從產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵液中提取谷胱甘肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種谷脫甘膚的制備方法，具體設(shè)及一種從產(chǎn)航假絲酵母發(fā)酵液中提 取谷脫甘膚的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]谷脫甘膚，即I: A-谷氨酷半脫氨酷甘氨酸，是由k谷氨酸、k半脫氨酸和 甘氨酸經(jīng)膚鍵縮合而成的一種同時(shí)具有I-谷氨酷基和琉基的生物活性=膚化合物。作為 生物體內(nèi)的非蛋白琉基化合物，谷脫甘膚主要有還原型（G-SH)和氧化型（G-S-S-G)兩種形 態(tài)，在機(jī)體中大量存在并起主要作用的是還原型谷脫甘膚。還原型谷脫甘膚具有獨(dú)特的生 理功能，被稱為長(zhǎng)壽因子和抗衰老因子。還原型谷脫甘膚作為氨基酸類(lèi)生化藥物，可用于治 療肝病、重金屬中毒等疾病，最近發(fā)現(xiàn)還原型谷脫甘膚還具有抗愛(ài)滋病毒功效。
[0003]目前生產(chǎn)還原型谷脫甘膚的主要方法是發(fā)酵法，即W廉價(jià)的糖類(lèi)等原料為營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)，利用微生物體內(nèi)物質(zhì)和能量代謝途徑來(lái)進(jìn)行還原型谷脫甘膚生物合成的方法。一般情 況下微生物細(xì)胞中還原型谷脫甘膚的含量不高，僅為干重的0. 5%~1. 0%，因?yàn)檫^(guò)高含量的 還原型谷脫甘膚容易破壞體內(nèi)已平衡的氧化還原環(huán)境。由于還原型谷脫甘膚是一種胞內(nèi)產(chǎn) 物，發(fā)酵結(jié)束后需要對(duì)還原型谷脫甘膚進(jìn)行提取純化。
[0004] 目前從胞內(nèi)提取還原型谷脫甘膚主要方法有溶劑萃取法、熱水抽提法及超聲波破 砕抽提法。
[0005]其中溶劑萃取法是通過(guò)增加細(xì)胞壁通透性W完成提取，溶劑的種類(lèi)、溫度和提取 時(shí)間對(duì)抽取率影響較大，用甲酸、液氨、硫酸或=氯乙酸作溶劑萃取時(shí)提取率低；用乙醇提 取時(shí)可W不破壞細(xì)胞壁，雜質(zhì)含量少，能耗低，但是乙醇抽提完畢需要回收處理，增加了提 取成本。超聲波破碎主要問(wèn)題是破壁后胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)全部溶出，離屯、后容易渾 濁，不利于后續(xù)處理；超聲破碎耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，需要有效的降溫系統(tǒng)，能耗大，不利于工業(yè)生 產(chǎn)。
[0006]熱水抽提法是從發(fā)酵液中提取谷脫甘膚應(yīng)用較早的方法，例如中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN100455592C(申請(qǐng)?zhí)?00610040606. 3)公開(kāi)了一種從谷脫甘膚發(fā)酵液中提取谷脫甘膚的 方法，采用的是沸水煮法，將谷脫甘膚發(fā)酵液經(jīng)離屯、得到酵母細(xì)胞液、用硫酸調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞 液抑值為1至2、將調(diào)節(jié)好抑值的酵母細(xì)胞液倒進(jìn)沸水中進(jìn)行沸水破壁、陽(yáng)離子交換后收 集富含谷脫甘膚的濃縮液、真空濃縮得谷脫甘膚超濃縮液、將谷脫甘膚超濃縮液冷凍干燥 得到白色粉末狀谷脫甘膚、成品包裝而得到成品谷脫甘膚。
[0007] 中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN104130310A(申請(qǐng)?zhí)?01410231642. 2)公開(kāi)了一種谷脫甘膚 的分離純化方法，將酵母發(fā)酵液離屯、，收集酵母，加入50°C~90°C熱水抽取5~30min，調(diào) 節(jié)抽取液的抑值為1. 5~3,將提取液進(jìn)行過(guò)濾或離屯、，收集提取液；提取液采用超濾法去 除大分子的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，然后采用納濾膜過(guò)濾的方法去除大部分的小分子氨基酸、 單糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)；W納濾濃縮液為原料，采用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附谷脫甘膚， 吸附達(dá)到穿透點(diǎn)后洗脫；將洗脫液減壓濃縮，加入=倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀，沉淀物冷凍烘 干，得到谷脫甘膚產(chǎn)品，純度達(dá)95%W上。
[0008] 熱水抽提法方法簡(jiǎn)單，成本較低，但容易使還原型G-甜轉(zhuǎn)變成G-S-S-G，而且胞內(nèi) 其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)、糖類(lèi)及核酸等大分子也會(huì)隨之釋放出來(lái)，增加后續(xù)純化難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提取完全、成本低的從產(chǎn)航假絲酵母發(fā)酵 液中提取谷脫甘膚的方法。
