一種檢測人類egfr基因l861q位點突變的探針和引物組合的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種用于檢測人類EGFR基因 L861Q位點突變的方法，并提供了相關(guān) 的擴增引物及探針，屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor,也稱：表皮生長因子受體）基因，表 皮生長因子受體（HER)家族成員之一，在細胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR基因 定位于7號染色體短臂7pl2-14區(qū)，由IlSkb組成，包含28個外顯子，其中，酪氨酸激酶功 能區(qū)由外顯子18-24編碼，外顯子18-20編碼N端小葉，外顯子21-24編碼C端小葉。EGFR 蛋白是具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，存在于哺乳動物上皮細胞、角質(zhì)細胞、膠質(zhì)細 胞、成纖維細胞等細胞表面。EGFR與HER2(erb B2)，HER3(erb B3)和HER4(erb B4)歸入 Erb B家族，同屬受體酪氨酸激酶家族。它們有著類似的分子結(jié)構(gòu)：細胞外配體結(jié)合區(qū)、跨 膜區(qū)及細胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)。EGFR蛋白與表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α和表皮調(diào)節(jié)素 等配體結(jié)合成為二聚體或異二聚體后，使受體酪氨酸激酶活化，激活下游通路如ERK/MAPK， ΡΙ3Κ/ΑΚΤ和STAT，參與調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡并控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0003] 近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)EGFR基因能夠在多種腫瘤中作為抗腫瘤治療的靶標(biāo)， 包括非小細胞肺癌（NSCLC)等。某些EGFR酪氨酸酶抑制劑（EGFR-TKI)如吉非替尼 (gefitinib ；Iressa, ZD1839 ；AstraZeneca, Wilmington, DE)和厄洛替尼(erlotinib ； Tarceva, 0SI-774 ;0SI Pharmaceuticals, Farmingdale, NY)已經(jīng)在臨床上用于 NSCLC 的治 療。EGFR-TKI能通過阻斷腫瘤細胞EGFR信號傳導(dǎo)，來抑制腫瘤細胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血 管生成并促進腫瘤細胞的凋亡。但是臨床實踐顯示僅有8-18%的非小細胞肺癌患者可以 受益，這種療效差異主要表現(xiàn)為EGFR基因突變的差異。研究表明，某些含有EGFR基因酪氨 酸激酶區(qū)突變的個體服用EGFR-TKI具有更好的療效，而不含該基因突變的個體療效并不 顯著，這些突變主要集中在18-21號外顯子上。因此可以通過檢測EGFR基因18-21號外 顯子的突變達到預(yù)測吉非替尼等分子靶向藥物的治療效果的目的。本發(fā)明所述EGFR基因 L861Q突變位點位于21號外顯子區(qū)域，通過檢測該位點的突變能夠預(yù)測分子靶向藥物的治 療效果。
[0004] 目前點突變檢測方法主要有測序法，該方法耗時長，且靈敏度不高。另一些用于臨 床檢測的熒光定量PCR法，靈敏度相對較高，但背景較強，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。EGFR基因21 號外顯子L861Q位點突變位于序列2581bp處，CTG突變?yōu)镃AG (見表1)。因此需建立一種 高特異性L86IQ位點突變檢測方法。
[0005] 表1 :EGFR基因 L861Q位點突變
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種檢測人類EGFR基因 L861Q位點突變的方法以及相關(guān)的探針和 引物組合，該方法能夠解決【背景技術(shù)】中的不足，檢測靈敏度高，操作簡單快速，結(jié)果判讀簡 單客觀。
[0008] 實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種檢測人類EGFR基因 L861Q位點突變的探針和引物組合，所述的探針的基因序 列如 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6 以及 SEQ ID NO:9 所示：
[0010] SEQ ID N0:3 5'FAM-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCCTATGAC-BHQ1 3' ；
[0011] SEQ ID N0:6 5'FAM-TCTTGACATGCTGCGGTGTTTTCACCAGTAC-BHQ1 3' ；
[0012] SEQ ID N0:9 5'HEX-CCAAGGACCACCTCACAGTTATTGAACATC-BHQ1 3' ；
[0013] 所述的引物組合為：
[0014] SEQ ID NO:I GGCAGCATGTGGCACCATCTC ；
