一種殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物及其方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物及其方法，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述的藥物組合物為檸檬醛和抗真菌藥物，所述的抗真菌藥物包括兩性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑。一種殺滅耐藥煙曲霉的方法，包括制備藥物、制備孢子懸液、藥物MIC測(cè)定和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。本發(fā)明藥物組合物既提高了藥物對(duì)耐藥菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌藥物的毒副作用，是治療抗真菌藥物耐藥煙曲霉感染的一種較為理想的藥物組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】[0001] 一種殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物及其方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物以及殺 滅耐藥煙曲霉的方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 隨著人口老齡化速度加快，惡性腫瘤、艾滋病、器官移植、糖尿病等患者急劇增加， 導(dǎo)致了大量介入診療技術(shù)開(kāi)展以及廣譜抗生素與糖皮質(zhì)激素的使用，當(dāng)前臨床獲得性深部 真菌感染呈現(xiàn)快速發(fā)展的趨勢(shì)，并已成為免疫低下患者主要死因之一。由煙曲霉導(dǎo)致的侵 襲性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是惡性血液病、器官移植、艾滋 病等免疫受損患者常見(jiàn)且致命的機(jī)會(huì)感染性疾病，病死率高達(dá)80%，耐藥是導(dǎo)致治療失敗的 一個(gè)重要原因。全球微生物耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，將近28. 6%的煙曲霉菌株對(duì)兩性霉素B耐 藥，并且已經(jīng)出現(xiàn)唑類(lèi)耐藥和多重耐藥菌株，使臨床IPA的治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。如何控制耐 藥的煙曲霉菌引起的IPA已經(jīng)成為了臨床難題，研發(fā)出新的有效的藥物是解決這個(gè)難題的 一條途徑，然而研發(fā)出新的有效藥物是個(gè)過(guò)程及其漫長(zhǎng)，難以應(yīng)對(duì)目前耐藥的嚴(yán)峻形勢(shì)。如 果某種藥物能協(xié)同傳統(tǒng)抗真菌藥使后者發(fā)揮更強(qiáng)的抑制煙曲霉作用，那么對(duì)緩解耐藥壓力 也將是很大的幫助，但目前還未見(jiàn)類(lèi)似的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決日益嚴(yán)峻的曲霉病，抑制煙曲霉引起的真菌感染，提供 一種殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物及其方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為：一 種殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物，所述的藥物組合物為檸檬醛和抗真菌藥物。
[0005] 以上所述的檸檬醛為60-70%反式檸檬醛和30-40%順式檸檬醛。
[0006] 以上所述的抗真菌藥物包括兩性霉素B、伏立康唑、卡泊芬凈和伊曲康唑。
[0007] 以上所述的藥物組合物的載體包括霧化吸入劑、注射劑、皮膚洗劑和體外消毒劑。
[0008] 以上所述的兩性霉素B為脫氧膽酸鹽及其脂質(zhì)體。
[0009] 兩性霉素B、伏立康唑、卡泊芬凈和伊曲康唑等抗真菌藥物曾作為傳統(tǒng)治療IPA的 首選藥物，因在臨床上被廣泛、長(zhǎng)期使用，使煙曲霉對(duì)抗真菌藥物耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，且抗 真菌藥大劑量應(yīng)用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯的腎毒性。聯(lián)合用藥可作為控制和減少耐藥菌株產(chǎn)生 的有效手段之一，檸檬醛作為毒性較低的中藥單體活性成分作為抗真菌藥物的增效劑，能 增加真菌對(duì)藥物的敏感性，從而減少大劑量用藥給機(jī)體帶來(lái)的毒副作用。
[0010] 如兩性霉素B的抗菌作用靶點(diǎn)主要是煙曲霉菌體細(xì)胞壁上的麥角固醇，而當(dāng)煙曲 霉麥角固醇合成基因發(fā)生突變，導(dǎo)致麥角固醇缺失或在細(xì)胞壁上的位置發(fā)生改變，可造成 煙曲霉菌株對(duì)AMB耐藥。檸檬醛不僅可以破壞煙曲霉菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，阻礙分生孢子 梗的形成，還能作用于細(xì)胞核等區(qū)域影響菌體DNA、RNA的合成，干擾正常的細(xì)胞周期，因此 兩藥聯(lián)用，可使藥物作用靶點(diǎn)增加進(jìn)而增強(qiáng)抗菌作用。由于兩性霉素B為親水性藥物，較難 透過(guò)菌體細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，在作用靶位達(dá)到足夠高的有效濃度。而檸檬醛為脂溶性 藥物，可自由通過(guò)細(xì)胞膜，一但兩藥聯(lián)用，兩性霉素B可借助檸檬醛對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破 壞作用，更容易滲透到菌體內(nèi)部發(fā)揮氧化損傷作用，從而表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用。