[0010] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種從產(chǎn)航假絲酵母發(fā)酵液中提取谷脫甘膚的方 法，包括W下步驟： ①產(chǎn)航假絲酵母種子培養(yǎng)和發(fā)酵。
[0011] ②收集步驟①發(fā)酵培養(yǎng)完畢的產(chǎn)航假絲酵母發(fā)酵液，離屯、后去除上清液，收集的 細(xì)胞在-15°C~-25°c下冷凍20~30分鐘。
[0012] ③將步驟②冷凍后的產(chǎn)航假絲酵母細(xì)胞加入硫酸溶液中，硫酸溶液的抑值為1~ 2, 20°C~35°C下放置15~30分鐘后，產(chǎn)航假絲酵母細(xì)胞內(nèi)的還原型谷脫甘膚從胞內(nèi)釋 放出來(lái)溶解在硫酸溶液中，完成從產(chǎn)航假絲酵母發(fā)酵液中對(duì)谷脫甘膚的提取，離屯、分離，收 集上清液。
[0013] 上述步驟③中，硫酸溶液中產(chǎn)航假絲酵母細(xì)胞的濃度為0. 08g/血~0. 12g/血。
[0014] 上述步驟①產(chǎn)航假絲酵母種子培養(yǎng)時(shí)，將產(chǎn)航假絲酵母菌株接種于種子培養(yǎng)基 中，28°C~32°C下培養(yǎng)18~28小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200~250巧m，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)停止培養(yǎng)， 得到的種子液待發(fā)酵培養(yǎng)。
[0015] 步驟①產(chǎn)航假絲酵母發(fā)酵時(shí)，先將種子液按8%~10%的接種量接種在發(fā)酵基本 培養(yǎng)基中分批培養(yǎng)8~lOh，再按照細(xì)胞比生長(zhǎng)速率0. 1化1~0. 25h1指數(shù)流加培養(yǎng)11~ 13h，接著W5.0~6.0g(h. 1)1恒數(shù)流加培養(yǎng)23~2化后；向罐內(nèi)加入S種氨基酸，加 入后罐內(nèi)谷氨酸5. 5~6. 5mmol/X、甘氨酸5. 0~6. 〇111111〇1/^、半脫氨酸6. 0~7. 0mmol/ 以繼續(xù)培養(yǎng)25~3化完成產(chǎn)航假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)。
[0016] 上述分批培養(yǎng)時(shí)所述發(fā)酵基本培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15g/l，硫酸錠5g/l，酵母 膏2g/L，憐酸二氨鐘1. 5g/L，硫酸儀0. 25g/L，發(fā)酵基本培養(yǎng)基的抑值為5. 5 ; 上述指數(shù)流加培養(yǎng)和恒數(shù)流加培養(yǎng)所用的均為流加培養(yǎng)基，流加培養(yǎng)基組成如下：葡 萄糖500g/l，硫酸錠36g/l，憐酸二氨鐘5g/l，硫酸儀0.5旨/1，其中葡萄糖單獨(dú)滅菌后 與其它成分混合。
[0017] 本發(fā)明具有積極的效果：（0本發(fā)明的提取方法首先將產(chǎn)航假絲酵母（Candida utilis，簡(jiǎn)寫(xiě)為C.utilis)培養(yǎng)并發(fā)酵，得到的發(fā)酵液離屯、分離，去除上清液，收集的細(xì)胞 在-20°C~-30°C下冷凍處理，W增加C.utilis細(xì)胞壁滲透性；將冷凍處理后的C.utilis 細(xì)胞加入低抑值的強(qiáng)酸溶液中，在低抑值的強(qiáng)酸溶液中胞內(nèi)還原型谷脫甘膚完全釋放出 來(lái)，而胞內(nèi)其他大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、核酸等則基本留在胞內(nèi)，簡(jiǎn)化了后續(xù)的純化操 作，降低了純化成本，實(shí)現(xiàn)了高效、清潔化提取C.utilis細(xì)胞中G-甜；同時(shí)在本發(fā)明的提取 條件下還原型谷脫甘膚未被破壞。
[0018] (2)用低抑值的強(qiáng)酸溶液提取GSH時(shí)，只需使用少量的強(qiáng)酸溶液，G-SH提取結(jié)束 后，強(qiáng)酸溶液還可進(jìn)一步循環(huán)利用，具有環(huán)境友好性。
[0019] (3)本發(fā)明的提取方法提取時(shí)間短，20分鐘左右細(xì)胞內(nèi)的谷脫甘膚就能完全釋放 至強(qiáng)酸溶液中，因此本方法提取效率高。
[0020] (4)本發(fā)明的提取方法工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，具有良好 的工業(yè)應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】[002。（實(shí)施例1) 本實(shí)施例的從產(chǎn)航假絲酵母發(fā)酵液中提取谷脫甘膚的方法包括W下步驟： ①產(chǎn)航假絲酵母種子培養(yǎng)和發(fā)酵。W產(chǎn)航假絲酵母（CandidautilisW甜02-08)作 為生產(chǎn)菌株，首先進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期時(shí)停止培養(yǎng)，得到的種子液待發(fā)酵培養(yǎng)。
[0022] 種子培養(yǎng)基組成如下（g/L):葡萄糖20,蛋白腺20,酵母