蝦仁下腳料鋅螯合肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品精深加工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種離子螯合肽，尤其涉及蝦仁下腳料鋅螯合肽。
【背景技術(shù)】
[0002]我國的蝦類資源非常豐富，近年來隨著蝦仁加工業(yè)的迅速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的加工下腳料，這些下腳料中富含蛋白質(zhì)、甲殼素以及蝦青素等有效物質(zhì)。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國以蝦為主要原料的生產(chǎn)企業(yè)在處理蝦類加工下腳料時，一部分以極低價格作為廢料外售，或者運(yùn)送到養(yǎng)殖場烘干粉碎作為飼料，還有很多未來得及處理的下腳料由于堆砌一處發(fā)霉腐爛，最終直接運(yùn)往垃圾場。不但造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，而且還會引起環(huán)境污染。國外對蝦加工下腳料的綜合利用非常重視，并進(jìn)行了深入的研究，在理論和實(shí)踐方面均取得了系列成果，為我國蝦仁加工下腳料的回收利用提供了依據(jù)。近年來，我國隨著對環(huán)境保護(hù)的加強(qiáng)，蝦仁加工下腳料的回收利用成為水產(chǎn)加工企業(yè)迫切需要解決的問題。目前我國主要還是用于生產(chǎn)甲殼素，對于蛋白和蝦青素的回收利用由于成本高尚實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0003]經(jīng)檢索，以蝦仁加工下腳料制備鋅螯合肽未見報(bào)道?；诖耍景l(fā)明根據(jù)鋅螯合肽和蝦仁加工下腳料的研究現(xiàn)狀，提供一種具有金屬鋅螯合活性的多肽，并提供這種鋅螯合肽的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種源于蝦仁加工下腳料的蝦仁下腳料鋅螯合肽，該螯合肽源于天然、對人體安全，且具有鋅離子螯合特性。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種蝦仁下腳料鋅螯合肽，其特征在于該膠原肽的氨基酸序列為 Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met (WGFTCWPM)，ESI/MS檢測分子量為1027.20 Da。
[0006]該螯合肽的制備方法，包括以下步驟:
I)蝦仁加工下腳料蛋白酶解物的制備:將冷凍蝦仁加工下腳料(蝦頭和蝦殼)用組織搗碎機(jī)粉碎，按照料液比I g:4?5 mL加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L, pH 6.5?7.5)，于45?50 °C下于超聲功率400?500W下超聲60?90 min，然后加入中性蛋白酶(酶活力^ 5.0XlO4 U/g)，于45?50°C保溫2?3 h后，溫度升至90?95°C并保持10?15 min ；溶液溫度降至37?40°C，pH調(diào)至7.5?8.0，加入胰蛋白酶(酶活力彡2.5X 14 U/g)保溫2?3 h后，溫度升至90?95°C并保持10?15 min后，于9 000?10 000貧離心15?20 min，得上清液，即好仁加工下腳料蛋白酶解物。
[0007]2)蝦仁加工下腳料鋅螯合肽的制備:將制備的酶解物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有8?10倍NKA-9大孔樹脂的層析柱中，用2?3倍柱體積水洗脫除去雜質(zhì)，然后用3?5倍柱體積的30%和60%乙醇進(jìn)行洗脫，收集60%乙醇洗脫液，于50 0C以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)固定化鋅離子層析柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到蝦仁加工下腳料鋅螯合肽。
[0008]作為優(yōu)選，固定化鋅離子層析柱層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為: 固定化鋅離子層析柱層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10?20 mg/mL
的溶液，以0.5?1.5 mL/min的流速通過固定化鋅離子親和層析柱，分別用3?5柱體積的水和0.1 mol/L NaCl洗脫，收集0.1 mol/L NaCl洗脫組分，即為親和層析組分。
[0009]凝膠柱層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10?20 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-15柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)220 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰為凝膠層析酶解物。
[0010]RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45?55 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，根據(jù)對Zn的螯合活性得I個高Zn螯合肽Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met (WGFTCWPM)。
[0011]再優(yōu)選，固定化鋅離子層析柱填料的制備方法為:燒瓶內(nèi)依次加入液體石蠟140mL，乙酸乙酯40mL，和Triton X-100 8 mL，攪拌30min后，加入100 mL 2%的殼聚糖乙酸溶液(乙酸濃度5%)，60 °C攪拌3 h，緩慢滴加40%的甲醛10 mL，反應(yīng)30 min，再緩慢滴加50%的戊二醛7 mL，反應(yīng)90 Hiin0用NaOH調(diào)pH至12?13，然后70 °C下繼續(xù)攪拌2 h，過濾，分別用水、乙醇清洗，80 °C干燥至恒重后轉(zhuǎn)移至燒瓶中，依次向燒杯中加入I mol/L NaOH150 mL，無水乙醇150 mL, NaBH4 8g，室溫下攪拌，抽濾，水洗至中性，乙醇清洗，干燥至恒重，得交聯(lián)殼聚糖。轉(zhuǎn)移交聯(lián)殼聚糖至燒瓶中，加入I mol/L NaOH 100 mL，攪拌，緩慢滴加環(huán)氧氯丙烷47 mL，室溫下攪拌24 h，抽濾，分別用水、乙醇清洗，干燥后轉(zhuǎn)移至燒瓶中，加Al mol/L NaOH 60 mL，緩慢滴加乙二胺25 mL，65?70°C下保溫24 h后，蒸餾水清洗，抽濾，干燥，得到配基螯合殼聚糖。用超純水懸浮配基螯合殼聚糖，裝柱，用兩倍柱體積的超純水平衡，再用5倍柱體積的0.1 mol/L ZnCl2溶液以0.5?1.0 mL/min過柱后，用2?3倍柱體積超純水清洗，得到殼聚糖鋅離子固定化親和層析填料。