[0011] 煙曲霉可在體外形成生物被膜結(jié)構(gòu)，在胞外基質(zhì)包被狀態(tài)下，菌體的耐藥性相對(duì) 其浮游狀態(tài)而言會(huì)明顯升高，同時(shí)MDR4等外排泵基因的表達(dá)明顯上調(diào)，可增強(qiáng)菌體對(duì)藥物 的外排作用。檸檬醛不但可以抑制和破壞白色念珠菌生物被膜形成，減弱屏障作用，還具有 藥物外排泵抑制活性，可使抗菌藥物易于滲入菌體內(nèi)部并達(dá)到有效的蓄積量，增強(qiáng)其殺菌 作用。
[0012] 一種殺滅耐藥煙曲霉的方法，使用以上所述的兩性霉素B藥物組合物，包括制備 藥物、制備孢子懸液、藥物MIC測(cè)定和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，具體檢測(cè)步驟如下 ： 1) 制備藥物將兩性霉素B和檸檬醛，分別二甲亞砜溶解，并將溶液配成濃度為 3. 2-6. 4mg/L 和 700-819. 2 mg/L，于-90~-70°C 儲(chǔ)存； 2)制備孢子懸液收集煙曲霉菌株接種到PDA培養(yǎng)皿上，置于35~37°C生化培養(yǎng)箱進(jìn) 行復(fù)蘇，后轉(zhuǎn)至另一PDA培養(yǎng)皿并置于35~37°C生化培養(yǎng)箱活化3~5天后，用含0. 025% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液沖洗斜面表面收集孢子，用MOPS緩沖后pH為7. 0的RPMI-1640 重懸孢子，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)使懸液中孢子終濃度為 (1-10) X 104CFU/mL ; 3)藥物MIC測(cè)定將步驟1)制備的兩性霉素B和檸檬醛分別置于無(wú)菌的2個(gè)96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板的第1至第10孔，第1孔加入量為IOOu 1，第2~10孔依次以二倍稀釋法至終濃 度，再將步驟2)制備的孢子懸液加入滴1至第10孔，每孔加入量為lml，第11孔為步驟2) 制備孢子懸液的生長(zhǎng)對(duì)照孔，第12孔為RPMI-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37°C培養(yǎng)48h， 分別獲得兩性霉素B和檸檬醛的最低抑菌濃度MIC ; 4)聯(lián)合藥物試驗(yàn)在無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上加入兩性霉素B和檸檬醛，前8列加入兩 性霉素B和檸檬醛，加入兩性霉素B的濃度為1/32~4MIC，添加的量為50iil，加入檸檬醛的 濃度為1/32~4MIC，添加的量各為50iU，第9列為IOOiU步驟2)制備孢子懸液的生長(zhǎng)對(duì) 照孔，第10列為無(wú)菌對(duì)照孔，再將步驟2)制備的孢子懸液加入到96孔板的第1~10列，每 孔加入量為IOOu 1，后靜置于35~37°C培養(yǎng)48~50h，觀察。
[0013] 根據(jù)以上任一項(xiàng)所述藥物組合物在預(yù)防或殺滅煙曲霉的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性進(jìn)步和顯著的特點(diǎn)是： 檸檬醛具有單體成分具有毒副作用少，來(lái)源廣，價(jià)格低廉，不易誘導(dǎo)耐藥等優(yōu)點(diǎn)，檸檬 醛在體外能增強(qiáng)抗真菌藥物的抗煙曲霉活性，逆轉(zhuǎn)耐藥菌株的耐藥性。兩種藥物的MICGfiffi 較MICGi^S著降低，且聯(lián)用的濃度-累積抑菌百分率曲線相對(duì)單用時(shí)明顯左移，即同一藥 物在同一濃度下，聯(lián)合應(yīng)用比單用抑菌能力更強(qiáng)，僅需低于4~8倍MIC的兩種藥物聯(lián)用即可 達(dá)到與單藥MIC相同的抑菌效果?？梢?jiàn)由檸檬醛與抗真菌藥物聯(lián)合產(chǎn)生的協(xié)同作用，既提 高了藥物對(duì)耐藥菌株的抗菌效果，又降低了抗真菌藥物的毒副作用，是治療抗真菌藥物耐 藥煙曲霉感染的一種較為理想的藥物組合物。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例2檸檬醛與兩性霉素B聯(lián)合作用的MIC等效曲線。
[0016] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2檸檬醛和兩性霉素B單用與聯(lián)用對(duì)7株兩性霉素B耐藥煙 曲霉菌的濃度-累積抑菌百分率曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1耐藥煙曲霉藥物組合物試驗(yàn) (1)菌株來(lái)源收集2013年9月至2014年12月從廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床 送檢標(biāo)本中分離的7株煙曲霉(編號(hào)分別為A^15, A^17, A^18, J/26, J/32 ;其中 痰標(biāo)本5株，肺泡灌洗液I株，傷口分泌物I株)，經(jīng)乳酸酚棉蘭染色形態(tài)學(xué)及48°C溫度試 驗(yàn)鑒定為經(jīng)典煙曲霉，本院臨床微生物檢驗(yàn)中心進(jìn)彳丁藥物敏感性試驗(yàn)證實(shí)均為兩性霉素B (Amphotericin B，AMB)耐藥菌株。質(zhì)控菌株選用CLSI M38-A2指南指定的近平滑念珠菌 ATCC22019。
