一種用于顯微觀察的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電場(chǎng)生物效應(yīng)研究領(lǐng)域，具體涉及一種用于顯微觀察的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著特高壓直流輸電工程的建設(shè)和居民對(duì)自身所處環(huán)境要求的不斷提高，特高壓直流輸電線產(chǎn)生的電磁場(chǎng)及其健康效應(yīng)備受公眾關(guān)注，關(guān)于特高壓直流輸電技術(shù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定也日益迫切。與交流輸電線傳輸交變電流產(chǎn)生時(shí)變電磁場(chǎng)不同，直流輸電線傳輸穩(wěn)恒電流產(chǎn)生的是0Hz非時(shí)變電場(chǎng)(靜電場(chǎng))。
[0003]目前針對(duì)交流輸變電設(shè)施產(chǎn)生的時(shí)變電磁場(chǎng)和直流輸變電設(shè)施產(chǎn)生的靜磁場(chǎng)生物效應(yīng)，國(guó)內(nèi)外已有大量研究，并在此基礎(chǔ)上制定了相應(yīng)的暴露限值。在直流輸電電場(chǎng)方面，國(guó)內(nèi)外對(duì)其生物效應(yīng)均沒有較為系統(tǒng)的研究，國(guó)際上尚未給出頻率為0Hz非時(shí)變電場(chǎng)(靜電場(chǎng))暴露限值，國(guó)內(nèi)也僅有一行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《±800kV特高壓直流線路電磁環(huán)境參數(shù)限值》(DL/T 1088-2008)作為我國(guó)直流輸電工程電磁環(huán)境評(píng)價(jià)暫行標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)電磁場(chǎng)生物效應(yīng)進(jìn)行客觀準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)是制定環(huán)境電磁暴露標(biāo)準(zhǔn)的前提，因此對(duì)于電磁場(chǎng)生物效應(yīng)的闡明顯得尤為重要。
[0004]電磁場(chǎng)生物效應(yīng)研究主要有流行病學(xué)調(diào)查、人體、動(dòng)物、細(xì)胞、生物物理等層次的研究。電磁場(chǎng)生物效應(yīng)最早是從流行病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)。理論上流行病學(xué)調(diào)查研究揭示環(huán)境電磁場(chǎng)暴露健康危害性的最直接證據(jù)，但由于受到諸多因素的限制，其結(jié)果多有爭(zhēng)議。動(dòng)物水平研究是證實(shí)電磁場(chǎng)暴露與疾病發(fā)生關(guān)系最強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但動(dòng)物本身存在個(gè)體差異，對(duì)電磁場(chǎng)的反應(yīng)敏感性不同，研究結(jié)果的重復(fù)性相對(duì)較差。體外研究(細(xì)胞或分子等)的實(shí)驗(yàn)條件可以嚴(yán)格控制，保證了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，便于從多角度探索電磁場(chǎng)的生物效應(yīng)，雖然不能作為獨(dú)立在體證據(jù)，但還可以回到動(dòng)物或人群實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)已有的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果做出解釋。此外由于細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元，電磁場(chǎng)的生物效應(yīng)將首先作用于細(xì)胞，改變細(xì)胞的生物學(xué)過程和行為，因此利用體外實(shí)驗(yàn)研究電磁場(chǎng)生物效應(yīng)及其作用機(jī)制顯得尤為必要。
[0005]目前，電場(chǎng)效應(yīng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法主要是基于電場(chǎng)暴露后的觀察結(jié)果的組間對(duì)照，但該方法仍很難確認(rèn)電場(chǎng)所引起的細(xì)胞效應(yīng)，尤其是很難排除電場(chǎng)以外的其他外源性干擾因素，如細(xì)胞樣品從培養(yǎng)箱移出瞬間遭受室溫與培養(yǎng)箱之間溫差所致的應(yīng)激反應(yīng)。文獻(xiàn)檢索表明，到目前為止，未見有原位在線觀測(cè)強(qiáng)靜電場(chǎng)暴露下細(xì)胞反應(yīng)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于顯微觀察的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，實(shí)現(xiàn)在強(qiáng)靜電場(chǎng)暴露期間實(shí)時(shí)原位觀察細(xì)胞，最大限度地降低干擾因素，對(duì)認(rèn)識(shí)無擾或低擾狀態(tài)下的靜電場(chǎng)生物效應(yīng)特性具有重要意義。
