超聲微泡介導(dǎo)的siRNA干擾GRK4在靶向調(diào)節(jié)尿鈉排泄及血壓水平中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，超聲微泡介導(dǎo)的SiRNA干擾G服4在祀向調(diào)節(jié)尿鋼 排泄及血壓水平中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 高血壓及其并發(fā)癥正成為影響人民健康的主要原因。腎臟是負(fù)責(zé)尿鋼排泄的重要 器官，在高血壓研究中得到普遍重視。在血壓調(diào)控的眾多因素中，G蛋白偶聯(lián)受體激酶4佑 protein-coupledrec巧torkinases4,G服4)近年來尤其引人關(guān)注。首先，G服4定位于染 色體的4pl6. 3,運(yùn)一區(qū)域被認(rèn)為與人類原發(fā)性高血壓的發(fā)病具有密切關(guān)系；而GRK4已知的 多個SNPs位點(diǎn)也與高血壓的發(fā)病具有直接關(guān)聯(lián)。其次，不同于G服家族其他成員，如G服2、 G服3、G服5和G服6的廣泛組織表達(dá)，G服4的組織表達(dá)具有特異性，前期研究發(fā)現(xiàn)G服4特異 性的在腎臟、睪丸、子宮肌層和血管等有限組織中表達(dá)。更為重要的是，G服4可通過憐酸化 相應(yīng)G蛋白偶聯(lián)受體，改變相應(yīng)受體的功能，比如：增加引起水鋼滯留的血管緊張素II受體 I(ATiR)增加，并引起運(yùn)些受體的憐酸化水平改變，進(jìn)而使受體介導(dǎo)的腎臟排鋼利尿受損/ 水鋼滯留效應(yīng)增強(qiáng)，從而引起血壓升高。G服4活性增高是眾多受體功能異常的原因，因此， G服4已經(jīng)成為高血壓治療關(guān)注的新祀點(diǎn)。如何有效抑制G服4的活性及效應(yīng)已成為高血壓 研究與治療領(lǐng)域的新的熱點(diǎn)。
[0003] 隨著人類基因組學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，與治療相關(guān)的基因、受體、配體等被大量 發(fā)現(xiàn)，基因治療高血壓正逐漸成為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。如何將目的基因安全、有效、祀 向性地導(dǎo)入體內(nèi)特定器官、組織，并在祀細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)是目前亟待解決的主要難題之一。 目前基因轉(zhuǎn)染方法可分為=類：（1)生物法：主要指病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染；（2)化學(xué)法： 包括憐酸鹽沉淀、脂質(zhì)體包埋等；（3)物理法：包括電穿孔、裸露DNA直接注射等。其中，病毒 載體具有較高基因轉(zhuǎn)染效率，但存在免疫原性及與宿主細(xì)胞整合的潛在危險(xiǎn)，其安全性及 免疫原性所致的不良后果令人擔(dān)憂。脂質(zhì)體包埋等方法具有低毒、低免疫原反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，但 有基因轉(zhuǎn)染效率低、基因不能長期穩(wěn)定表達(dá)等不足。電穿孔等物理方法對組織損傷大，且安 全參數(shù)難W確定。相比較而言，超聲介導(dǎo)微泡破裂技術(shù)既安全又高效，應(yīng)用前景令人期待。 具體地，超聲介導(dǎo)微泡破裂（ultrasound-targetedmicrobubbledestruction,UTMD)技術(shù) 是將載有目的基因的微泡造影劑經(jīng)靜脈注射后，在祀組織給予一定條件的超聲照射，引起 微血管損傷，使血管內(nèi)的微泡破裂并釋放基因，同時(shí)產(chǎn)生"空化效應(yīng)"和"聲孔效應(yīng)"，使毛細(xì) 血管穿透性及細(xì)胞膜通透性增加，從而促進(jìn)釋放基因大量進(jìn)入祀細(xì)胞，使微泡或釋放的基 因能夠進(jìn)入血管壁及組織間隙，進(jìn)而發(fā)揮祀向治療作用。研究表明，聯(lián)合使用超聲照射和微 泡可明顯提高基因的轉(zhuǎn)染率。超聲微泡技術(shù)具有3個特點(diǎn)：（1)安全性：超聲造影劑是一種 高濃度微泡的混懸液，對人體無毒副作用；(2)祀向傳輸：采用治療性超聲或診斷性超聲進(jìn) 行照射，使微泡崩塌破裂后，祀向釋放出所攜帶的基因；（3)促滲透作用：微泡破裂會產(chǎn)生 空化效應(yīng)，導(dǎo)致膜通透性一過性升高，產(chǎn)生的微射流等可促進(jìn)藥物或基因運(yùn)輸。正是上述突 出優(yōu)點(diǎn)，使得超聲微泡技術(shù)顯得格外引人關(guān)注。
