一種從赤霉菌轉(zhuǎn)化dhea的發(fā)酵液中分離純化其羥化產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從發(fā)酵液中提取分離生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的方 法，即利用赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3-l轉(zhuǎn)化底物去氫表雄酮為7α-羥基-去 氫表雄酮和三羥基雄留烯酮，從其發(fā)酵液中提取分離并純化產(chǎn)物。
【背景技術(shù)】
[0002] 去氫表雄酮（DHEA)是生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，對(duì)生命的代謝活動(dòng)有重要的調(diào) 節(jié)作用，其在生物體內(nèi)能被氧化生成7α-羥基-去氫表雄酮（7a-0H-DHEA)和三羥基雄甾 烯酮（7α，15a-diOH-DHEA)，后者是前者在生物體內(nèi)的進(jìn)一步氧化代謝產(chǎn)物。目前，有研究 發(fā)現(xiàn)7a-0H-DHEA具有增強(qiáng)免疫力，抗糖皮質(zhì)激素和減肥的功效，還對(duì)癌癥和阿爾茨海默 病具有一定的療效；而7α，15a-diOH-DHEA是"第四代"口服避孕藥有效成分屈羅酮的前 體，屈羅酮與低劑量的炔雌醇配伍，是一種新型的女用口服避孕藥稱(chēng)優(yōu)思明，優(yōu)思明自2000 年已成為全球銷(xiāo)量第一的女用口服避孕藥。DHEA的羥基化產(chǎn)物作為具有重要藥理作用和藥 用價(jià)值的留體化合物，應(yīng)用前景十分看好，成為當(dāng)前藥物研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。
[0003] 與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，利用微生物轉(zhuǎn)化DHEA具有反應(yīng)步驟少、選擇性高、條 件溫和、公害少等多種優(yōu)勢(shì)，所以近年來(lái)微生物轉(zhuǎn)化法已成為留體中間體合成的主要趨勢(shì)。 在能轉(zhuǎn)化DHEA的絲狀真菌中，赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3_l具有較好的轉(zhuǎn)化能 力。但是由于微生物轉(zhuǎn)化DHEA的羥化反應(yīng)是在胞內(nèi)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化結(jié)束后產(chǎn)物在胞內(nèi)和胞外都 有分布，利用傳統(tǒng)方法直接進(jìn)行提取，產(chǎn)物有較多的損失。此外，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，考慮到 底物的成本較高，通常會(huì)回收底物再次進(jìn)行投料，因此研究產(chǎn)物的分離提取工藝是十分必 要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種從赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3-1轉(zhuǎn)化底物 DHEA的發(fā)酵液中有效提取并分離其羥化產(chǎn)物的方法，主要針對(duì)粗產(chǎn)物的提取、柱層析分離 和產(chǎn)物結(jié)晶這三個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)改良傳統(tǒng)的產(chǎn)物分離提取工藝，以達(dá)到選擇有效低毒試劑、降低 試劑用量和提高產(chǎn)物收率的目的。
[0005] 本發(fā)明是利用一株赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3-1 (中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4903)轉(zhuǎn)化DHEA為7a-0H-DHEA和 7α，15a-diOH-DHEA。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，為了提高萃取效率，先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后固液 分離，分別對(duì)上清與沉淀萃取，再合并萃取液濃縮得粗品。將粗品經(jīng)柱層析分離后重結(jié)晶即 得純品。
[0006] 本發(fā)明方法其具體步驟如下：
[0007] (1)發(fā)酵液的預(yù)處理：收集轉(zhuǎn)化結(jié)束后的發(fā)酵液，用一定的方法進(jìn)行預(yù)處理。
[0008] (2)產(chǎn)物的粗提：經(jīng)過(guò)步驟（1)中的方法處理后，將發(fā)酵液離心，用等體積的疏 水性有機(jī)溶劑和親水性有機(jī)溶劑分別萃取上清和沉淀。合并萃取后的有機(jī)溶劑，加入 0. 3-0. 5%的活性炭進(jìn)行脫色，然后用旋轉(zhuǎn)濃縮儀進(jìn)行濃縮，即得到粗提物。
