具有增加微量元素含量的轉(zhuǎn)基因植物及其生產(chǎn)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有增加微量元素含量的轉(zhuǎn)基因植物及其生產(chǎn)方法。
【背景技術】
[0002] 微量元素營養(yǎng)，如鐵(Fe)、鋅(Zn)和錳(Μη)的缺乏，是一個普遍問題。已經(jīng)有若干 策略被用來解決這個問題，其中之一是遺傳修飾植物，其中所述微量營養(yǎng)元素增加。以這樣 的方式，攝食這些植物的受試者中的微量元素可得以改善。
[0003] 盡管鐵(Fe)是地球上最豐富的元素之一，鐵缺乏癥是最普遍的人類群體的營養(yǎng)障 礙。膳食鐵的攝入量不足(特別是在鐵供應主要或完全依賴于植物的地區(qū)）所造成的缺鐵性 貧血（IDA)影響全球超過十億人。通過施加鐵肥料增加在土壤中生物可利用鐵的水平是昂 貴的且不可持續(xù)的，并且不能針對所需植物部分。因此，提高鐵的獲取以及將其運輸至可食 用植物部分是戰(zhàn)勝IDA所必須的。
[0004] 植物演化了多方面的策略以從土壤中獲取鐵（1)。禾本科物種（Graminaceous species)在從麥根酸(mugineic acid)家族分泌通過T0M1以高親和性結(jié)合鐵的植物鐵載體 (phytosiderophores(PS))之后攝取鐵，隨后通過YSL轉(zhuǎn)運子攝取(三價鐵)Fe-PS復合物。擬 南芥(Arabidopsis)和所有非草作物物種采用基于還原鐵的獲取策略，其中鐵首先由氧化 還原酶AtFR02進行還原。亞鐵隨后由AtIRTI跨質(zhì)膜輸送（1，2)。這兩個鐵獲取策略過去被認 為是相互排斥的(4)。但是，水稻(Oryza sativa)具有一個Fe2+的攝取系統(tǒng)(5)以及擬南芥分 泌鐵結(jié)合香豆素類似草類的PS-系統(tǒng)（6-8)，這表明這兩個鐵獲取策略可以包括共同的組 份。
[0005] 在擬南芥中，bHLH型轉(zhuǎn)錄因子AtPYE和AtFIT控制參與鐵獲取和細胞內(nèi)穩(wěn)定的基因 的非重疊亞組OhAtFIT作為異源二聚體與lb亞組的bHLH轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH038，AtbHLH039、 八七1^1^100和厶七詘1^101發(fā)揮作用（10，11)。在水稻（0巧23 83^￥3)0811?02中4讓乩!1100/ 101的直系同源物調(diào)節(jié)所述的Fe-PS轉(zhuǎn)運子0sYSL15,但不經(jīng)由OsIRTl吸收Fe2+(12)。編碼 AtbHLH038/39/100/101和0sIR02的基因是鐵響應的，提示為上游調(diào)控組件。與動物中相似， 在植物中感知鐵通過鐵與調(diào)節(jié)蛋白的直接結(jié)合發(fā)生，在水稻中為OsIDEFl/OsHRZs以及擬南 芥中為在 AtBTS(13，14)。
[0006] 有必要來產(chǎn)生具有增加微量元素含量的轉(zhuǎn)基因植物，由此可以解決微量元素缺乏 的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 我們在此報告了一個新的肽家族，其在整個被子植物中許多高度多樣化的肽種共 享保守的短C末端氨基酸序列基序。我們叫這種肽序列IRON MAN(MA)，指的是其通過激活 鐵攝取的基因而啟動鐵和錳積累的能力。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，IMA對于在植物中的鐵缺乏信號 傳遞是至關重要的，其作用在控制攝取、轉(zhuǎn)運和鐵的細胞穩(wěn)態(tài)級聯(lián)的早期，過表達IMA肽的 植物顯示一個或多個的微量元素，如鐵、鋅和/或錳水平的增加，這提高對動物的營養(yǎng)價值， 特別是在克服微量元素不足的問題上。還發(fā)現(xiàn)c-末端基序?qū)MA肽的功能是至關重要的，因 為重組IMA肽的C-末端基序刪除可以使功能完全消失。操縱頂A肽的表達代表了一種新的用 于作物中的鐵生物強化策略。
[0008] 具體地，在第一方面，本發(fā)明提供使用重組多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組 多核苷酸包含可操作連接至表達控制序列的編碼鐵調(diào)節(jié)多肽（即，如本文所用的MA肽）的 核苷酸序列，