[0018] (2)活化菌株與制備孢子懸液將7株AMB耐藥煙曲霉臨床株復(fù)蘇并轉(zhuǎn)種于 PDA斜面，35-37 °C孵育3-5d，用含0.025%吐溫20的PBS液沖洗斜面表面收集孢子，經(jīng) MOPS緩沖后pH為7. 0的RPMI-1640重懸孢子，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)使懸液中孢子終濃度為 2 X 104CFU/mL。
[0019] (3)配制藥物檸檬醛和AMB均用二甲亞砜（DMSO)溶解，分別配制成濃度為819. 2 mg/L和3. 2mg/L的儲(chǔ)存液，用0. 22 ii m針頭濾器濾過(guò)除菌后，分裝并儲(chǔ)存于-80°C待用。
[0020] (4)測(cè)定檸檬醛及AMB單用的MIC 參照CLSI M38-A2指南，將受試藥物儲(chǔ)存液 用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋為2倍工作濃度(其中檸檬醛的工作濃度范圍為4~2048 ii g/ 1^，41^為0.03125~161^/11^)，分別取1001^加入第1至第10列，第11列為不含藥物 的生長(zhǎng)對(duì)照孔，第12列為不含藥物且不含孢子的無(wú)菌對(duì)照孔。再往第1至第11列各孔加 入100 ii L制備好的孢子懸液。將完成加樣的96孔板靜置于35°C恒溫培養(yǎng)箱孵育48h后 判讀結(jié)果，并計(jì)算兩種藥物單用對(duì)7株受試煙曲霉的MIC幾何均數(shù)(minimum inhibitory concentration geometric mean，MICG)，以 MICGjll用表不。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次。
[0021] (5)檸檬醛與AMB聯(lián)合藥敏試驗(yàn)用RPMI-1640液體培養(yǎng)基將受試藥物儲(chǔ)存液稀 釋為4倍工作濃度，并根據(jù)測(cè)得兩種藥物單用的MIC值配制棋盤(pán)式微量液基稀釋法藥敏孔 板，藥物工作濃度范圍為受試菌株的1/32XMIC~4XMIC。將不同濃度的檸檬醛和AMB兩兩 組合加入96孔板，每種藥物加入50 ii L，再將制備好的孢子懸液100 ii L加入各孔中，并按上 述方法設(shè)置生長(zhǎng)對(duì)照孔和無(wú)菌對(duì)照孔。將完成加樣的96孔板置于35°C恒溫培養(yǎng)箱孵育48h 后判讀結(jié)果，并計(jì)算兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)7株受試煙曲霉的MICG s^，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。
[0022] (6)MIC值的判定將96孔板置于酶標(biāo)儀，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度 (optical density，0D)值。真菌生長(zhǎng)百分率（％)=(各孔OD值一無(wú)菌對(duì)照孔OD值)/ (生 長(zhǎng)對(duì)照孔OD值一無(wú)菌對(duì)照孔OD值)X100%，抑菌百分率=1 一生長(zhǎng)百分率。取抑菌百分率 在90%以上的最低藥物濃度為MIC值。
[0023] (7)評(píng)價(jià)檸檬醛與AMB聯(lián)合的作用效果本實(shí)驗(yàn)采用FICI對(duì)棋盤(pán)式微量液基稀 釋法的測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)：選擇兩種藥物聯(lián)合產(chǎn)生最佳抑菌效應(yīng)時(shí)各自的MIC值作為各 自的MIC聯(lián)合，計(jì)算出部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index， FICI )，F(xiàn)ICI的計(jì)算公式：FICI=甲藥MIC聯(lián)合/甲藥MIC單用+乙藥MIC聯(lián)合/乙藥MIC單用。FICI > 2. O表示有拮抗作用，I. O < FICK 2. O表示為無(wú)關(guān)作用，0. 5 < FICI < I. O表示為相 加作用，F(xiàn)ICI <0.5表示為協(xié)同作用，且FICI越小，其協(xié)同作用越強(qiáng)。將棋盤(pán)法測(cè)得兩種 藥物對(duì)各個(gè)菌株的MIC結(jié)果繪制成等效線圖，根據(jù)等效曲線的形狀可以判斷協(xié)同（凹形)、拮 抗（凸形)、無(wú)關(guān)(直線）。
[0024] 分別統(tǒng)計(jì)檸檬醛、AMB單用和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)所有受試AMB耐藥煙曲霉各個(gè)濃度點(diǎn) 的抑菌率，以濃度作為橫坐標(biāo)，以抑菌率作為縱坐標(biāo)，繪制濃度-累積抑菌百分率曲線。
