一株對柑橘木虱具強致病力的宛氏擬青霉菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一株對相橘木風具強致病力的宛氏擬青 霉菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 相橘黃龍病是相橘產(chǎn)業(yè)上最具毀滅性的病害，能侵染各種相橘類植物，尚無有效 的治療性藥劑，也沒有抗（耐）病品種可供應(yīng)用，當前相橘黃龍病正在全球相橘種植區(qū)逐步 蔓延，是世界相橘產(chǎn)業(yè)的重大威脅。相橘木風值iaphorinacitrikuwayamae)屬同翅目木 風科，主要危害九里香和相橘等蕓香科植物，成蟲及若蟲群集在新梢吸食汁液，被危害的嫩 梢、嫩芽萎縮枯干，新葉崎形易脫落，嚴重影響植物生長，是相橘上的重要害蟲之一。相橘木 風是黃龍病的唯一傳播蟲媒，相橘木風的頻繁發(fā)生是相橘黃龍病流行的重要因素。截至目 前，防控相橘黃龍病尚缺乏抗性品種和特效藥劑，徹底地控制相橘木風是預防相橘黃龍病 的前提和基礎(chǔ)，大面積范圍內(nèi)嚴格控制相橘木風是黃龍病綜合防治的最重要保障。
[0003] 目前對于相橘木風的防治多采用化學防治措施，然而化學農(nóng)藥的頻繁使用造成了 農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、天敵昆蟲大量死亡、生物多樣性被破壞W及昆蟲產(chǎn)生抗藥性等諸多問 題，而生物防治W其綠色、環(huán)保、持效、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點被人們認為是最有效 和最具應(yīng)用前景的防治手段。
[0004] 據(jù)文獻報道，在昆蟲病原微生物中，真菌種類最多，約占昆蟲病原微生物種 類的60%W上，并且昆蟲病原真菌有著顯著的流行潛力和生產(chǎn)的便利性，利用昆蟲 病原真菌防治相橘木風有著巨大的發(fā)展空間。國外已有利用球抱白僵菌Beauveria bassiana度alsamo)Vuillemin、玫煙色棒束抱Isariafumosorosea(Wize)Brownet Smith、枯形被毛抱HirsutellacitriformisSpeare、蠟階輪枝菌Lecanicillium lecanii狂immermann)Viegas和綠僵菌Metarhiziumanisopliae(Metchnikoff)Sorokin 防治相橘木風的報道，但國內(nèi)迄今為止，只有張燕敬等開展了利用胡瓜純緩蛾搭載白僵菌 控制相橘木風的試驗研究。因此，進一步分離篩選對相橘木風具有強致病力的蟲生真菌，深 入研究其生防潛能，對于促進未來相橘木風的生物防治具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一株對相橘木風具 強致病力的宛氏擬青霉菌株。該菌株對相橘木風具有強致病力，具有被開發(fā)為生物農(nóng)藥的 潛能，在相橘木風的生物防治方面擁有良好的市場應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的宛氏擬青霉菌株的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 一株對相橘木風具強致病力的宛氏擬青霉（Paecilomycesvariotii)，菌種命名 為GZMS-11，從廣東省廣州市天河區(qū)的九里香（Murrayapaniculata)上采集的相橘木風蟲 體上分離獲得的。
[0009] 所述的宛氏擬青霉（PaecilomycesvariotiijGZMS-ll的保藏單位：中國典型培 養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，保藏日期：2015年10月29日，保藏地址：中國.武漢.武漢大學， 保藏編號：CCTCCNO:Μ2015651。
[0010] 所述的宛氏擬青霉（Paecilomycesva;riotii)GZMS-ll在防控相橘黃龍病蟲媒中 的應(yīng)用，W及在制備用于防治相橘木風的生物農(nóng)藥中的應(yīng)用，菌株GZMS-11的分生抱子懸 浮液對相橘木風具有強致病力。
[0011] 所述的宛氏擬青霉（Paecilomycesva;riotii)GZMS-ll，其形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、 口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列和菌種分類結(jié)果如下：
[0012] 1、菌株GZMS-11的形態(tài)特征：菌株GZMS-11在馬鈴馨葡萄糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基生 長良好，27°C下培養(yǎng)lOd其菌落直徑可達5. 86cm。在PDA平板上菌落圓形、蓬松狀，起初菌 落白色，后期呈黃褐色，邊緣白色。培養(yǎng)lOd的菌落正面為黃褐色棉絮狀，菌落背面呈暗褐 色。菌株培養(yǎng)3~4d即產(chǎn)生黃褐色色素，色素擴散至培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)。菌絲細長、分隔，分生 抱子梗上生出單個瓶?；蚨鄠€瓶梗，形成靑狀枝。瓶梗大小2. 5~3. 5X15~20μm，細長 漸尖，稍彎曲，瓶梗著生卵圓形抱子，分生抱子大小5. 5~7. 5X2. 5~3. 5μm。 陽01引 2、菌株GZMS-11的口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列：測序所得菌株GZMS-11的 口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列如沈QIDNO:1所示，利用NCBIBlast進行比對分析發(fā)現(xiàn)， 所測序列與GenBank中宛氏擬青霉（PaecilomycesvariotU)的多個菌株（AY904061.1、 FJ895878. 1、JN798498. 1、AY753335. 1 等）的序列相似性高達 97 ~99 %。