[0009] 其中鐵調(diào)節(jié)多肽包括C末端基序，所述C末端基序從N末端至C末端含有：
[0010] ⑶DDD(SEQ ID N0:1)的第一結(jié)構域，以及
[0011] DXAPAA(SEQIDN0:2)的第二結(jié)構域，
[0012] 其中第一結(jié)構域和所述第二結(jié)構域通過10個或更少氨基酸殘基的肽間隔連接，
[0013] 其中，鐵調(diào)節(jié)多肽包括長度總計20至100的氨基酸殘基。
[0014] 在一些實施方案中，鐵調(diào)節(jié)多肽提高植物中三價鐵還原活性或能激活植物中用于 鐵穩(wěn)態(tài)的一個或多個轉(zhuǎn)錄因子，其選自AtbHLH38、AtbHLH39、AtFIT以及其任何組合。
[0015] 在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物過表達鐵調(diào)節(jié)多肽，且其微量元素含量高于對照 植物，其中微量元素選自鐵(Fe)、鋅(Zn)和錳(Μη)。
[0016] 在一些實施方案中，所述鐵調(diào)節(jié)多肽包括長度總計20至90、25至85、或45至75的氨 基酸殘基。
[0017] 在一些實施方案中，在所述鐵調(diào)節(jié)多肽的第一結(jié)構域和第二結(jié)構域之間的肽間隔 具有總計1至6個或1至3個任意的氨基酸殘基。
[0018] 在一些實施方案中，所述C末端基序含有氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID 恥：3、4、5、6、7、8、9和10。
[0019] 在一些實施方案中，所述鐵調(diào)節(jié)多肽含有氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID N0:25、26、27、63、65、74、75、98和99。
[0020] 在第二方面，本發(fā)明提供如本文所述的轉(zhuǎn)基因植物的植物組織或部分或植物細 胞。
[0021] 在第三方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括(a)用含有編碼本文 所述鐵調(diào)節(jié)多肽的核苷酸序列的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細胞，以及(b)使在(a)中獲得的重 組植物細胞生長以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
[0022] 在第四方面，本發(fā)明提供了用于生物強化的方法，其包括在表達鐵調(diào)節(jié)多肽、足以 使轉(zhuǎn)基因植物中微量元素含量增加的條件下使本文所述的轉(zhuǎn)基因植物或其種子或其它繁 殖材料生長，其中所述微量元素選自鐵(Fe)、鋅(Zn)和錳(Μη)。
[0023] 在第五方面，本發(fā)明提供由本文所述的轉(zhuǎn)基因植物、或其植物組織、植物部分或植 物細胞所制得的植物產(chǎn)品。本發(fā)明還提供含有所述植物產(chǎn)品的組合物，其可以是營養(yǎng)補充 劑或藥物組合物，其用于在有此需要的受試者中補充微量元素。
[0024] 在第六方面，本發(fā)明提供了在受試者中補充微量元素的方法，其包括施用有效量 的如本文所述的轉(zhuǎn)基因植物、由其制得的植物產(chǎn)品或含有此植物產(chǎn)品的組合物組合物。
[0025] 在一些實施方案中，本發(fā)明的方法有效地治療由微量元素缺乏所導致的癥狀或疾 病，包括缺鐵、缺鋅或缺錳。在一些特定的實施例中，微量元素缺乏是缺鐵，其導致貧血。 [0026]本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)詳見下文說明。從下文的若干實施方案的詳 述及從所附的權利要求中本發(fā)明的其它特征或優(yōu)點將將是顯而易見的。
【附圖說明】
[0027] 前面的概述以及本發(fā)明的以下詳細描述在結(jié)合附圖一起閱讀時將更好理解。為了 說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示的實施方案是目前優(yōu)選的。然而，應該理解的是，本發(fā)明 并不限于所示的精確安排和設備。
[0028] 在附圖中
