一種編碼缺刻緣綠藻δ9脂肪酸去飽和酶的dna序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種編碼缺刻緣綠 藻A9脂肪酸去飽和酶的DNA序列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物體中存在著大量的多不飽和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid，PUFA)， 這些PUFA對(duì)于維持生物體正常的生理功能具有重要作用，根據(jù)從甲基端第一個(gè)雙鍵開(kāi)始 的位置可以將PUFA分為ω-3系和ω-6系。在ω-6系PUFA中，花生四烯酸（arachidonic acid，C20:4A5's'n'14,AA)是最具代表性的脂肪酸之一。AA屬人體必需脂肪酸，是機(jī)體中具 有重要生理作用的20碳多烯衍生物的前體，如前列腺素E2、前列環(huán)素和白三烯等。AA還是 一種重要的營(yíng)養(yǎng)食品，在大腦和視力發(fā)育方面具有特殊作用，因此被廣泛添加到嬰幼兒食 品配方中。此外，AA還是一種高檔化妝品原料，將其添加到一些美容護(hù)膚用品及美發(fā)用品 中，可以起到保持皮膚濕潤(rùn)、延緩皮膚衰老及預(yù)防和治療脫發(fā)的功效。
[0003] AA的傳統(tǒng)來(lái)源是海洋魚(yú)油和動(dòng)物臟器。但動(dòng)物組織中AA含量很低，約為0. 2%和 0. 5%，用這種方法制備的AA價(jià)格昂貴，難以滿(mǎn)足市場(chǎng)的需要。近年來(lái)國(guó)外開(kāi)始以微生物為 原料生產(chǎn)AA，例如，高山被孢霉（Mortierallaalpina)的一個(gè)商業(yè)性菌株1S-4已被用于工 業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)AA。而缺刻緣綠藻（MyrmeciaincisaReisigl)的發(fā)現(xiàn)，為利用光生物反應(yīng) 器大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)AA提供了新的思路。
[0004] 缺刻緣綠藻是單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門(mén)、Trebouxiophyceae綱，細(xì)胞常聚集在一起 形成類(lèi)似非定形群體的細(xì)胞團(tuán)。研究發(fā)現(xiàn)該藻含有大量的AA，尤其在氮饑餓條件下，其含量 能達(dá)到藻體總脂肪酸含量的60%。
[0005] 在缺刻緣綠藻等微藻中，AA的合成往往是從飽和脂肪酸開(kāi)始，即由硬脂酸向油酸 轉(zhuǎn)化，該步驟是由A9FAD催化，在硬脂酸的C9和C10之間引入第一個(gè)不飽和的雙鍵，生成 油酸。之后，油酸沿著ω-6途徑，再在Δ12、Δ6及Δ5等一系列FAD以及Δ6脂肪酸延長(zhǎng) 酶的作用下，最終合成AA。由此可見(jiàn)，由A9FAD將硬脂酸去飽和生成油酸是AA合成的關(guān)鍵 一步。
[0006] 克隆和鑒定獲得缺刻緣綠藻A9FAD編碼基因?qū)τ谠谥参矬w中進(jìn)行遺傳操作，以 實(shí)現(xiàn)PUFA的高效合成具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種多肽。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種分離的核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種重組表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種基因工程化的宿主細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述 的重組表達(dá)載體、或如上所述的宿主細(xì)胞的用途。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0013] -種多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDN0. 15的第62-432位或SEQID NO. 15所示。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0015] -種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列包括：
[0016] a)SEQIDN0. 3 的第 341bp至第 1453bp、SEQIDN0. 3 的第 158bp至第 1453bp、 SEQIDNO. 3或SEQIDNO. 12所示的核苷酸序列；或
[0017] b)與a)所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0019] -種重組表達(dá)載體，所述的重組表達(dá)載體是由如上所述的核苷酸序列與質(zhì)?；虿?毒所構(gòu)建的重組表達(dá)載體。
[0020] 作為本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】，所述的質(zhì)粒是pYES2質(zhì)粒。
[0021] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0022] -種基因工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞選自于下列中的一種：
[0023] a)用如上所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；
[0024] b)用如上所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
[0025] 作為本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】，所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì) 胞或動(dòng)物細(xì)胞。
