體積巨大，呈 侵襲性生長(zhǎng)，壓迫鄰近重要解剖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)垂體功能低下、雙眼視力下降和煩神經(jīng) 麻搏等神經(jīng)功能缺失癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。
[0003] 促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)型垂體腺瘤系由垂體腺中的促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞分 泌大量的ACTH，促進(jìn)腎上腺分泌大量的皮質(zhì)醇，最終導(dǎo)致內(nèi)源性血皮質(zhì)醇增多癥，繼而產(chǎn)生 一系列的代謝素亂和病理變化，特稱(chēng)之為庫(kù)欣病(Cushing' S diease)，數(shù)量占 ACTH依賴(lài)性 庫(kù)欣綜合征的85 %。庫(kù)欣病是一種嚴(yán)重的內(nèi)分泌疾病，極少自行緩解，若不及時(shí)診治，病死 率很高。該病患者主要表現(xiàn)為向屯、性肥胖，高血壓，屯、血管疾病，代謝素亂綜合征，骨質(zhì)疏松 等。雖然庫(kù)欣病的分子發(fā)病機(jī)制已被廣泛研究，但ACTH產(chǎn)生過(guò)剩的致病遺傳機(jī)制仍然不明 確。目前垂體瘤的臨床治療W手術(shù)切除為主，藥物和立體定向放療為輔，但只有少數(shù)患者通 過(guò)運(yùn)些方法獲得治愈，大多數(shù)經(jīng)治病例在較短的癥狀緩解期后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。因此臨床上 隧待新的治療方法。此外，發(fā)現(xiàn)ACTH型垂體腺瘤可呈現(xiàn)截然不同的影像學(xué)表現(xiàn)及臨床表型： 部分腫瘤體積微小，且病灶呈彌散狀分布，手術(shù)前定位非常困難;而部分腫瘤體積巨大，同 時(shí)向周邊侵襲性生長(zhǎng)，手術(shù)中極難獲得腫瘤全切除。推測(cè)它們可能分屬于ACTH型垂體瘤兩 種不同的亞型，對(duì)其應(yīng)該采取不同的臨床治療策略。目前尚無(wú)特異性的分子診斷標(biāo)記物可 將它們進(jìn)行鑒別診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)的新用途。
[0005] 本發(fā)明提供了檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè) ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤亞型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0006] 上述應(yīng)用中，所述BRAF基因的核巧酸序列為序列1。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)包括如下1)或2)或3):
[000引1)擴(kuò)增所述BRAF基因的引物；
[0009] 2)含有所述1)的PCR試劑組；
[0010 ] 3)含有所逝）或所述2)的試劑盒；
[001。 所述擴(kuò)增所述BRAF基因的引物為引物對(duì)1和/或引物對(duì)2;
[001 ^ 所述引物對(duì)1由序列2所示的單鏈DNA和序列3所示的單鏈DNA組成；
[001 ；3 ] 所述引物對(duì)袖序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA組成。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)。
[0015] 上述物質(zhì)中，所述檢測(cè)BRAF基因是否發(fā)生突變的物質(zhì)包括如下1)或2)或3):
[0016] 1)擴(kuò)增所述BRAF基因的引物；
[0017] 2)含有所逝）的PCR試劑組；
[0018] 3)含有所述1)或所述2)的試劑盒；
[0019] 所述擴(kuò)增所述BRAF基因的引物為引物對(duì)1或引物對(duì)2;
[0020] 所述引物對(duì)1由序列2所示的單鏈DNA和序列3所示的單鏈DNA組成；
[0021] 所述引物對(duì)2由序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA組成。
[0022] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤 亞型的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤亞型的試劑盒包括 上述物質(zhì)中的引物對(duì)1或引物對(duì)2。
[0024] 上述試劑盒還包含數(shù)據(jù)處理裝置;所述數(shù)據(jù)處理裝置內(nèi)設(shè)模塊;所述模塊具有如 下功能:根據(jù)待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因是否發(fā)生突變確定所述待測(cè)患者為ACTH型垂 體腺瘤突變型還是ACTH型垂體腺瘤野生型，若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因發(fā)生突變， 則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂體腺瘤突變型;若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因未發(fā)生 突變，則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂體腺瘤野生型；
[00巧]所述BRAF基因的序列如序列表中序列1所不；
[0026] 所述ACTH型垂體腺瘤突變型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序 列1所示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段不完全一致；
[0027] 所述ACTH型垂體腺瘤野生型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序 列1所示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段完全一致；
[0028] 所述BRAF基因的部分片段序列為序列表中序列1的第19200-19609位或序列表中 序列1的第19221-19444位。
