一種提前產(chǎn)生再生稻分蘗進(jìn)而提高再生稻產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種提前產(chǎn)生再生稻分葉W提高再生稻 產(chǎn)量的方法，更具體地是利用特異啟動(dòng)子將〇smiR156家族基因在莖桿中特異表達(dá)W提前產(chǎn) 生再生稻分葉進(jìn)而提高再生稻產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)初W來(lái)，我國(guó)的再生稻生產(chǎn)進(jìn)入了快速發(fā)展時(shí)期，先后經(jīng)歷了高桿再生 稻組合利用、矮桿再生稻組合利用、雜交稻的再生利用等發(fā)展階段，目前我國(guó)再生稻的應(yīng)用 與研究進(jìn)展很快，先后獲得了一批米質(zhì)好、再生力強(qiáng)的新品種(組合），如培64/E32、培兩優(yōu) 50、Π 優(yōu)1273、Π 優(yōu)航2號(hào)等。
[0003] 水稻分葉的形成過(guò)程可分為兩個(gè)主要步驟，即分葉芽的形成和分葉芽的伸長(zhǎng)。分 葉芽的伸出時(shí)間對(duì)稻穗長(zhǎng)度及巧粒充實(shí)度等具有重要影響。水稻生產(chǎn)中只有主莖和早期發(fā) 生的初生和次生分葉才具備成穗能力，它們屬于有效分葉;而后期的次生分葉因生育期短 等因素造成不能成穗，它們屬于無(wú)效分葉。無(wú)效分葉不僅不能形成稻穗，而且過(guò)多的無(wú)效分 葉還會(huì)影響有效分葉稻穗的長(zhǎng)度而導(dǎo)致水稻產(chǎn)量減低等問(wèn)題。再生稻的稻穗是由第一季 (頭季)水稻形成的蔽芽發(fā)育而成，在頭季水稻收割之后，一些蔽芽在原有根系的基礎(chǔ)上再 次生長(zhǎng)、抽穗直至成熟。因此運(yùn)些蔽芽伸出的時(shí)間對(duì)再生稻穗長(zhǎng)及產(chǎn)量具有重要影響。
[0004] 由于再生稻分葉能力大小、有效穗的形成等對(duì)產(chǎn)量具有決定性的影響。因此，國(guó)內(nèi) 外對(duì)再生稻的研究多集中于品種的選育、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培管理技術(shù)等方面。羅文質(zhì)等研究了 1500多個(gè)水稻品種(組合）的再生力，為再生稻品種的選育提供了重要參考。雖然再生稻生 產(chǎn)技術(shù)取得了 一些重要進(jìn)展，但目前還存在產(chǎn)量相對(duì)較低、充實(shí)程度差等問(wèn)題。
[0005] 現(xiàn)有再生稻生產(chǎn)完全依賴于水稻的再生特性:在頭季稻收割后由留在稻粧上的休 眠芽萌發(fā)生長(zhǎng)成穗而收割下一季水稻，因此再生芽的萌發(fā)與成穗率的高低直接影響再生稻 的產(chǎn)量。目前推廣的再生稻品種一般存在再生芽的萌發(fā)率低(分葉力差）、萌發(fā)時(shí)間遲、再生 稻穗偏短等缺陷。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用水稻分葉相關(guān)基因來(lái) 調(diào)控分葉發(fā)育為水稻生產(chǎn)開(kāi)辟了一個(gè)全新的途徑，并取得了一些重要進(jìn)展。目前可利用轉(zhuǎn) 基因方法將一些優(yōu)質(zhì)基因?qū)胨網(wǎng)調(diào)控水稻分葉發(fā)育而增加稻穗的長(zhǎng)度、千粒重等，進(jìn) 而增加水稻產(chǎn)量。但由于通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的多分葉轉(zhuǎn)基因水稻材料的分葉數(shù)目常常太 多而對(duì)水稻頭季水稻產(chǎn)量不利，因此，即使能夠增加水稻的分葉力或再生稻的稻穗數(shù)等，在 生產(chǎn)實(shí)際中缺乏應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 迄今為止，通過(guò)傳統(tǒng)育種手段選育的具有多分葉特性的水稻品種(材料)增產(chǎn)效果 不理想。即使獲得多再生稻穗的品種，但由于生育期較短導(dǎo)致光合作用時(shí)間少，稻穗的長(zhǎng)度 及巧粒充實(shí)度等問(wèn)題而導(dǎo)致增產(chǎn)效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 再生稻的稻穗是由葉蔽中的分葉芽生長(zhǎng)發(fā)育而來(lái)，因此讓運(yùn)些葉蔽中的分葉芽適 當(dāng)提前生長(zhǎng)出來(lái)有利于延長(zhǎng)生育期、增加光合作用進(jìn)而提高再生稻產(chǎn)量。目前已知miR156 家族成員基因可影響水稻分葉發(fā)育過(guò)程中的葉芽發(fā)生及葉芽伸出兩過(guò)程。本發(fā)明利用 miR156家族基因能夠影響水稻發(fā)育過(guò)程的功能，采用組織器官特異啟動(dòng)子構(gòu)建載體，使得 轉(zhuǎn)基因水稻葉蔽芽中的分葉芽在頭季稻成熟期時(shí)從葉蔽中生長(zhǎng)、萌發(fā)形成新的分葉，運(yùn)些 早期萌發(fā)的分葉相對(duì)于那些等頭季稻收割后再萌發(fā)的分葉芽具有更長(zhǎng)的生育期、更多的較 長(zhǎng)稻穗，更好的巧粒充實(shí)度等性狀，運(yùn)樣就可W提高再生稻產(chǎn)量，進(jìn)而達(dá)到增產(chǎn)目的。
