， 合并萃取液，加入〇. 5 %的活性炭進(jìn)行脫色，然后用旋轉(zhuǎn)濃縮儀進(jìn)行濃縮，即得到粗提物， 粗提物收率達(dá)95%。將粗提物與200-300目的硅膠攪拌后干法上樣，采用硅膠柱進(jìn)行 分離純化。柱層析條件如下：洗脫劑為體積比為14:1的二氯甲烷和乙醇的混合溶液， (1% -6% -7% -10% -100% )梯度洗脫；流速為30mL·η?η^經(jīng)過40min的洗脫，可 成功分離得到底物DHEA以及羥化產(chǎn)物7a-〇H_DHEA、7α，15a-diOH-DHEA這3種物質(zhì)。將 分離得到的羥化產(chǎn)物分別用乙酸乙酯進(jìn)行結(jié)晶，可得純度為97. 4%的7a-0H-DHEA2. 97g、 純度為 98%的 7α，15a-diOH-DHEA4. 69g。
[0022] 實(shí)施例2
[0023] 收集底物投料濃度為10g/L，轉(zhuǎn)化率為81. 3%的發(fā)酵液1L于離心杯中，70°C加熱 15min，再放入超聲振蕩儀中超聲15min，超聲功率為480W。后續(xù)步驟同實(shí)施例1，粗提物 的收率可達(dá)到83. 8 %，最終可得到純度為97. 3 %的7a-0H-DHEA2. 62g、純度為98. 2 %的 7α，15a-diOH-DHEA4. 14g。
[0024] 實(shí)施例3
[0025] 收集底物投料濃度為10g/L，轉(zhuǎn)化率為81. 3%的發(fā)酵液1L于離心杯中，添加4% (v/v)的氫氧化鈉-乙醇溶液，混勻后70°C加熱15min，再放入超聲振蕩儀中超聲處理 15min，超聲功率為480W?；旌暇鶆颍?000r·π?η1下離心5min分離上清液和沉淀。沉淀用 等體積的甲醇萃取2遍，上清用等體積的氯仿萃取2遍，合并萃取液。后續(xù)步驟同實(shí)施例1， 粗提物的收率可達(dá)到86 %，最終可得到純度為96. 8 %的7a-0H-DHEA2. 68g、純度為98. 1 % 的 7α，15a-diOH-DHEA4. 25g。
[0026] 實(shí)施例4
[0027] 收集底物投料濃度為10g/L，轉(zhuǎn)化率為81. 3%的發(fā)酵液1L于離心杯中，添加4% (v/v)的氫氧化鈉-乙醇溶液，混勻后70°C加熱15min，再放入超聲振蕩儀中超聲處理 15min，超聲功率為480W。混合均勻，8000r·π?η1下離心5min分離上清液和沉淀。沉淀用 等體積的乙醇萃取η遍，上清用等體積的乙酸乙酯萃取η遍，合并萃取液，后續(xù)步驟同實(shí)施 例1。表3顯示了萃取次數(shù)與粗提物收率的關(guān)系。
[0028] 表3不同萃取次數(shù)對(duì)沉淀和上清的萃取效果比較
[0029]
[0030] 實(shí)施例5
[0031] 收集底物投料濃度為10g/L，轉(zhuǎn)化率為81. 3%的1L發(fā)酵液，以4000r·min1的轉(zhuǎn) 速離心5min分離上清液和沉淀。上清液用1L的乙酸乙酯提取1遍，沉淀先后用1L和0. 6L 丙酮提取，然后將所有丙酮溶液合并，加熱減壓除去有機(jī)溶劑后得到的漿狀物先后用2L和 1L的乙酸乙酯萃取。將所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入20g的無水硫酸鈉去除水。然后 蒸餾除去大部分乙酸乙酯至300ml左右，冷卻后過濾所得固體用10ml預(yù)冷的乙酸乙酯洗 滌得到粗提物，粗提物收率達(dá)87. 8%，后續(xù)步驟同實(shí)施例1。最終可得到純度為96. 3%的 7a-0H-DHEA2. 70g、純度為 98. 4% 的 7α，15a-diOH-DHEA4. 27g。
[0032] 實(shí)施例6
[0033]收集底物投料濃度為10g/L，轉(zhuǎn)化率為81. 3%的發(fā)酵液1L。柱層析時(shí)所用 的洗脫劑為體積比8:1的二氯甲烷和乙醇的混合溶液，其他步驟均同實(shí)施例1。粗 提物收率達(dá)95 %，最終可得到純度為76. 3 %的7a-0H-DHEA2. 65g、純度為80. 4 %的 7α，15a-diOH_DHEA4. 13g。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種7α-羥基-去氫表雄酮和三羥基雄留烯酮的提取分離純化方法，其特征為，所 述的兩種輕化物由赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3_1(保藏號(hào)為CGMCCNo. 4903)輕 基化去氫表雄酮而得。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下： a) 轉(zhuǎn)化結(jié)束后，收集發(fā)酵液，加入體積百分比為1%~10%事先配置的細(xì)胞破碎劑，混 合均勻，60°C~80°C水浴加熱10~20分鐘，超聲處理5~15分鐘； b) 將上述處理后的發(fā)酵液以每分鐘3000~8000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心5~10分鐘，固液分 離，用疏水性有機(jī)溶劑和親水性有機(jī)溶劑分別萃取上清和沉淀，合并萃取后的有機(jī)溶劑，加 入質(zhì)量百分比〇. 3-0. 5%的活性炭進(jìn)行脫色，然用旋轉(zhuǎn)濃縮儀進(jìn)行濃縮，即得到粗提物； c) 將得到的粗提物用甲醇復(fù)溶，利用GraceRevelerisTMFlash色譜系統(tǒng)中的蒸發(fā)光 散射檢測(cè)器檢測(cè)產(chǎn)物和底物的出峰情況，同時(shí)采用外接的硅膠柱進(jìn)行產(chǎn)物的分離純化。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞破碎劑為乙醇-氫氧化鈉溶液。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的乙醇-氫氧化鈉溶液的體積比為 1:1~5:1，其中氫氧化鈉溶液的摩爾濃度是1~5。5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的疏水性有機(jī)溶劑的用量為上清液體 積的至少0. 5倍，親水性有機(jī)溶劑的用量為沉淀體積的至少1倍，萃取次數(shù)至少為2次。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的疏水性有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、 乙酸乙酯、石油醚或正己烷中任意一種，親水性的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙三醇或丙酮中 的任意一種。7. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用GraceRevelerisTMFlash色譜系統(tǒng)的 外接硅膠柱進(jìn)行產(chǎn)物的分離純化時(shí)，所用的洗脫劑是體積比為5:1~16:1的二氯甲烷-甲 醇溶液。8. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的洗脫劑二氯甲烷-甲醇溶液的體積比 為 14:1〇
【專利摘要】本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1轉(zhuǎn)化底物去氫表雄酮的發(fā)酵液中提取并分離純化其羥化產(chǎn)物7α-羥基-去氫表雄酮和三羥基雄甾烯酮的方法。通過先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后固液分離，分別對(duì)上清與沉淀萃取，再合并萃取液濃縮得粗品。將粗品經(jīng)柱層析分離后重結(jié)晶即得純品。最終總收率可達(dá)到91.3％，產(chǎn)物7α-OH-DHEA和7α,15α-diOH-DHEA純度分別可達(dá)97.4％、98％。
【IPC分類】C07J1/00
【公開號(hào)】CN105348350
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510919866
【發(fā)明人】許正宏, 李會(huì), 史勁松, 孫錦
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年12月14日