[0029] 上述應(yīng)用或物質(zhì)或試劑盒中，ACTH垂體腺瘤的兩種亞型：腫瘤午夜血清皮質(zhì)醇濃 度大于22ug/dl為野生亞型，野生亞型的腫瘤體積小，且病灶呈彌散狀分布；腫瘤午夜血清 皮質(zhì)醇濃度小于或等于22ug/dl為突變亞型，突變亞型的部分腫瘤體積巨大，同時(shí)向周邊侵 襲性生長(zhǎng)。突變亞型為BRAF基因野生型發(fā)生突變得到的基因。
[0030] 上述應(yīng)用或物質(zhì)或試劑盒中，所述突變共有兩種突變方式:第1種突變方式為將序 列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核巧酸分子由A突變?yōu)門(mén)(雜合突變）；第巧中突變 方式為將序列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核巧酸分子由A突變?yōu)門(mén)(純合突變）。 [0031 ]本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫 瘤亞型的方法。
[0032]本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)ACTH型垂體腺瘤患者腫瘤亞型的方法是檢測(cè) 待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因是否發(fā)生突變，根據(jù)待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因是否 發(fā)生突變確定所述待測(cè)患者為ACTH型垂體腺瘤突變型還是ACTH型垂體腺瘤野生型，
[0033] 若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因發(fā)生突變，則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂體 腺瘤突變型；
[0034] 若待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因未發(fā)生突變，則待測(cè)患者為或候選為ACTH型垂 體腺瘤野生型；
[0035] 所述ACTH型垂體腺瘤突變型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序 列1所示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段不完全一致；
[0036] 所述ACTH型垂體腺瘤野生型患者的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段序列與序列表中序 列1所示的BRAF基因全長(zhǎng)或部分片段完全一致。
[0037] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)患者腫瘤組織中的BRAF基因是否發(fā)生突變的方法為如 下A)或B):
[003引 A)直接測(cè)序；
[0039] B)用能夠擴(kuò)增所述BRAF基因的引物擴(kuò)增所述待測(cè)患者的基因組DNA。
[0040] 上述方法中，所述擴(kuò)增所述BRAF基因的引物為引物對(duì)1和/或引物對(duì)2;
[0041 ] 所述引物對(duì)1由序列2所示的單鏈DNA和序列3所示的單鏈DNA組成；
[0042] 所述引物對(duì)2由序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA組成。
[0043] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明：BRAF基因突變?yōu)锳CTH型垂體腺瘤所特有，其他類(lèi)型的垂體腺 瘤中未見(jiàn)該基因突變，可作為ACTH型垂體腺瘤一個(gè)特異性的分子病理診斷標(biāo)記物。根據(jù) BRAF基因是否突變可進(jìn)一步將ACTH垂體腺瘤分為兩種亞型，即BRAF突變型(BRAF基因突變） 和野生型(BRAF基因未突變），前者平均體積偏小，侵襲度小，午夜血清皮質(zhì)醇濃度小于或等 于22ug/dl;后組平均體積偏大，侵襲度大，午夜血清皮質(zhì)醇濃度大于22ug/dl。因此可W通 過(guò)檢測(cè)BRAF基因是否突變判斷ACTH垂體腺瘤的不同亞型，從而及時(shí)采取不同的臨床治療策 略。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 實(shí)施例UBRAF基因是否突變?cè)谳o助鑒定ACTH型垂體腺瘤亞型中的應(yīng)用
[0047] 對(duì)9例ACTH型垂體腺瘤的腫瘤與自身血樣本DNA進(jìn)行全外顯子測(cè)序?qū)Ρ确治?測(cè)序 儀為Illumina化seq 2500)，結(jié)果在2例腫瘤中出現(xiàn)BRAF基因突變，腫瘤體積小，另外7例腫 瘤中的服AF基因?yàn)橐吧?，腫瘤體積大；因此將ACTH垂體腺瘤分為兩種亞型:ACTH垂體腺瘤 野生型和ACTH垂體腺瘤突變型。
[004引將9例樣本經(jīng)Sanger驗(yàn)證排除假陽(yáng)性后，在另外149例ACTH型垂體腺瘤（來(lái)源于復(fù) 旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，患者均知情同意）中進(jìn)行BRAF基因基因型檢測(cè)，共149例樣本的檢測(cè) 方法具體如下：
[0049] 首先根據(jù)BRAF基因（核巧酸序列為序列表中序列1)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增其的引物對(duì)，共2 對(duì)引物對(duì)，每對(duì)引物對(duì)均能擴(kuò)增BRAF基因部分片段(其中引物對(duì)1的擴(kuò)增產(chǎn)物為序列表中序 列1的第19200-19609位；引物對(duì)2的擴(kuò)增產(chǎn)物為序列表中序列1的第19221-19444位），引物 對(duì)具體序列如下：
[0050] 引物對(duì)l:lPrimer 化rward:5'-AGTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3'（序列2);lPrimer Reverse: 5 ' -ACACATTTCAAGCCCCAAAA-3 '（序列3);
[0051] 引物對(duì)2:2Primer Forward:5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'（序列