[0029] 圖1A至圖1B:顯示鑒定G-D-D-D-D-間隔-D-x-A-P-A-A序列基序。圖1A使用MEME組 件(24)鑒定的基序的序列標識。圖1B圖表顯不序列基序的位置。
[0030] 圖2A至圖2G顯示G-D-D-D-D-間隔-D-x-A-P-A-A基序?qū)τ陧擜肽的功能是至關重要 的。圖2A在35Spr 〇::MAlcDNA系中鐵的積累。AtMAl異位表達導致葉青銅化(左圖）。皮爾斯 染色顯示與野生型相比的高鐵濃度，特別是在葉脈中（中左）、根中柱（中右）、以及在胚芽中 (右圖）。圖2B在攜帶35Spr 〇: :MAlcDNA構建體的轉(zhuǎn)基因植物中的過渡金屬濃度，擬南芥葉 (左)和種子(右）。圖2C胚芽的三價鐵還原活性。在三個獨立實驗中使用3批次30個胚芽來確 定還原活性。誤差棒表示平均值的標準誤差。圖2D具有MA基序的肽的氨基酸序列比對，所 述IMA基序由擬南芥（16，18)、西紅柿（命名為3111^1 ;19)，水稻根/葉（命名為〇8頂六1和 Os頂A2;15)和大豆(命名為Gm頂Al-5;20)的鐵響應基因所編碼。圖2E IMA1的活性結(jié)構域分 析。組成型表達AtIMAl或At頂A3編碼序列（35Spro: :IMA1QRf)或嵌合AtIMAl基因的轉(zhuǎn)基因植 物的三價鐵還原活性，所述嵌合AUMA1基因在可變區(qū)具有刪除（35Spr 〇::頂A1QRFA 1以及 35Spro::頂A1〇rfA2)或者在肽的保守C末端中具有刪除（35Spro::頂A1〇rfA3)。圖2F擬南芥 頂A1和頂A3的氨基酸序列比對。圖2G擬南芥MA1、嵌合頂Α1 Δ 1、頂Α1 Δ 2和頂Α1 Δ 3的氨基 酸序列的比對，在過表達IMA1qrf、IMA3qrf以及具有刪除的嵌合IMA1中的IMA1表達水平。
[0031 ] 圖3A至圖3E顯示AUMA1表達模式的表征、亞細胞定位、以及過表達AUMA1在鐵穩(wěn) 態(tài)基因上的效果。圖3A在不同植物部分相對At頂A1轉(zhuǎn)錄物豐度。圖3B在響應磷和鐵缺乏時 的AtIMAl的表達改變。圖3C通過在擬南芥原生質(zhì)體中表達35Spro: :IMA1:YFP構建體來確定 At頂A1的細胞內(nèi)定位。證實YFP信號在核中和在細胞質(zhì)中。圖3D使用ATH1基因芯片通過微陣 列分析確定AtIMAl過表達對轉(zhuǎn)錄物譜的作用。圖3E數(shù)字指超過1.5倍誘導的基因，P〈0.05。 [0032] 圖4A至圖4B顯示在西紅柿植物中異源表達At頂A1的效果。圖4A果實中的過渡金屬 濃度。圖4B野生型（上）和35Spro::頂AIorf植物（下）的莖橫截面的皮爾斯染色。誤差棒表示 均值的標準誤。
【具體實施方式】
[0033]除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬的技術領域中本領 域技術人員通常所理解的具有相同含義。
[0034] 如本文所使用的，單數(shù)形式"一"、"一個"和"所述"包括復數(shù)對象，除非上下文另有 明確說明。因此，例如，提及"一個組份"包括多個這樣的組份和本領域技術人員已知的等同 物。
[0035] 術語"多核苷酸"或"核酸"是指核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在 的核酸，例如脫氧核糖核酸（"DNA"）和核糖核酸（"RNA"），以及多核苷酸還包括具有非天然 存在的核苷酸的那些核酸類似物。多核苷酸可以被合成，例如，使用自動化DNA合成儀。術語 "核酸"通常是指大的多核苷酸。將會理解，當核苷酸序列由DNA序列（即4，1^，〇所表示時， 其還包括RNA序列（即六，1]，6,〇，其中"1]"代替"1'"。術語"(^財"是指以單鏈或雙鏈形式與 mRNA互補或相同的DNA。
[0036]術語"互補"是指兩個多核苷酸的相互作用面的拓撲兼容性或匹配在一起。因此， 兩個分子可被描述為互補的，并且所述接觸面表征是彼此互補的。如果第一多核苷酸的核 苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結(jié)合伴侶的核苷酸序列相同，則第一多核苷酸與第二 多核苷酸互補。因此，序列5' -TATAC-3'的多核苷酸與序列是5' -GTATA-3'的多核苷酸互補。 [0037]術語"編碼"指的是在多核苷酸(例如，基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特定序列作 為模板在生物