對應的前前體pri-miR156f序列（長度為38化P)。將擴增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156f并送華大 基因生物公司進行測序分析，測序結(jié)果中的序列與0sMIR156f中包含的對應pre-miR156f片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.6所示。
[0026] 03]\〇1?156邑基因：利用引物對（5'-66圳64〔464464646了646(：-3'（569 10齡.25)和 5 '-GAGATGGATGGACGGATGGAC-3 '（ SEQ ID No. 26))，從水稻基因組DNA中克隆OsmiRl56家族 中的0sMIR156g對應的前前體pri-miR156g序列（長度為189bp)。將擴增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156g并送華大 基因生物公司進行測序分析。測序結(jié)果中的序列與0sMIR156g中包含的對應pre-miR156g片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.7所示。
[0027] 03]\〇1?15化基因：利用引物對（5'-(：1'了6了〇：1'〔661'〔464646(：-3'（569 10齡.27)和 5'-TCTCTCGCTCCTATGTGGCT-3'（沈Q ID 齡.28))，從水稻基因組0臟中克隆〇311111?156家族中 的0SMIR15加對應的前前體pri-miR15化序列（長度為496bp)。將擴增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156h并送華大 基因生物公司進行測序分析。測序結(jié)果中的序列與0sMIR156h中包含的對應pre-miR15化片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.8所示。
[0028] 03]\〇1?1561基因：利用引物對（5'-4了64了44646〔4〔〇：664〔6-3'（569 10齡.29)和 5'-CATCTCAAAGCGGTGTTCGC-3'（SEQ ID 齡.30))，從水稻基因組0臟中克隆〇311111?156家族中 的0sMIR156i對應的前前體pri-miR156i序列（長度為356bp)。將擴增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156i并送華大 基因生物公司進行測序分析。測序結(jié)果中的序列與0sMIR156i中包含的對應pre-miR156i片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.9所示。
[00 巧]03]\〇尺156占.基因：利用引物對（5'-〔66464了6464641'〔64〔6(：-3'（569 10齡.31)和 5 '-ACCGGATCCGAGAAGCAAAG-3 '（沈Q ID No. 32))，從水稻基因組DNA中克隆OsmiRl56家族中 的0sMIR156j對應的前前體pri-miR156j序列（長度為29化P)。將擴增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156j并送華大 基因生物公司進行測序分析。測序結(jié)果中的序列與0sMIR156j中包含的對應pre-miR156j片 段完全一致，其序列如SEQ ID No. 10所示。
[0030] 08]\〇尺15化基因：利用引物對（5'-〔6464了664〔66〔44了64〔4-3'（569 10齡.33)和 5'-TGCATCGTGAGTCTAGTCTGT-3'（SEQ ID 齡.34))，從水稻基因組0臟中克隆〇311111?156家族 中的0sMIR156k對應的前前體pri-miR15化序列（長度為257bp)。將擴增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156k，并送華大 基因生物公司進行測序分析。測序結(jié)果中的序列與0sMIR156k中包含的對應pre-miR15化片 段完全一致，其序列如SEQ ID No. 11所示。
[0031] 03]\〇尺1561基因：利用引物對（5'-4〔4444646(：了466646〇：6-3'（569 10齡.35)和 5'-TTCGCCACTGATGTGAACCA-3'（沈Q ID 齡.36))，從水稻基因組0臟中克隆〇311111?156家族中 的0SMIR1561對應的前前體pri-miR1561序列（長度為63化P)。將擴增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-0SMIR1561，并送華大 基因生物公司進行測序分析。測序結(jié)果中的序列與0SMIR1561中包含的對應pre-miR1561片 段完全一致，其序列如SEQ ID No. 12所示。
[0032] 實施例2組織器官特異表達啟動子序列克隆
[0033] 莖桿特異表達型啟動子選優(yōu)采用0sGA3ox2基因的啟動子。將0sGA3ox2基因的長約 2.化b的啟動子（簡稱D18啟動子），其中D18啟動子序列相關(guān)信息參考文獻報道（Sakamoto T,Morinaka Υ,Ishiyama K,Kobayashi M,Itoh H,Kayano T,Iwahori S,MatsToka M, Tanaka H.Genetic manipulation of gibberel1 in metabolism in transgenic rice.Nat Biotechnology. 2003，21:909-913)。利用該參考文獻中記載的PCR方法獲得片段 后連接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體pBS-D18p，送 華大基因生物公司進行測序分析，測序結(jié)果顯示與已知序列完全一致，采用化ndm/Ba^l I 酶切地S-D18p質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物，獲得D18p啟動子。
[0034] 實施例3構(gòu)建12個莖桿特異表達載體pWM-D18p-〇sMIR156a~1(簡稱為DlSPro-0sMIR156a~1)
[0035] 分別采用Hind虹/sal I酶切載體pWMlOUBamH I/sal I酶切中間載體pBS-0sMIR156a~1后，將所需酶切片段產(chǎn)物分別回收，并利用T41igase與D18p啟動子進行Ξ片 段連接，連接體系為:Hind虹/sal I酶切載體pWMlOl產(chǎn)物1.化1、化nd虹/BamH I酶切pBS-D18p質(zhì)粒l.OyUBamH I/sal I酶切中間載體pBS-〇sMIR156a~1 1.5yl、5XT41igase Buffer Ι.ΟμΙ及T41igase 0.化1，將上述反應連接體系置于16°C保持30min或置于4°C過 夜。然后采用常規(guī)的分子試驗方法轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物于感受態(tài)大腸桿菌的菌株，并利用Kan+抗 性篩選，獲得12個不同載體pWM-Dl 8p-〇sMIRl 56a~1。