[0015] SEQ ID NO :2 GGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG ；
[0016] SEQ ID NO :4 GGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATG ；
[0017] SEQ ID NO :5 GGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGAT ；
[0018] SEQ ID NO :7 TTCCAGTTTGCCAAGGCACGAG ；
[0019] SEQ ID N0:8 GAAGGAAAGATCATAATTCCTCTGCACATA。
[0020] 一種基于上述探針和引物組合的檢測人類EGFR基因 L861Q位點突變的方法，包括 以下步驟：（1):合成權(quán)利要求1所述的探針及引物組合；
[0021] (2)、對待檢測樣品進行處理并提取DNA ;
[0022] (3)、配制熒光定量PCR反應(yīng)體系A(chǔ)，對待測樣品上樣量進行監(jiān)測，利用引物SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、和探針 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:9 擴增待 測樣品DNA，得到樣品DNA的檢測Ct值和內(nèi)參CT值，以FAM熒光信號CT值作為樣品的質(zhì)控 Ct值；
[0023] (4)、配制熒光定量PCR反應(yīng)體系B，對待測樣品進行PCR擴增檢測，利用引物SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8 和探針 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9 擴增 待測樣品中可能存在的EGFR基因 L861Q突變DNA，得到樣品DNA的突變檢測Ct值；
[0024] (5)以質(zhì)控Ct值作為上樣量是否適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控Ct值< 30則上樣量合適，檢測 結(jié)果有效；30 <質(zhì)控Ct值< 34則上樣量偏低，可提高上樣量后檢測；以突變檢測Ct值判 斷是否存在突變，若突變檢測Ct值< 39則樣品存在突變，若突變檢測Ct值多39則樣品無 該突變或低于突變檢測下限。
[0025] 步驟（3)中所述的熒光定量PCR反應(yīng)體系A(chǔ)包括PCR MIX ;SEQ ID NO: 10. 5 μΜ; SEQ ID N0:20. 5 μΜ ；SEQ ID NO:30. 25 μM ；SEQ ID NO:70. 25 μM ；SEQ ID NO:80. 25 μM ；SEQ ID N0:90. 13 μΜ ;樣品 DNA 體積濃度 10%。
[0026] 步驟⑷中所述的熒光定量PCR反應(yīng)體系B包括PCR MIX ;SEQ ID NO:40. 5 μΜ; SEQ ID Ν0:50. 5 μΜ ；SEQ ID Ν0:60. 25 μΜ ；SEQ ID NO:70. 25 μM ；SEQ ID NO:80. 25 μM ；SEQ ID Ν0:90· 13 μΜ ;樣品 DNA 體積濃度 10%。
[0027] 本發(fā)明中優(yōu)選 PCR 反應(yīng)條件為：50°C 2min ;95°C 30s ;95°C 5s，60°C 30s，43 個循 環(huán)；每個循環(huán)后收集FAM和HEX熒光信號。
[0028] 本發(fā)明中，采用熒光定量PCR方法，對單堿基突變區(qū)域序列進行特異性擴增檢測。 本發(fā)明建立的檢測方法簡單有效，檢測靈敏度高，操作簡單快速，結(jié)果判讀簡單，能夠準(zhǔn)確 預(yù)測分子靶向藥物的治療效果，是一種有效檢測人類EGFR基因 L861Q位點突變的方法。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明提供的方法用于檢測EGFR基因野生型樣品的擴增曲線圖及L861Q 位點突變樣品的擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0030] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用 以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0031] 本發(fā)明實施例中所用的技術(shù)，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī) 技術(shù)；所用的儀器設(shè)備、試劑等，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過公 共途徑獲得。
[0032] 本發(fā)明實施例提供一種檢測人類EGFR基因 L861Q位點突變的方法，包括一組引 物、特異性探針。其中一組引物序列為SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8 ;特異性探針序列為 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:9 ；
[0033] 具體的，所述引物的基因序列如下所示：
[0034] SEQ ID N0:1 GGCAGCATGTGGCACCATCTC ；
[0035] SEQ