一種苜蓿褐斑病的鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及苜蓿栽培領域，具體涉及一種苜蓿褐斑病的鑒定方法。
【背景技術】
[0002]苜蓿是優(yōu)良的豆科牧草，種植范圍廣泛，褐斑病是我國苜蓿的重要病害，嚴重影響苜蓿的產草量和品質。鑒定和評價苜蓿對褐斑病的抗病性，是培育和利用抗病品種防治苜蓿褐斑病的基礎?？共⌒澡b定中最難解決的一個問題是如何提高大批量篩選的效率。

【發(fā)明內容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種苜蓿褐斑病的鑒定方法，通過合理的培育接種方法，以及合理的培養(yǎng)基配方，提高了鑒定的效率，且可用于大批量的篩選。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為:
[0005]—種苜蓿褐斑病的鑒定方法，包括如下步驟:
[0006]S1、分別選取帶典型病斑的葉片，樣品表面用清水沖洗干凈后在病斑的病健交界處剪取3.5mmX 3.5mm的組織塊，置于無菌工作臺中依次用含有0.7-1.1 %的青霉素或鏈霉素的去離子水浸洗4-6s，用含有0.025%的升汞和0.15?0.25%吐溫混合液浸泡2?5min，用無菌水清洗5?8次，取出后用滅菌的吸水紙吸去多余的水分；
[0007]S2、將所得的組織塊置于培養(yǎng)基上，于20_30°C恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，36_72h后形成菌落，切取典型菌落邊緣的菌絲塊，轉移到新的PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得分離物；
[0008]S3、將所得的分離物在PDA培養(yǎng)基平臺上培養(yǎng)7-10d后，用40?60mL無菌水洗滌，過濾后，得孢子懸浮液；
[0009]S4、取苜蓿的葉子，去掉葉柄，沖洗滅菌處理后，切成小塊置于含有50 μπι/mL苯駢咪唑的0.3%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天；
[0010]S4、選取生長正常狀態(tài)良好的葉子平鋪與培養(yǎng)皿上，用大頭針輕輕刺傷葉面后，將步驟S3所得的孢子懸浮液滴于刺傷處，在相對濕度接近100%，溫度20°C，無光照的條件下，接種20h ；
[0011 ] S5、接種結束后，轉移至生長箱內培養(yǎng)，光強度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光時培養(yǎng)溫度為22°C，無光時培養(yǎng)溫度為18°C，每天觀察記錄侵染及病害發(fā)展情況。
[0012]其中，所述步驟S2中的培養(yǎng)基的配方為:稀釋O?4倍的有機物、葡萄糖濃度為O?20g/L、NH4N03濃度為O?2.5g/L、pH為4.0?8.0、瓊脂濃度為10?30g/L。
[0013]其中，所述有機物包括鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、環(huán)己六醇 27mg/L。
[0014]其中，所述步驟S2中新的PDA平板培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質、COD及其金屬離子，營養(yǎng)物質包括氮、磷、碳，金屬離子包括銅、猛、鈉、1丐、鉀、鎂、鐵。
[0015]其中，所述步驟S2中新的PDA平板培養(yǎng)基中還添加有營養(yǎng)液。
[0016]其中，所述營養(yǎng)液配方為葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氫鉀1.5g、氨基酸螯合猛50mg、硫酸鋅50mg，水1000ml。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0018]通過合理的培育接種方法，以及合理的培養(yǎng)基配方，提高了鑒定的效率，且可用于大批量的篩選。
【具體實施方式】
[0019]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020]實施例1
[0021]S1、分別選取帶典型病斑的葉片，樣品表面用清水沖洗干凈后在病斑的病健交界處剪取3.5mmX3.5mm的組織塊，置于無菌工作臺中依次用含有0.7%的青霉素或鏈霉素的去離子水浸洗4s，用含有0.025%的升萊和0.15%吐溫混合液浸泡2min，用無菌水清洗5次，取出后用滅菌的吸水紙吸去多余的水分；
[0022]S2、將所得的組織塊置于培養(yǎng)基上，于20°C恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，36h后形成菌落，切取典型菌落邊緣的菌絲塊，轉移到新的PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得分離物；其中，所使用的培養(yǎng)基的配方為:鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、環(huán)己六醇27mg/L，pH為4.0?8.0、瓊脂濃度為10g/L ;所使用的PDA平板培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質、營養(yǎng)液、COD及其金屬離子，營養(yǎng)物質包括氮、磷、碳，金屬離子包括銅、猛、鈉、1丐、鉀、鎂、鐵，營養(yǎng)液配方為葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氫鉀1.5g、氨基酸螯合錳50mg、硫酸鋅 50mg，水 1000ml。
[0023]S3、將所得的分離物在PDA培養(yǎng)基平臺上培養(yǎng)7d后，用40mL無菌水洗滌，過濾后，得孢子懸浮液；
[0024]S4、取苜蓿的葉子，去掉葉柄，沖洗滅菌處理后，切成小塊置于含有50 μπι/mL苯駢咪唑的0.3%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天；
[0025]S4、選取生長正常狀態(tài)良好的葉子平鋪與培養(yǎng)皿上，用大頭針輕輕刺傷葉面后，將步驟S3所得的孢子懸浮液滴于刺傷處，在相對濕度接近100%，溫度20°C，無光照的條件下，接種20h ；
[0026]S5、接種結束后，轉移至生長箱內培養(yǎng)，光強度9000Iux和黑暗每12h交替一次，有光時培養(yǎng)溫度為22°C，無光時培養(yǎng)溫度為18°C，每天觀察記錄侵染及病害發(fā)展情況。
[0027]實施例2
[0028]S1、分別選取帶典型病斑的葉片，樣品表面用清水沖洗干凈后在病斑的病健交界處剪取3.5mmX 3.5mm的組織塊，置于無菌工作臺中依次用含有1.1 %的青霉素或鏈霉素的去離子水浸洗6s，用含有0.025%的升汞和0.25%吐溫混合液浸泡5min，用無菌水清洗8次，取出后用滅菌的吸水紙吸去多余的水分；
[0029]S2、將所得的組織塊置于培養(yǎng)基上，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，72h后形成菌落，切取典型菌落邊緣的菌絲塊，轉移到新的PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得分離物；其中，所使用的培養(yǎng)基的配方為:稀釋4倍的有機物、葡萄糖濃度為20g/L、NH4N03濃度為2.5g/L、pH為8.0、瓊脂濃度為30g/L ;所述有機物包括鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、環(huán)己六醇27mg/L ;所使用的PDA平板培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質、營養(yǎng)液、COD及其金屬離子，營養(yǎng)物質包括氮、磷、碳，金屬離子包括銅、猛、鈉、1丐、鉀、鎂、鐵，營養(yǎng)液配方為葡萄糖20g、蛋白胨5g、硫酸胺1.5g、磷酸二氫鉀1.5g、氨基酸螯合錳50mg、硫