[0025] (8)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件，通過(guò)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)方法比較藥 物的MICG_與MICGs^，以產(chǎn)< 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0026] 實(shí)施例2藥物組合物試驗(yàn)結(jié)果 (1)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所測(cè)得質(zhì)控菌株ATCC22019對(duì)AMB的MIC值為Iiig/mL，在CLSIM38-A2指南規(guī)定的參考范圍之內(nèi)，且生長(zhǎng)對(duì)照孔菌株生長(zhǎng)良好，藥敏試驗(yàn)結(jié)果 可靠。
[0027] (2 )檸檬醛與AMB單用及聯(lián)用的MIC按照CLSI推薦的ECVs標(biāo)準(zhǔn)判斷受試煙曲 霉對(duì)AMB的敏感性，以AMB的MIC彡Iiig/mL為敏感，>Iiig/mL為耐藥。AMB單用時(shí)對(duì)受 試菌株MIC范圍在2~4iig/mL，即本實(shí)驗(yàn)7株受試煙曲霉均對(duì)AMB耐藥。檸檬醛單用的MIC 值為256~512iig/mL。具體見(jiàn)表1。
[0028] 表1檸檬醛與AMB單用或聯(lián)合作用于7株AMB耐藥煙曲霉的MIC值

【權(quán)利要求】
1. 一種殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物為檸檬醛和抗 真菌藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物，其特征在于，所述的檸檬醛 為60-70%反式檸檬醛和30-40%順式檸檬醛。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物，其特征在于，所述的抗真菌 藥物包括兩性霉素 B、伏立康唑、卡泊芬凈和伊曲康唑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組 合物的載體包括霧化吸入劑、注射劑、皮膚洗劑和體外消毒劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺滅耐藥煙曲霉的藥物組合物，其特征在于，所述的兩性霉 素 B為脫氧膽酸鹽及其脂質(zhì)體。
6. -種殺滅耐藥煙曲霉的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求3所述的兩性霉素 B藥物組 合物，包括制備藥物、制備孢子懸液、藥物MIC測(cè)定和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，具體檢測(cè)步驟如下： 1) 制備藥物將兩性霉素 B和檸檬醛，分別二甲亞砜溶解，并將溶液配成濃度為 3. 2-6. 4mg/L 和 700-819. 2 mg/L，于-90~-70°C 儲(chǔ)存； 2) 制備孢子懸液收集煙曲霉菌株接種到PDA培養(yǎng)皿上，置于35~37°C生化培養(yǎng)箱進(jìn)行 復(fù)蘇，后轉(zhuǎn)至另一 PDA培養(yǎng)皿并置于35~37°C生化培養(yǎng)箱活化3~5天后，用含0. 025%吐溫20 的磷酸鹽緩沖液沖洗斜面表面收集孢子，用MOPS緩沖后pH為7. 0的RPMI-1640重懸孢子， 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)使懸液中孢子終濃度為1-10 X 104CFU/ mL ； 3) 藥物MIC測(cè)定將步驟1)制備的兩性霉素 B和檸檬醛分別置于無(wú)菌的2個(gè)96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板的第1至第10孔，第1孔加入量為100 U 1，第2~10孔依次以二倍稀釋法至終濃 度，再將步驟2)制備的孢子懸液加入滴1至第10孔，每孔加入量為lml，第11孔為步驟2) 制備孢子懸液的生長(zhǎng)對(duì)照孔，第12孔為RPMI-1640液體培養(yǎng)基，靜置于35~37°C培養(yǎng)48h， 分別獲得兩性霉素 B和檸檬醛的最低抑菌濃度MIC ; 4) 聯(lián)合藥物試驗(yàn)在無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上加入兩性霉素 B和檸檬醛，前8列加入兩 性霉素 B和檸檬醛，加入兩性霉素 B的濃度為1/32~4MIC，添加的量為50iil，加入檸檬醛的 濃度為1/32~4MIC，添加的量各為50iU，第9列為lOOiU步驟2)制備孢子懸液的生長(zhǎng)對(duì) 照孔，第10列為無(wú)菌對(duì)照孔，再將步驟2)制備的孢子懸液加入到96孔板的第1~10列，每 孔加入量為100U 1，后靜置于35~37°C培養(yǎng)48~50h，觀察。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述藥物組合物在預(yù)防或殺滅煙曲霉的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/496GK104474550SQ201410839171
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】陳一強(qiáng), 羅勁, 孔晉亮 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)