[0007]—種用于顯微觀察的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括培養(yǎng)箱，所述培養(yǎng)箱頂部設(shè)有蓋體，所述蓋體以及所述培養(yǎng)箱的底板均由透明材料制成，所述蓋體和底板的內(nèi)側(cè)面分別設(shè)有第一導(dǎo)電層和第二導(dǎo)電層，所述第一導(dǎo)電層和第二導(dǎo)電層連接電源的電極，通電后第一導(dǎo)電層與第二導(dǎo)電層之間的空間形成電場(chǎng)；所述培養(yǎng)箱的箱體上還設(shè)有培養(yǎng)液進(jìn)、出口。
[0008]本裝置通過設(shè)置第一導(dǎo)電層和第二導(dǎo)電層形成一個(gè)類似平行板電容器的結(jié)構(gòu)，利用特高壓直流電源施加在兩導(dǎo)電層上的高電壓，使導(dǎo)電層之間形成一個(gè)強(qiáng)靜電場(chǎng)。實(shí)時(shí)觀察處于強(qiáng)靜電場(chǎng)中細(xì)胞的生物學(xué)過程和行為，以此研究電場(chǎng)生物效應(yīng)及其作用機(jī)制。
[0009]所述特高壓直流電源由電源控制器控制，控制直流電源輸出電壓大小和轉(zhuǎn)換正負(fù)輸出極性，從而改變電場(chǎng)強(qiáng)度和方向，此外還可以控制電場(chǎng)暴露的時(shí)間，滿足不同實(shí)驗(yàn)所需。
[0010]將培養(yǎng)箱放置于倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，照明系統(tǒng)的光線應(yīng)該能夠穿過培養(yǎng)箱的頂面和底面，才可觀察到培養(yǎng)箱內(nèi)的活細(xì)胞，因此培養(yǎng)箱的蓋體和底板均為透明的材料制成。
[0011]作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱的蓋體和底板為生物相容性良好的透明絕緣基層，避免因?qū)щ妼拥耐娨饘?duì)人體的傷害。更為優(yōu)選的，透明材料為玻璃、石英或聚二甲基硅氧烷(PDMS) ο
[0012]作為優(yōu)選，所述的第一導(dǎo)電層和第二導(dǎo)電層為生物相容性好的透明導(dǎo)電材料，如石墨稀、ITO透明導(dǎo)電玻璃。由于ITO透明導(dǎo)電玻璃制備費(fèi)用高且導(dǎo)電透光性能不如石墨烯，石墨烯的導(dǎo)電性絕佳，可以作為平行板電容器的導(dǎo)電極板；透光率高，有利于顯微鏡通過石墨烯導(dǎo)電極板觀察細(xì)胞；導(dǎo)熱性能優(yōu)良，有利于維持細(xì)胞培養(yǎng)的溫度；生物相容性好，且有抑菌效應(yīng)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。石墨烯作為導(dǎo)電層厚度適宜，不影響細(xì)胞觀察，因此，更為優(yōu)選的，采用石墨稀。
[0013]第一導(dǎo)電層和第二導(dǎo)電層之間形成空腔，空腔內(nèi)設(shè)有細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，利用箱體上的培養(yǎng)液進(jìn)口栗進(jìn)新鮮的培養(yǎng)液，出口排出培養(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液的更新，使培養(yǎng)箱內(nèi)的細(xì)胞處于穩(wěn)定的靜電場(chǎng)環(huán)境中，最大限度減少了干擾因素。
[0014]細(xì)胞體外培養(yǎng)一般需要37°C ±0.5°C的恒溫條件，作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱下方具有用于承載加熱的透明的加熱板。另一種優(yōu)選的方案，所述培養(yǎng)箱的外部底面設(shè)有透明的加熱膜。更為優(yōu)選，為了便于顯微鏡通過載物臺(tái)透光孔觀察細(xì)胞，所述加熱板或加熱膜設(shè)置在培養(yǎng)箱底面的兩端，避免遮擋住載物臺(tái)透光孔。
[0015]作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)有溫度傳感器，培養(yǎng)箱外具有溫度控制器，溫度控制器接收溫度傳感器的信號(hào)，進(jìn)而控制加熱板或加熱膜工作。
