一種用于檢測(cè)egfr基因突變的探針、引物、檢測(cè)體系及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種表皮生長(zhǎng)因子（EGFR)基因突變檢測(cè) 的探針、引物、檢測(cè)體系及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長(zhǎng)因子受體基因位于人類7號(hào)染色體的短臂上，由188307個(gè)堿基組成，包 括28個(gè)外顯子。其酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18~24編碼。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR) 是原癌基因C-erbB-l(HER-l)的表達(dá)產(chǎn)物，定位于細(xì)胞膜上。EGFR主要通過兩條途徑將信 號(hào)傳遞至細(xì)胞核，一條是Ras-Raf-MAPK途徑；另一條是PI3K-PKC-IKK途徑。當(dāng) 信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核后，引起核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平的增加，使細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化。EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的 異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的原因。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs)是針 對(duì)EGFR靶點(diǎn)的小分子抑制劑，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已證實(shí)，EGFR基因突變的晚期NSCLC患者能從 EGFR-TKIs顯著獲益。EGFR基因編碼區(qū)的突變主要發(fā)生在外顯子18~21上。目前已發(fā)現(xiàn) 至少30種突變與EGFR-TKIs藥物反應(yīng)性有關(guān)，主要是外顯子19的缺失突變和外顯子21的 L858R突變。此外，大部分患者在服用EGFR-TKIs-段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)耐藥，其中約60%耐藥 患者可檢測(cè)到EGFR20號(hào)外顯子T790M突變。外顯子18、19、20、21突變約占EGFR基因突 變比例分別為5%、45 %、1 %和45%。目前腫瘤組織樣本仍是獲取腫瘤基因相關(guān)信息的主 要來源，但部分晚期肺癌患者已無法得到腫瘤組織樣本。研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者的外周血中存 在來源于凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞的游離DNA。因此，血漿樣本也可用于肺癌患者EGFR基因突 變狀態(tài)的檢測(cè)。血漿樣本EGFR突變狀態(tài)的檢測(cè)，既可以預(yù)測(cè)患者服用EGFR-TKIs治療的療 效，也可以在EGFR-TKIs治療過程中連續(xù)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)EGFR突變狀態(tài)變化，用于指導(dǎo)患者的治 療。
[0003] 目前常用的基因突變檢測(cè)方法有測(cè)序法和ARMS-PCR方法，這兩種方法均存在一 定的缺陷。測(cè)序法靈敏度較低約20%，且操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，假陰性率較高。ARMS-PCR 方法能夠達(dá)到1 %的靈敏度，對(duì)于腫瘤組織樣本能夠滿足檢測(cè)需求，但是對(duì)于取樣方便的血 液樣本，如血漿或者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，腫瘤DNA含量往往低于1 %，ARMS-PCR方法靈 敏度不足以對(duì)血液進(jìn)行檢測(cè)，局限了臨床醫(yī)生對(duì)靶向藥物療效的判斷。此外，在臨床用藥過 程中可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性突變，以前的方法由于靈敏度不夠也無法進(jìn)行檢測(cè)。因此，從這些低 含量樣本中檢測(cè)突變的基因，需要找一種靈敏性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便易行、結(jié)果判定簡(jiǎn)單的 突變檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種高靈敏度檢測(cè)EGFR基因突變的試劑盒。
[0005] 在本發(fā)明的一方面，提供一種檢測(cè)EGFR基因突變檢測(cè)的引物和探針，其特異引物 與探針包括如下序列：
[0006] 表1EGFR突變基因特異性雙引物和探針核苷酸序列
[0007]

[0008] 本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括： P-EGFR混合酶、P-EGFR陽(yáng)性對(duì)照和P-EGFR反應(yīng)液A、B。反應(yīng)液內(nèi)包含相應(yīng)的EGFR基因 突變檢測(cè)和內(nèi)控檢測(cè)試劑，突變由FAM/R0X/CY5信號(hào)指示，內(nèi)控由HEX信號(hào)指示，內(nèi)控作為 結(jié)果判讀的一部分，選擇的檢測(cè)區(qū)域是人類EGFR基因相對(duì)保守的區(qū)段，用于監(jiān)控血漿樣本 DNA質(zhì)量和PCR反應(yīng)過程。
[0009] 表2試劑盒組成
[0010]
[0011] 表3試劑盒不同反應(yīng)管檢測(cè)的突變類型
[0012]
[0013] 本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系如下：
[0014] 19DEL&L858R體系：
[0015]
[0016]
[0017] T790M體系
[0018]
[0019] G719XS768IL861Q體系：
[0020]
[0021] 本發(fā)明再一方面，提供一種檢測(cè)EGFR基因突變的方法（所述方法用于非診斷目 的），所述方法包括以下步驟：
