/L 瓊脂。
[0033] 2.芘降解菌的馴化
[0034]樣品采自廣東省清遠(yuǎn)佛閃石角鎮(zhèn)大田村，具體位置為：北煒23° 53'34〃，東經(jīng)113° 25 '47〃，取自沃土農(nóng)業(yè)科技有限公司以豬糞為原料生產(chǎn)的蚯蚓糞，300g，含水量約50 %，平 攤于托盤中，添加花使得最終艇蝴中花的濃度為：第1天25mg · kg<，4天后50mg · kg'8天 后10〇11^*1^1，15天后20〇11^*1^1。添加花的方法為 :取一定量的花溶于丙酮溶液，取花丙 酮溶液均勻噴施到土壤中，攪拌均勻，并放置通風(fēng)廚待丙酮揮發(fā)完畢，在28°C，避光條件下 連續(xù)馴化20天。
[0035] 3.分離
[0036] 稱取已經(jīng)馴化好的土樣10g，放入90mL無菌水中，搖床振蕩15min后，放置30s后，取 O.lmL涂布到無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，然后用升華法在培養(yǎng)基上形成芘膜。成膜方法:把接種 后的平板倒扣到底部平鋪有固體芘的250mL的燒杯上，并用封口膜將接口處封閉，整體放到 沙浴中加熱，在平板上方放上冰，使芘升華后遇平板冷卻而附著在固體培養(yǎng)基上。制備好的 培養(yǎng)皿置入30°C恒溫箱培養(yǎng)，能在固體平板上生長起來的真菌再多次用TOA培養(yǎng)基平板畫 線經(jīng)多次劃線純化，純化后的菌株再用于鑒定和芘降解能力的測定。
[0037] 4.鑒定
[0038] (1)平板觀察
[0039] 選取察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，將接種針經(jīng)火焰滅菌并冷卻后，蘸取 極少量的孢子，點(diǎn)植于平板的中間位置，將平板置于25°C培養(yǎng)8d，觀察菌落的特征并記錄。
[0040] (2)顯微觀察
[0041] 用解剖針從培養(yǎng)皿的菌落上，挑取少許菌體，置載玻片的水滴中，于顯微鏡下觀察 其形態(tài)特征并記錄。
[0042] (3)分子鑒定
[0043] 提取0嫩，通用引物打51(5'-丁〇!^厶66丁6厶厶〇：1'-6〇1；-3'）和
[0044] ITS4(5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '）擴(kuò)增整個(gè)ITS序列，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化和 克隆，然后由上海生物工程公司完成測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件去除載體后，把所得的 ITS rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，利用BLastn工具進(jìn)行序列比對，對霉菌進(jìn)行鑒定。5. 結(jié)果與分析
[0045] 經(jīng)平板觀察和顯微觀察，H1菌在察氏培養(yǎng)基上菌落生長迅速，絨狀，7天快鋪滿培 養(yǎng)皿，反面無色，后期表面有皺紋暗煙綠色，黑色的孢子囊，（見圖1 (a)、（b));在麥芽汁培養(yǎng) 基上菌絲生長茂盛，7d即可長滿整皿，絨狀且有一定的絮狀，表面有少量的皺紋，菌絲和孢 子囊都呈煙綠色，反面鮮艷的橙黃色（見圖2(a)、（b));在察氏培養(yǎng)基上菌落生長迅速，絨 狀，7天快鋪滿培養(yǎng)皿，表面有較大的皺紋，菌絲煙綠色，孢子囊灰白色，平板反面淡黃和土 黃色（見圖3 (a)、（b))。分生孢子頭短柱狀，長短不一，約400μπι，直徑50μπι，頂囊燒瓶形、20-30μπι，分生孢子球形或近球形，大部分直徑2.5-3μπι(圖4)。
[0046] 結(jié)合上述的平板觀察、顯微觀察和分子鑒定結(jié)果，得出如下結(jié)論：
[0047] 本發(fā)明篩選到的降解芘霉菌煙曲霉Hl，ITS rDNA序列長度為556bp，序列如SEQ ID NO: 1所示；其與煙曲霉(Asperqillus fumigatus)的同源性達(dá)99.3%，其培養(yǎng)特征及顯微形 態(tài)特征與煙曲霉(Asperqillus fumigatus)最相似。該菌株已于2015年11月3日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱為:CGMCC;地址為:北京市朝陽區(qū)大屯路 中科院微生物研究所;保藏編號為:CGMCC No. 11576。
[0048]實(shí)施例2煙曲霉H1對芘的降解能力
[0049] 1. -級種子的制取
[0050] 先從斜面上接種至roA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱30°C生長10天以上，待表面長滿白色的孢 子，用無菌勺輕輕刮下表面的孢子，置于含有100mL無菌無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，160r/min，30°C培 養(yǎng)3-5天，待孢子球長至2_左右，進(jìn)入快速生長期，備用，此為一級種子。