[0009] (3)產(chǎn)物的分離：將步驟⑵中得到的粗提物用甲醇復(fù)溶，利用Grace RevelerisTMFlash色譜系統(tǒng)中的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)產(chǎn)物和底物的出峰情況，同時(shí)采 用外接的硅膠柱進(jìn)行產(chǎn)物的分離純化。
[0010] 其中，步驟（1)中涉及到的預(yù)處理方法有1)調(diào)pH處理：取轉(zhuǎn)化液于離心杯中，通 過(guò)酸堿調(diào)節(jié)，分別將轉(zhuǎn)化液的pH值調(diào)節(jié)為3~11?；旌暇鶆颍x心，固液分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)化液 的粗提；2)加熱處理：取轉(zhuǎn)化液于離心杯中，置于60°C~80°C水浴鍋中加熱10~20min。 混合均勻，離心，固液分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)化液的粗提；3)超聲處理：取轉(zhuǎn)化液于離心杯中，放入 超聲振蕩儀中超聲5~20min，超聲功率為480W。混合均勻，離心，固液分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)化液 的粗提；4)化學(xué)破碎法處理：取轉(zhuǎn)化液于潔凈的離心杯中，加入1%~10% (v/v)事先配置 的細(xì)胞破碎劑反應(yīng)5~20min。離心，固液分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)化液的粗提。其中細(xì)胞破碎劑為乙 醇：氫氧化鈉溶液（1M~5M) = 1:1~5:1 (v/v)。表1對(duì)以上預(yù)處理方法的效果進(jìn)行了評(píng) 價(jià)，最終選擇加入體積百分比為1 %~10%事先配置的細(xì)胞破碎劑，混合均勻，60°C~80°C 水浴加熱10~20min，超聲處理5~15min的方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理。
[0011] 表1預(yù)處理效果評(píng)價(jià)
[0012]
[0013] 步驟（2)中所述的疏水性有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚或正己 烷，親水性的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇或丙酮，優(yōu)選乙酸乙酯和乙醇，至少萃取兩遍。表2對(duì)不 同萃取劑的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。用等體積的乙醇和乙酸乙酯分別萃取沉淀和上清各2遍，粗 提物收率可達(dá)到95. 8%。
[0014] 表2不同萃取劑對(duì)沉淀和上清的萃取效果比較
[0015]
[0016] 步驟（3)中利用GraceRevelerisTMFlash色譜系統(tǒng)的外接硅膠柱進(jìn)行產(chǎn)物的分 離純化時(shí)，所用的洗脫劑為氯仿：甲醇（v/v) = 5:1~15:1 ;二氯甲燒：乙醇（v/v) = 5:1~ 15:1 ;氯仿：乙醇（v/v) = 5:1~15:1 ;二氯甲燒：甲醇（v/v) = 5:1~15:1 ;二氯甲燒：乙 醇（v/v) = 5:1~15:1以及70%、90%、100%的乙醇或100%的甲醇，優(yōu)選二氯甲烷：乙醇 (v/v) =15:1。
[0017] 采用本發(fā)明所述的產(chǎn)物分離提取方法，純化總收率可達(dá)到91. 3%，較文獻(xiàn)報(bào)道的 提高了 5 %，產(chǎn)物 7a-0H-DHEA和 7α，15a-diOH-DHEA純度分別可達(dá) 97. 4 %、98 %。同時(shí) 該產(chǎn)物分離提取方法中選擇了較為環(huán)保的乙醇和乙酸乙酯，減少了有毒試劑的使用。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為發(fā)酵液預(yù)處理中采用化學(xué)破碎法時(shí)細(xì)胞破碎劑的添加量對(duì)粗提物收率的 影響。
[0019] 圖2為萃取劑的用量對(duì)沉淀和上清中粗提物收率的影響。
【具體實(shí)施方式】[0020] 實(shí)施例1
[0021] 收集底物投料濃度為10g/L，轉(zhuǎn)化率為81. 3 %的發(fā)酵液1L于離心杯中，添加 4% (v/v)的氫氧化鈉-乙醇溶液，混勻后70°C加熱15min，再放入超聲振蕩儀中超聲處 理15min，超聲功率為480W。混合均勻，8000r·min1下離心5min分離上清液和沉淀。沉 淀用等體積的乙醇萃取2遍，上清先后用1倍體積和0. 5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取