[0022] (1)根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)公布的人類EGFR為野生型基因序列，針對(duì)EGFR25種基因突 變，設(shè)計(jì)特異性引物和探針。
[0023] (2)提取血漿檢測(cè)樣本中的DNA。
[0024] (3)配制實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。
[0025] (4)根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷檢測(cè)結(jié)果：利用特異性引物和熒光探針 進(jìn)行PCR檢測(cè)，突變由FAM/R0X/CY5信號(hào)指示，內(nèi)控由HEX信號(hào)指示，通過計(jì)算ΛCt的大小 進(jìn)行判斷，反應(yīng)管的ACt值<ACtCut-off值時(shí)，則樣品為該反應(yīng)管對(duì)應(yīng)信號(hào)突變陽(yáng)性， 反之則為陰性或低于試劑盒的檢測(cè)下限。
[0026] ΔCt值一Ct值 FAM/R0X/CY5-Ct值HEX/VIC
[0027] 表4結(jié)果判定
[0028]
[0029] 本發(fā)明基于ARMS-PCR平臺(tái)，開發(fā)一種高靈敏度檢測(cè)EGFR25種基因突變的試 劑盒。本試劑盒以血漿DNA為檢測(cè)樣本，通過檢測(cè)EGFR基因突變，既可以預(yù)測(cè)患者服用 EGFR-TKIs治療的療效，也可以在EGFR-TKIs治療過程中連續(xù)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)EGFR突變狀態(tài)變 化，用于指導(dǎo)患者的治療。本檢測(cè)方法靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間只需140分鐘即可完成，同時(shí)具 備了特異性好，準(zhǔn)確率高，價(jià)廉快速，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足臨床快速檢測(cè)的實(shí)際需求。
[0030] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用了特異性引物和探針技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)血液樣本 EGFR25種基因突變的快速檢測(cè)。本發(fā)明（1)由于早期腫瘤釋放到外周血中的游離DNA極其 微量且呈高度片段化，故引物設(shè)計(jì)上，（i)控制擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在l〇〇bp左右，并且控制引物 的Tm值在65°C左右；（ii)本試劑盒在特定buffer體系下，直接用突變特異引物進(jìn)行富集 和放大，最大程度地提高了擴(kuò)增效率；（2)靈敏度高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)2%。； (3)與數(shù)字PCR 方法比較，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本，臨床應(yīng)用范圍廣；(4)大反應(yīng)體積血漿樣本檢測(cè)，使血漿樣 本DNA上樣量變大，體系更穩(wěn)定，增大了血漿樣本的檢出率；（5)在3個(gè)反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)檢 測(cè)EGFR基因的25種突變，不同外顯子上的突變采用不同熒光信號(hào)進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果直觀明 了（6)檢測(cè)速度快，檢測(cè)過程只需要120分鐘即可完成，耗時(shí)僅需數(shù)字PCR的二分之一；（7) 本發(fā)明檢測(cè)方法能夠檢測(cè)外周血標(biāo)本，采樣方便，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者使用EGFR-TKI藥物的療 效。
【附圖說明】
[0031] 圖1為1#管FAM信號(hào)（19-del)靈敏度分析試驗(yàn)結(jié)果PCR圖；
[0032] 圖2為1#管R0X信號(hào)（L858R)靈敏度分析試驗(yàn)結(jié)果PCR圖；
[0033] 圖3為2#管FAM信號(hào)（T790M)靈敏度分析試驗(yàn)結(jié)果PCR圖；
[0034] 圖4為3#管FAM信號(hào)（G719X)靈敏度分析試驗(yàn)結(jié)果PCR圖；
[0035] 圖5為3#管R0X信號(hào)（L861Q)靈敏度分析試驗(yàn)結(jié)果PCR圖；
[0036] 圖6為3#管CY5信號(hào)（S768I)靈敏度分析試驗(yàn)結(jié)果PCR圖；
[0037] 圖7為1#管臨床樣本FAM信號(hào)陽(yáng)性PCR圖；
[0038] 圖8為1#管臨床樣本R0X信號(hào)陽(yáng)性PCR圖；
[0039] 圖9為1#管臨床樣本FAM信號(hào)陰性PCR圖；
[0040] 圖10為1#管臨床樣本R0X信號(hào)陰性PCR圖；
[0041] 圖11為2#管臨床樣本FAM信號(hào)陽(yáng)性PCR圖；
[0042] 圖12為2#管臨床樣本FAM信號(hào)陰性PCR圖；
[0043] 圖13為3#管臨床樣本FAM信號(hào)陽(yáng)性PCR圖；
[0044] 圖14為3#管臨床樣本R0X信號(hào)陽(yáng)性PCR圖；
[0045] 圖15為3#管臨床樣本CY5信號(hào)陽(yáng)性PCR圖；
[0046] 圖16為3#管臨床樣本FAM信號(hào)陰性PCR圖；
[0047] 圖17為3#管臨床樣本R0X信號(hào)陰性PCR圖；
[0048] 圖18為3#管臨床樣本CY5信號(hào)陰性PCR圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義或說明，本專利所述的科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員所理解具有相同的含義。
[0050] 實(shí)施例1
[0051] 本實(shí)施例以基因工程構(gòu)建的質(zhì)粒為陽(yáng)性質(zhì)粒，以陰性血漿樣本做對(duì)照。利用本發(fā) 明實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)EGFR25種基因突變的方法包括如下步驟：
[0052] (1)檢測(cè)樣本處理與DNA的提?。?br>[0053] 質(zhì)粒處理與提?。焊髻|(zhì)粒的提取采用