[0036] 實施例4莖桿特異表達載體pWM-D18p-〇sMIR156a~1的轉(zhuǎn)化
[0037] 1.水稻成熟胚愈傷組織的誘導:將水稻稻谷（日本晴或中花11)人工去穎殼后依次 用3%的次氯酸鋼與70%的酒精消毒后，置于含2.0mg/L 2,4-D的N6固體培養(yǎng)基上，誘導10 ~14天W獲得胚性愈傷組織。
[0038] 2.含轉(zhuǎn)化載體菌液的培養(yǎng)與制備:將前面獲得的12個pWM-D18p-〇sMIR156a~1載 體中的任意一個或多個表達載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中，然后從含有卡那霉素和 利福平的固體篩選培養(yǎng)基上挑選單菌落放入相同抗生素的Y邸液體培養(yǎng)基中，28°C、200~ 250巧m/min過夜培養(yǎng)至0D600值約為0.8,4000~5000巧m/min離屯、后棄上清，用AB液體培養(yǎng) 基重懸沉淀。
[0039] 3.將誘導的胚性愈傷組織用解剖刀從外植體上剝離后，用制備好的含轉(zhuǎn)化載體的 菌液侵染胚性愈傷組織10~30min，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌濾紙上吸干水分，轉(zhuǎn)入含100μΜ 的乙酷下香酬的Ν6培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天。
[0040] 4.用無菌水將愈傷組織清洗干凈后轉(zhuǎn)入含有25~50mg/L潮霉素與200~400mg/L 簇變青霉素鋼的N6固體培養(yǎng)基上篩選1~3周，將得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基(含 有25~50mg/L潮霉素與200~400mg/L簇變青霉素鋼的N6固體培養(yǎng)基）中繼續(xù)篩選2~3周， 再將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基進行分化、生根培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化植株(Τι代轉(zhuǎn)化植株），將其 移栽盆鉢中按常規(guī)技術(shù)進行水稻栽培管理。
[0041 ] 實施例5功能驗證
[0042] 將盆鉢栽培的Τι代轉(zhuǎn)化植株按單株取水稻葉片，采用CTAB法提取DNA樣品，利用所 攜帶的潮霉素抗性基因序列對應的引物
[0043] 5'-4〔66了61^6了〇：41^4〔461'176〇：-3'（沈9 10齡.37)與
[0044] 5 ' -TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA-3 '（沈Q ID No. 38)進行PCR檢測分析，能夠檢測 到陽性條帶的即為Τι代轉(zhuǎn)基因株系，按單株收集種子進行后續(xù)試驗。
[0045] 分別將轉(zhuǎn)基因株系材料(D18p-〇sMIR156a~1)及野生型對照材料(wild-type)在 盆鉢中進行單本種植，分別比較頭季稻成熟期時水稻基部分葉芽生長性狀，再生稻稻穗長 短、千粒重等產(chǎn)量相關(guān)性狀，在本實施例中W轉(zhuǎn)化pWM-D18p-〇sMIR156f載體為例，結(jié)合參見 圖1和圖2及下表1。從轉(zhuǎn)基因材料中挑選出再生稻稻穗長度長、產(chǎn)量優(yōu)于野生型再生稻的轉(zhuǎn) 基因株系材料。
[0046] 表1組織器官特異啟動子驅(qū)動0sMIR156f轉(zhuǎn)化水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的變化特性
[0047]
[004引
[0049]注:表中數(shù)據(jù)均為4-10個不同株系的均值±誤差。
[0化0]由上可知，利用特異啟動子過表達0smiR156轉(zhuǎn)基因植株，與野生型相比較，在組織 器官特異表達D18pr〇-0sMIR156f的轉(zhuǎn)基因株系能夠在頭季稻成熟期就形成分葉，而運些提 前長出的分葉對頭季稻千粒重等性狀沒有明顯影響，但可提高再生稻的株高和稻穗長度、 增加巧粒充實度，進而提高再生稻產(chǎn)量。
【主權(quán)項】
1. 一種提前產(chǎn)生再生稻分蘗進而提高再生稻產(chǎn)量的方法，其特征在于，該方法是將至 少一個重組表達載體導入水稻中，使其于水稻莖桿中表達； 其中，上述重組表達載體為含有水稻莖桿特異表達啟動子及其驅(qū)動的如序列表中SEQ ID No.l或SEQ ID Νο·2或SEQ ID Νο·3或SEQ ID Νο·4或SEQ ID Νο·5或SEQ ID Νο·6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所 示的0sMIR156a~1基因片段的載體。2. 如權(quán)利要求1所述的一種提前產(chǎn)生再生稻分蘗進而提高再生稻產(chǎn)量的方法，其特征 在于，所述水稻莖桿特異表達啟動子為D18p啟動子。3. 權(quán)利要求1或2所述方法在水稻提前產(chǎn)生再生稻分蘗中的應用。
【專利摘要】一種提前產(chǎn)生再生稻分蘗進而提高再生稻產(chǎn)量的方法，該方法是利用水稻莖桿特異表達啟動子，將能夠影響水稻分蘗發(fā)育的核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？No.1～SEQ？ID？No.12所示的OsMIR156a～l基因序列在水稻莖桿中特異表達。實施該技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株的效果表明，利用特異啟動子過表達OsmiR156轉(zhuǎn)基因植株，與野生型相比較，在組織器官特異表達D18pro-OsMIR156的轉(zhuǎn)基因株系能夠在頭季稻成熟期就形成分蘗，而這些提前長出的分蘗對頭季稻千粒重等產(chǎn)量相關(guān)性狀沒有明顯影響，但可提高再生稻的株高和稻穗長度、增加籽粒充實度，進而提高再生稻產(chǎn)量。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82
【公開號】CN105505986
【申請?zhí)枴緾N201610029401
【發(fā)明人】劉清, 王若仲, 肖浪濤
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月15日