[0008] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種提前產(chǎn)生再生稻分葉進(jìn)而提高再生稻產(chǎn)量的方 法，是通過(guò)將對(duì)水稻發(fā)育具有重要調(diào)控作用的miR156家族的12個(gè)成員0smiR156a~1中的任 何一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胨網(wǎng)調(diào)控水稻的分葉發(fā)育進(jìn)程。
[0009] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種提前產(chǎn)生再生稻分葉進(jìn)而提高 再生稻產(chǎn)量的方法，該方法是將至少一個(gè)重組表達(dá)載體導(dǎo)入水稻中，使其于水稻莖桿中表 達(dá);其中，上述重組表達(dá)載體為含有水稻莖桿特異表達(dá)啟動(dòng)子及其驅(qū)動(dòng)的如序列表中SEQ ID No. 1 或沈Q ID No.2或沈Q ID No.3或沈Q ID No.4或沈Q ID No.5或沈Q ID No.6或沈Q ID No.7或沈Q ID No.8或沈Q ID No.9或沈Q ID No. 10或沈Q ID No. 11 或沈Q ID No. 12所 示的核屯、序列(0sMIR156a~1基因片段序列）的載體。
[0010] 上述水稻莖桿特異表達(dá)啟動(dòng)子是驅(qū)動(dòng)核屯、序列如序列表中SEQ ID No. 1或SEQ ID No.2或沈Q ID No.3或沈Q ID No.4或沈Q ID No.5或沈Q ID No.6或沈Q ID No.7或沈Q ID No.8或沈Q ID No.9或沈Q ID No. 10或沈Q ID No. 11或SEQ ID No. 12所示的啟動(dòng)子。該水 稻莖桿特異表達(dá)啟動(dòng)子為D18p啟動(dòng)子。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)上述方法在水稻提前產(chǎn)生再生稻分葉中的應(yīng)用。
[0012] 與傳統(tǒng)的再生稻品種一般是等頭季稻收割后葉蔽中的分葉芽再萌發(fā)形成再生稻 分葉的步驟不同，本發(fā)明利用特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)0smiR156a~1的載體的構(gòu)建及水稻愈傷組織 的外源基因?qū)氲燃夹g(shù)，通過(guò)組織器官特異啟動(dòng)子將能夠影響水稻分葉發(fā)育的0sMIR156a ~1基因序列在水稻的莖桿中特異表達(dá)。實(shí)施該技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因植株的效果表明，利用特 異啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)0smiR156轉(zhuǎn)基因植株，與野生型相比較，在組織器官特異表達(dá)DlSpro-0SMIR156的轉(zhuǎn)基因株系能夠在頭季稻成熟期就形成分葉，而運(yùn)些提前長(zhǎng)出的分葉對(duì)頭季稻 千粒重等與產(chǎn)量密切相關(guān)性狀沒(méi)有明顯影響，但可提高再生稻的株高和稻穗長(zhǎng)度、增加巧 粒充實(shí)度，進(jìn)而提高再生稻產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是組織器官特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)0sMIR156f轉(zhuǎn)化水稻表型，能提前形成再生稻分 葉。
[0014] 圖中，1:野生型水稻;2:組織器官特異表達(dá)0sMIR156f基因植株頭季稻成熟期形成 再生稻分葉。
[0015] 圖2是組織器官特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)0sMIR156f轉(zhuǎn)化水稻后對(duì)再生稻農(nóng)藝性狀的影響。
[0016] 圖中，1:野生型水稻;2:組織器官特異表達(dá)OsMIRl 56f基因水稻。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1 0sMIR156a~1共12個(gè)不同水稻基因的克隆
[001引利用在線Primer-BLAST軟件針對(duì)12個(gè)不同OsMIR15貼~1基因分別進(jìn)行上下游引 物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)時(shí)的主要設(shè)定或修改參數(shù)包括:PCR product size為150-1000bp;P;rimer melting temperatures (Tm)為55-65°C ; Organism設(shè)定為Oryza sativa( japonica cultivar-group)(taxid:39947);Database選擇為Refseq representative genomes，其余 參數(shù)均為系統(tǒng)默認(rèn)缺省值。引物設(shè)定后送華大基因或武漢金開(kāi)瑞生物公司進(jìn)行引物合成。
[0019] 采用CTAB法從日本晴、中花11或其他水稻材料中提取DNA，分別W上述方法設(shè)計(jì)的 不同0sMIR156a~1基因?qū)?yīng)的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR反應(yīng)體系為50化:DNA模板 1. OyL、正向引物1. OyL、反向引物1.0化、1 ΟμL?ο 1 · L-1的dNTP 1.0化、10X緩沖液5. OyL、P化 Taq酶0.扣L及雙蒸水40.5化。擴(kuò)增條件為:94°C3min; 94°C30s，58°C (該溫度需參考不同引 物序列進(jìn)行設(shè)定）308,72°(31111111，35個(gè)循環(huán);72°(3延伸5111111。將擴(kuò)增的？〇?產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠 電泳后，切下含目標(biāo)片段的凝膠利用試劑盒回收產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物利用T41igase酶連接到 由EcoR V酶切后的pBluesc;riptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體。不同基因克隆的主要 差異為PCR對(duì)應(yīng)的引物和片段序列，分別如下：