[0051 ] 2.實(shí)驗(yàn)過程
[0052]用無菌吸管吸取孢子液5mL接種到含芘的25mL的液體培養(yǎng)基中，瓶口用無菌封口 培養(yǎng)膜封口（無菌封口培養(yǎng)膜是環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜，上有直徑〇. 6cm的圓孔兩個(gè)，兩層 膜的中間有直徑3cm的、孔徑小于0.2μ的無菌濾紙片，可用于過濾空氣），放置恒溫振蕩培養(yǎng) 箱中160r/min，30°C培養(yǎng)，隔一定的時(shí)間取樣，每次取3瓶，過濾于燒杯中，轉(zhuǎn)入分液漏斗中， 加環(huán)己烷7ml振搖萃取2min，濾紙和燒杯用丙酮洗滌，同時(shí)洗滌液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，洗滌后 的孢子烘干至恒重，用以測定菌絲干重。
[0053] 3.具體檢測方法
[0054] 菌絲干重用恒重法，即80°C烘至恒重。
[0055]芘的測定用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津GC/MS QP2010Plus，日本)對有機(jī)相中的 芘含量進(jìn)行測定。色譜條件:進(jìn)樣口無分流模式，進(jìn)樣口溫度270°C;色譜柱型號為DB-5彈性 石英毛細(xì)管色譜柱（30m X 0.25mm X 0.25μπι);柱流量1.65m L/min;爐溫55°C保持lmin，以25 °C/min升至200°C，再以10°C/min升至240°C保持0.5min，最后以30°C/min升至280°C保持 2min〇
[0056]芘降解率=(芘初始質(zhì)量濃度-芘剩余質(zhì)量濃度)/芘初始質(zhì)量濃度X 100%。
[0057] 4.結(jié)果與分析
[0058]本次研究了芘降解霉菌煙曲霉HI在30天之內(nèi)的芘降解能力，以相同條件下未接種 菌種的芘培養(yǎng)液為空白對照。圖5為接種煙曲霉H1和未接種對芘的降解曲線。圖6為煙曲霉 H1的菌絲干重增長圖。
[0059] 在接種的第8天降解率達(dá)到37.47 %，菌絲干重1.30g;至14天，降解率達(dá)到 41.21 %，菌絲干重1.31g，有微弱的上升;23天，降解速度加快很多，降解率達(dá)到75.63%，菌 絲干重則下降至0.540g;培養(yǎng)30天，降解率有下降，為61.72%，而菌絲干重繼續(xù)下降，達(dá)到 0.349g。一般來說，霉菌降解芘有兩條途徑:一是菌絲吸附；二是酶促降解。在本研究的第8、 14天，芘的降解應(yīng)該以吸附為主，在高濃度芘的抑制下，菌絲干重也呈現(xiàn)生長趨勢;在第14-23天，菌絲干重從1.31g下降到0.54g，此時(shí)應(yīng)該是菌絲本身產(chǎn)生自溶所致，按推理，此時(shí)培 養(yǎng)液里的芘含量應(yīng)該比前期高，因?yàn)槌巳芤豪锏能磐膺€有菌絲前期吸附的芘由于自溶而 出來的芘，但此時(shí)芘濃度卻下降到只有0.502mg/L，而除了菌絲吸附外，最大可能應(yīng)該是菌 絲產(chǎn)生了降解芘的酶;至培養(yǎng)30天，菌絲繼續(xù)自溶，菌絲干重只有0.349g，芘濃度為1.92mg/ L，降解率略微上升為61.72%，此時(shí)應(yīng)該是降解芘的酶漸漸失去活性，隨著菌絲自溶的增 加，芘的濃度有很少的上升。
【主權(quán)項(xiàng)】
1 ·一種煙曲霉，其特征在于，所述煙曲霉為煙曲霉(Asperqillusfumigatus)Hl，其保 藏編號為CGMCCNo.11576。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙曲霉在降解芘中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙曲霉在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙曲霉及其應(yīng)用。本發(fā)明的煙曲霉為煙曲霉(Asperqillus？fumigatus)H1，其保藏編號為CGMCC？No.11576。本發(fā)明的煙曲霉可用于降解芘，并進(jìn)一步用于降解多環(huán)芳烴。本發(fā)明的煙曲霉可以有效、快速的降解芘以及其他多環(huán)芳烴，為芘污染和其他多環(huán)芳烴污染的生物處理工程提供強(qiáng)有力的幫助。CGMCC 1157620151103
【IPC分類】C12N1/14, A62D101/20, C12R1/68, A62D3/02
【公開號】CN105441339
【申請?zhí)枴緾N201610004133
【發(fā)明人】黃賽花, 侯梅芳, 周建, 趙海青, 董浩
【申請人】上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2016年1月5日