[0014] 3、菌株GZMS-11的菌種分類結(jié)果：根據(jù)W上關(guān)于菌株GZMS-11的形態(tài)特征及 口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列特征，可將菌株GZMS-11鑒定為子囊菌口（Ascomycota)盤菌亞 口（Pezizomycotina)散囊菌綱巧urotiomycetes)散囊菌亞綱巧urotiomycetidae)散囊 菌目巧urotiales)嗜熱子囊菌科（Thermoascaceae)絲衣霉屬度yssochlamys)的宛氏擬 青霉（Paecilomycesvariotii)。
[0015] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0016] (1)目前國內(nèi)外尚未見宛氏擬青霉作為生物農(nóng)藥進行應(yīng)用的報道，本發(fā)明提供的 宛氏擬青霉（Paecilomycesvariotii)菌株GZMS-11是從廣東省廣州市天河區(qū)的九里香上 采集的相橘木風蟲體上分離獲得的，經(jīng)測定菌株GZMS-11對相橘木風具有強的致病力。
[0017] (2)本發(fā)明所述的宛氏擬青霉菌株GZMS-11是一種昆蟲病原真菌，其分生抱子懸 浮液可直接作用于相橘木風，較目前防治相橘木風的化學藥劑相比，具有高效、綠色、環(huán)保、 持效性強和不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點，對環(huán)境無污染、無殘留；
[0018] (3)菌株GZMS-11生長速度快，產(chǎn)抱量大，抱子萌發(fā)率高，易于制備。菌株GZMS-11 在被開發(fā)為生防菌制劑用于相橘木風的生物防治上，具有良好的市場應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1是菌株GZMS-11在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)lOd后的菌落特征。
[0020] 圖2是菌株GZMS-11的抱子形態(tài)。
[0021] 圖3是菌株GZMS-11的分生抱子梗形態(tài)。
[0022] 圖4是試驗處理3d后菌株GZMS-11對相橘木風的侵染情況。
[0023] 圖5是試驗處理7d后菌株GZMS-11對相橘木風的侵染情況。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[002引所述的宛氏擬青霉（PaecilomycesvariotiUGZMS-ll的保藏單位：中國典型培 養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，保藏日期：2015年10月29日，保藏地址：中國.武漢.武漢大學， 保藏編號：CCTCCNO:Μ2015651。
[00%] 實施例1相橘木風病原菌的分離和篩選
[0027] (1)病原菌的分離純化
[0028] 從廣東省廣州市天河區(qū)的九里香上采集罹病的相橘木風，在實驗室超凈工作臺中 進行操作。先將相橘木風放于70%乙醇中浸泡30s，再經(jīng)過0. 1 %升隸浸泡Imin，最后用無 菌水沖洗3次。用無菌濾紙吸干蟲體上的水分，然后將其放于馬鈴馨葡萄糖瓊脂（PDA)培 養(yǎng)基（配制方法為：稱取200g馬鈴馨，洗凈去皮切碎，加水lOOOmL煮沸20~30min，兩層 紗布過濾，再加20g葡萄糖和15g瓊脂，充分溶解后補水至lOOOmU分裝至錐形瓶中，12rC， 高壓滅菌20min)中。
[0029] 將培養(yǎng)皿置于微生物培養(yǎng)箱中27Γ恒溫培養(yǎng)，至蟲體周圍長出菌絲后，挑取菌絲 轉(zhuǎn)至新的PDA平板上培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)lOd左右，待菌落上產(chǎn)生分生抱子，用無菌水洗脫分生 抱子制備成分生抱子懸浮液，然后參照《植病研究方法》中所述的稀釋純化法（方中達.植 病研究方法（第Ξ版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998:122-140)對病原菌進行單抱分 離。最后將分離純化獲得的菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d左右，置于4°C冰箱保 存。
[0030] 似致病菌的篩選
[0031] 將上述分離純化保存的菌株接種到PDA平板上，于27°C恒溫培養(yǎng)lOd左右后，W 無菌水洗脫菌落上產(chǎn)生的分生抱子，制備獲得分生抱子懸浮液，向其中加入適量的吐溫-80 至終濃度為0. 1% (v/v)。取養(yǎng)蟲籠內(nèi)飼養(yǎng)的25頭健康相橘木風成蟲浸沒于含0. 1% (V/ V)吐溫-80的分生抱子懸浮液中10~15s，挑取處理后仍能自由活動的相橘木風置于培養(yǎng) 皿中的九里香葉片上，培養(yǎng)皿底部鋪有兩層用無菌水浸濕的濾紙，其上放置一個帶10個左 右葉片的九里香嫩枝，枝條底端W無菌水浸濕的脫脂棉包裹，然后放于27 + 0. 5°C光照培養(yǎng) 箱中化：D= 14:10,RH〉90% )培養(yǎng)，同時設(shè)立含0. 1% (v/v)吐溫-80的無菌水處理相橘 木風