[0004] 在超聲微泡技術(shù)中，微泡是超聲祀向造影劑的主要成分，包括外殼和內(nèi)充氣體。新 型微泡內(nèi)充氣體W六氣化硫、氣碳、氮等高分子惰性氣體為主；包裹微氣泡的外殼主要有脂 類、白蛋白類、多聚體類及表面活性劑類，可增加微泡穩(wěn)定性，延長在血液循環(huán)系統(tǒng)中的停 留時(shí)間。近年來，在屯、血管疾病、糖尿病腎病或腎腫瘤中均有關(guān)于超聲微泡介導(dǎo)的祀向治 療，但是在腎臟尿鋼代謝W及高血壓研究領(lǐng)域中，超聲微泡技術(shù)介導(dǎo)的基因治療的應(yīng)用尚 未見報(bào)道。 陽0化]RNA干擾（RNA inte計(jì)ering，RNAU可^高效的抑制特定基因，因其毒性較低，在 基因治療研究中具有重要地位，技術(shù)也日趨成熟。SiRNA(small inte計(jì)ering RNA，SiRNA) 是RNAi作用的中屯、環(huán)節(jié)和效應(yīng)分子。SiRNA的作用是W同源互補(bǔ)序列的mRNA為祀目標(biāo)，促 使mRNA降解，可W高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，誘導(dǎo)基因沉默效應(yīng)。依照此原理， 針對目標(biāo)基因的信使RNA，設(shè)計(jì)并合成特異性SiRNA,可W封閉特定基因的表達(dá)。與其他基 因一樣，SiRNA要成功運(yùn)輸，需經(jīng)歷3個階段：細(xì)胞外運(yùn)輸、細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。到目前 為止，在腎臟中尚未見利用SiRNA技術(shù)針對GRK4進(jìn)行干擾，進(jìn)而改變腎臟尿鋼排泄水平的 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種超聲微泡介導(dǎo)的SiRNA干擾G服4在祀向調(diào) 節(jié)尿鋼排泄及血壓水平中的應(yīng)用，通過SiRNA干擾有效抑制腎臟G服4的表達(dá)，進(jìn)而改變腎 臟尿鋼排泄水平，降低血壓。
[0007] 本發(fā)明采取W下技術(shù)方案：
[0008] 1、一 種SiRNA分子，序列為 5, -ccuguauucuuagaccaaa化化-3,、 5' -ggcugucug曰imimug曰曰曰dtdt-3' 或 5' -gg曰g曰g曰gcuccug曰曰guudtdt-3'。
[0009] 優(yōu)選的，序列為 5, -ccuguauu州uagaccaaa化化_3,。
[0010] 需要說明的是，序列中，a、U、C、g為核糖核酸，t為脫氧核糖核酸，d即表示所述核 酸為脫氧核糖核酸。
[0011] 2、上述SiRNA分子在制備預(yù)防或治療高血壓的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選的，所述SiRNA祀向干擾G蛋白偶聯(lián)受體激酶4。
[0013] 優(yōu)選的，SiRNA通過超聲微泡攜帶。
[0014] 優(yōu)選的，所述超聲微泡為脂類微泡。
[0015] 優(yōu)選的，所述超聲微泡為脂膜微泡"脂氣顯"，核屯、氣體為全氣丙烷，微泡平均粒徑 2ym，微泡濃度為4X1〇9~9X10 7ml。
[0016] 優(yōu)選的，所述超聲微泡先吸附一層多聚賴氨酸，再吸附siRNA。
[0017] 3、SiRNA分子在制備調(diào)節(jié)尿鋼和/或尿量排泄的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明采用超聲微泡技術(shù)攜帶SiRNA至腎臟特異性破 裂，有效抑制腎臟GRK4表達(dá)，增加尿鋼和尿量排泄，實(shí)現(xiàn)祀向預(yù)防和治療高血壓的目的。相 對于蛋白等其它材料來說，脂類微泡不會因高熱而變性，回聲性更強(qiáng)且易制備，其分子層的 可變性有利于特異性配體的偶聯(lián)。超聲微泡造影劑是一種良好的基因載體，與病毒載體相 比容量更大，可W攜帶寡反義核巧酸、DNA片段、甚至整個染色體，因此，在微泡上連接特異 性祀向配體或抗體構(gòu)建超聲祀向微泡，使微泡和祀器官之間結(jié)合更緊密，能更進(jìn)一步提高 基因轉(zhuǎn)染率，同時(shí)可減少對正常細(xì)胞、組織或血管的損害，并且在體內(nèi)循環(huán)中更為穩(wěn)定。
[0019]SiRNA技術(shù)能夠克服反義寡核巧酸技術(shù)穩(wěn)定性較差、轉(zhuǎn)移系統(tǒng)對反義核酸的吸收 率較低、易引起毒性的缺陷，可W特異性剔除或降低特定基因的表達(dá)，具有高特異性（SiRNA 具有嚴(yán)格的序列特異性，其識別可精確到一個核巧酸）、高效性（只需少量SiRNA就可使作 用的編碼基因產(chǎn)物顯著下降）、高細(xì)胞穿透性（SiRNA抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可W跨越細(xì)胞界 限在不同的細(xì)胞間進(jìn)行傳遞）等特點(diǎn)，已成為祀向基因治療的有力工具。
【附圖說明】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0021] 圖1巧光酶標(biāo)儀驗(yàn)證微泡包裹SiRNA,橫坐標(biāo)的"+ "代表加入了微泡，代表沒 有加入微泡；縱坐標(biāo)表示懸浮于液面的微泡的巧光值占總液體巧光值的比重。
[0022] 圖2是3對不同的SiRNA對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟近曲小管細(xì)胞中G服4的mRNA 表達(dá)的干擾結(jié)果比較，1、2、3分別代表1-3號引物，效果最好的是1號引物。 陽02引圖3超聲微泡介導(dǎo)G服4siRNA(3號引物）干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠后，其腎臟G服4 表達(dá)結(jié)果。
[0024] 圖4超聲微泡介導(dǎo)SiRNA干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟G服4表達(dá)后，24小時(shí)尿量隨 時(shí)間的變化結(jié)果。 陽0巧]圖5超聲微泡介導(dǎo)SiRNA干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟G服4表達(dá)后，尿鋼排泄率隨 時(shí)間的變化