[0026] 作為本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】，所述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
[0027] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0028] 如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重組表達(dá)載體、或如上所述 的宿主細(xì)胞在合成多不飽和脂肪酸中的用途。
[0029] 如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重組表達(dá)載體、或如上所述 的宿主細(xì)胞在將棕櫚酸去飽和為棕櫚油酸或?qū)⒂仓崛ワ柡蜑橛退嶂械挠猛尽?br>[0030] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0031] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組高通量數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，獲得1條與已知物種 Δ9FAD基因同源的contig序列（Contigl6329)，并由此設(shè)計(jì)引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增 技術(shù)（RACE)克隆獲得缺刻緣綠藻A9FAD基因的全長(zhǎng)序列。在油酸合成缺陷型olel突變株 的釀酒酵母中異源表達(dá)該基因去葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的0RF，對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸進(jìn)行GC-MS 分析，在該轉(zhuǎn)基因突變株酵母中檢測(cè)到新產(chǎn)生的物質(zhì)一一棕櫚油酸和油酸，從而證明該基 因所編碼的蛋白具有A9FAD的功能，且去飽和效率高。本發(fā)明為在植物體中進(jìn)行遺傳操 作，以實(shí)現(xiàn)PUFA的高效合成創(chuàng)造了條件。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1.Δ9FAD基因cDNA與DNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（A)及其基因結(jié)構(gòu)（B)。泳道 M:DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 :5 ^ -RACE末端產(chǎn)物；泳道2 :3 ^ -RACE末端產(chǎn)物；泳道3 到6 :分別是利用引物對(duì)Seq4和Seq5、Seq6和Seq7、Seq8和Seq9及Seq10和Seq 11進(jìn)行基因DNA序列的擴(kuò)增產(chǎn)物?；揖€和黑線分別為UTR及內(nèi)含子，黑框?yàn)橥怙@子。
[0033]圖2. pMD19_T載體圖譜。
[0034] 圖3. pYES2載體圖譜。
[0035] 圖4.酵母脂肪酸成分的氣相色譜和GC-MS圖譜。A:氣相色譜圖；B、C:分別為圖 A-c中自左至右出現(xiàn)兩個(gè)新物質(zhì)峰的MS圖譜。a:〇lel突變型對(duì)照組；b:轉(zhuǎn)空載體對(duì)照組； c:轉(zhuǎn)缺刻緣綠藻Δ9FAD基因的酵母Υ-Δ9FAD。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 本發(fā)明所采用的主要操作包括：
[0039] 1)缺刻緣綠藻在溫度為25°C、光照強(qiáng)度為115μπι〇1m^1的條件下，于BG-11培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，光周期為光照14h:黑暗10h，每天不定期地?fù)u晃。收集藻細(xì)胞，提取RNA和 DNA〇
[0040] 2)通過(guò)對(duì)缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組高通量數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，獲得1條contig序列 (Contigl6329)，根據(jù)這條序列設(shè)計(jì)基因特異引物Seq1和Seq2,利用Clontech公司RACE 技術(shù)，分別進(jìn)行5'-端和3'-端片段擴(kuò)增?；厥者@兩片段并克隆到pMD19-T上，然后轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選與測(cè)序后，與原contig序列拼接并經(jīng)過(guò)重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)與測(cè)序驗(yàn)證，得到A9FAD基因cDNA的全長(zhǎng)序列（Seq3)。
[0041] 3)對(duì)獲得的Δ9FAD基因cDNA全長(zhǎng)序列（Seq3)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其開(kāi) 放閱讀框（0RF)為1299bp，根據(jù)cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)四對(duì)基因特異引物Seq4和Seq5、Seq 6和Seq7、Seq8和Seq9及Seq10和Seq11，擴(kuò)增內(nèi)含子?；厥誔CR產(chǎn)物，按上述方法 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證并與原序列拼接，得到A9FAD基因的DNA序列（Seq12)。
[0042] 4)通過(guò)生物信息學(xué)分析可知，Δ 9FAD基因0RF所編碼蛋白序列在其氨基端存在1 個(gè)由61個(gè)氨基酸組成的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。