[0020] 03]\〇尺156曰基因：利用引物對(duì)（5'-461^46644刊4〔644666了61'-3'（569 10齡.13)和 5'-ACAAGCTAGACCCCTCAAATGT-3'（SEQ ID No. 14))，從水稻基因組DNA中克隆包含0smiR156 家族中的0sMIR156a對(duì)應(yīng)的前前體pri-miR156a序列（長(zhǎng)度為320bp)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接 到由EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156a，并送 華大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果中的序列與OsMIRl56a中包含的對(duì)應(yīng)pre-miR156a的片段完全一致，其序列如SEQ ID No.l所示。
[0021] 03]\〇1?1566基因：利用引物對(duì)（5'-了〇：66〇：1^41'1'1'(：176〔4了4-3'（569 10齡.15)和 5'-GGAGATGATATTGGCAGGCTCA-3'（沈Q ID No. 16))，從水稻基因組DNA中克隆0smiR156家族 中的0sMIR156b對(duì)應(yīng)的前前體pri-miR15化序列（長(zhǎng)度為39化P)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156b，并送華大 基因生物公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果中的序列與0sMIR156b中包含的對(duì)應(yīng)pre-miR156b片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.2所示。
[0022] 03]\〇1?156?；颍豪靡飳?duì)（5'-了4664664464646666了646-3'（569 10齡.17)和 5 '-CAAGCATGTATGTGGTTGTGGTT-3 '（沈Q ID No. 18))，從水稻基因組DNA中克隆OsmiRl56家 族中的0sMIR156c對(duì)應(yīng)的前前體pri-miR156c序列（長(zhǎng)度為313bp)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接到 由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體pBS-〇sMIR156c并送華 大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果中的序列與0sMIR156c中包含的對(duì)應(yīng)pre-miR156c 片段完全一致，其序列如SEQ ID No.3所示。
[0023] 03]\〇1?156(1基因：利用引物對(duì)巧'-4〇：664了〇：4464464444〇：1'-3'（569 10齡.19)和 5 '-ACCAAGCATAAGGGGTGGTTT-3 '（沈Q ID No. 20))，從水稻基因組DM中克隆OsmiRl56家族 中的0sMIR156d對(duì)應(yīng)的前前體pri-miR156d序列（長(zhǎng)度為43化P)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156d，并送華大 基因生物公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果中的序列與0sMIR156d中包含的對(duì)應(yīng)pre-miR156d片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.4所示。
[0024] 03]\〇1?1566基因：利用引物對(duì)（5'-1'1'1'〔4^6了66666了6了646-3'（569 10齡.21)和 5 '-GCCTAGAGACTCGGAACAGC-3 '（ SEQ ID No. 22))，從水稻基因組DNA中克隆OsmiR156家族中 的OsMIR156e對(duì)應(yīng)的前前體pri-miR156e序列（長(zhǎng)度319bp)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(地S)載體片段上得到中間載體地S-〇sMIR156e并送華大基因生 物公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果中的序列與0sMIR156e中包含的對(duì)應(yīng)pre-miR156e片段完全 一致，其序列如SEQ ID No.5所示。
[00 巧]0sMIR156f基因：利用引物對(duì)（5'-CGCCCACCTTTCTTCTCCCA-3'（SEQIDNo.23)和 5'-AAGGAGCAGTTAGATAATGGAG-3'（沈Q ID No.24))，從水稻基因組DNA中克隆0smiR156家族 中的0sMIR156f