[0016]細(xì)胞培養(yǎng)需要適宜的pH環(huán)境，控制培養(yǎng)箱內(nèi)二氧化碳濃度達(dá)到適宜的pH值，為了維持穩(wěn)定的PH值，培養(yǎng)箱內(nèi)的二氧化碳濃度維持了 2?10%之間。作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱的箱體上設(shè)有二氧化碳進(jìn)、出口，二氧化碳進(jìn)口連接氣源。
[0017]二氧化碳進(jìn)口與二氧化碳?xì)怏w罐相連，進(jìn)氣量由二氧化碳濃度控制器控制。作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)有PH監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)，培養(yǎng)箱外具有二氧化碳濃度控制器，二氧化碳濃度控制器接收PH監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)的監(jiān)測(cè)信號(hào)，進(jìn)而控制氣源供氣。
[0018]作為優(yōu)選，培養(yǎng)液進(jìn)口、培養(yǎng)液出口設(shè)于培養(yǎng)箱相對(duì)的兩側(cè)。培養(yǎng)液從進(jìn)口栗入培養(yǎng)箱，經(jīng)過整個(gè)底面再由出口排出，保證培養(yǎng)液的充分利用。
[0019]本裝置利用恒流栗控制培養(yǎng)液的進(jìn)液和出液，因?yàn)楹懔骼踺斔鸵后w流量穩(wěn)定，保證灌注的穩(wěn)定性，減少培養(yǎng)液流動(dòng)帶來的擾動(dòng)，控制恒流栗運(yùn)轉(zhuǎn)速率達(dá)到進(jìn)出液平衡，使培養(yǎng)箱內(nèi)各處培養(yǎng)液的高度穩(wěn)定。嚴(yán)格控制培養(yǎng)液液面高度防止培養(yǎng)液充滿兩導(dǎo)電層之間的空腔，否則將導(dǎo)致兩導(dǎo)電層間短路，進(jìn)一步導(dǎo)致通電電流流過細(xì)胞，達(dá)不到本發(fā)明對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)靜電場(chǎng)暴露的目的。
[0020]為了使第一導(dǎo)電層和第二導(dǎo)電層之間形成強(qiáng)靜電場(chǎng)，兩導(dǎo)電層之間間距在不接觸培養(yǎng)液的前提下應(yīng)該盡可能的小。處于兩導(dǎo)電層之間的培養(yǎng)液的高度應(yīng)控制在1.5?2倍細(xì)胞直徑與培養(yǎng)箱底板內(nèi)壁的粗糙度之和，一般要求粗糙度為< 0.1mm。
[0021]作為優(yōu)選，所述底板的內(nèi)面上設(shè)有隔板，隔板將底板上方的空間分為進(jìn)料緩沖區(qū)、培養(yǎng)區(qū)和出料緩沖區(qū)三部分，培養(yǎng)區(qū)位于中間位置，進(jìn)料緩沖區(qū)和出料緩沖區(qū)分別靠近培養(yǎng)液進(jìn)口和培養(yǎng)液出口。
[0022]所述隔板的高度略大于培養(yǎng)液高度，隔板可以防止培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的細(xì)胞游離到培養(yǎng)箱的兩端，保證細(xì)胞位于中間位置利于顯微觀察。
[0023]更為優(yōu)選，所述進(jìn)料緩沖區(qū)和出料緩沖區(qū)均設(shè)有兩塊隔板，隔板上具有供培養(yǎng)液通過的缺口，相鄰隔板之間的缺口相錯(cuò)開。隔板分布數(shù)量與間距適宜，隔板上缺口的尺寸與數(shù)量適宜，缺口相互錯(cuò)位的設(shè)置引導(dǎo)培養(yǎng)液緩慢流過細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，減少培養(yǎng)液流動(dòng)帶來的擾動(dòng)影響。
[0024]作為優(yōu)選，所述蓋體與培養(yǎng)箱的開口之間設(shè)有密封圈。蓋體通過密封圈與培養(yǎng)箱箱體扣合形成密封腔室，使培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞處于相對(duì)封閉穩(wěn)定的靜電場(chǎng)環(huán)境中，有利于客觀評(píng)價(jià)靜電場(chǎng)生物效應(yīng)。
[0025]作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱底板內(nèi)側(cè)面的第二導(dǎo)電層通過與接地導(dǎo)線相連接地。防止意外情況下培養(yǎng)箱通電時(shí)強(qiáng)電流通過人體，以保證人體安全。
[0026]作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)箱體相對(duì)的兩側(cè)面外壁設(shè)置導(dǎo)電層，通過在兩導(dǎo)電層上施加直流高壓電，在