[0012]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量8?10 μ L ;色譜柱為Zorbax C18 ;流動相:15%乙腈；洗脫速度0.5?0.8 mL/min ;紫外檢測波長220 nm。
[0013]本發(fā)明基于多肽與金屬離子螯合的理論基礎(chǔ)，以及多肽-Zn螯合物的獨(dú)特功效(可同時補(bǔ)充多肽/氨基酸和Zn)，以4下仁加工下腳料為原材料，通過對中性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解條件控制，制備具有高Zn螯合活性的多肽。本發(fā)明即為補(bǔ)鋅保健食品和藥物開發(fā)提供了一種技術(shù)支持，同時也為蝦仁加工下腳料的高值化利用提供了一條新思路。
【附圖說明】
[0014]
圖1是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15層析圖。
[0015]圖2是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物的RP-HPLC分析圖。
[0016]圖3 是本發(fā)明的 Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met 的質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0018]一種源于蝦仁加工下腳料的鋅螯合肽及其制備方法，制備工藝流程如下:蝦仁加工下腳料-蛋白提取、酶解-酶解物-超濾-大孔樹脂純化-固定化鋅離子層析柱層析凝膠過濾層析-RP-HPLC制備-鋅螯合肽。
[0019]實(shí)施例:
I)蝦仁加工下腳料蛋白酶解物的制備:將冷凍蝦仁加工下腳料(蝦頭和蝦殼)用組織搗碎機(jī)粉碎，按照料液比I g:5 mL加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L, pH 7.0)，于47°C下于超聲功率500W下超聲90 min，然后加入中性蛋白酶(酶活力彡5.0X 14 U/g)，于47°C保溫2 h后，溫度升至95°C并保持10 min;溶液溫度降至37°C，pH調(diào)至7.8，加入胰蛋白酶(酶活力彡2.5 X 14 U/g)保溫3 h后，溫度升至95°C并保持1min后，于10 000貧離心15 min，得上清液，即蝦仁加工下腳料蛋白酶解物。
[0020]2)蝦仁加工下腳料鋅螯合肽的制備:將制備的酶解物采用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有10倍NKA-9大孔樹脂的層析柱中，用3倍柱體積水洗脫除去雜質(zhì)，然后用3倍柱體積的30%和60%乙醇進(jìn)行洗脫，收集60%乙醇洗脫液，于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)固定化鋅離子層析柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到蝦仁加工下腳料鋅螯合肽。利用氨基酸序列分析和質(zhì)譜測定其結(jié)構(gòu)，具體過程為:
①固定化鋅離子層析柱層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10?20 mg/mL的溶液，以0.5?1.5 mL/min的流速通過固定化鋅離子親和層析柱，分別用3?5柱體積的水和0.1 mol/L NaCl洗脫，收集0.1 mol/L NaCl洗脫組分，即為親和層析組分。
[0021]②凝膠柱層析:將上述膠原肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10?20 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)214 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰為凝膠層析酶解物(F3)(圖1);
③RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45?55 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化(所述RP-HPLC條件為:進(jìn)樣量8?10 μ L ;色譜柱為Zorbax C18 ;流動相:15%乙腈；洗脫速度0.5?0.8 mL/min ;紫外檢測波長220 nm)，根據(jù)對Zn的螯合活性得I個高Zn螯合活性膠原肽(圖2)。
[0022]④結(jié)構(gòu)檢測:Zn螯合膠原肽經(jīng)檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為 Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met (WGFTCWPM)，ES I/MS 檢測分子量為1027.20 Da (圖 3)。
[0023]Zn螯合膠原肽對鋅離子的螯合作用采用EDTA滴定法測定。取螯合物100 mg于100 mL小燒杯中，加水50 mL，滴入HCl (6 mol/L)數(shù)滴。搖勻后在水浴上加熱使之完全溶解，冷卻后定容至100 mL，從中吸取10 mL于三角瓶，平行3份，加入pH 10的NH3-NH4Cl緩沖液10 mL，鉻黑T指示劑適量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴定至藍(lán)色；記錄消耗EDTA的毫升數(shù)，計(jì)算螯合物含鋅量。
[0024]測定結(jié)果表明:純化得到的Zn螯合膠原肽Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met(WGFTCWPM)對鋅離子的螯合能力為83.56 μ g/mg，與膠原蛋白酶解產(chǎn)物(30.12 μ g/mg)相比其對Zn的螯合能力有了較大提高。
[0025]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]序列表 SEQUENCE LISTING <110>浙江海洋學(xué)院 〈120〉蝦仁下腳料鋅螯合肽 〈130〉 zjou-2015-wb0704 〈160〉 I
<170> PatentIn vers1n 3.5
〈210〉 I
〈211〉 8
〈212〉 PRT
〈213〉人工合成
〈400〉 I
Trp Gly Phe Thr Cys Trp Pro Met
I5
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種源于蝦仁加工下腳料的鋅螯合肽，其特征在于該鋅螯合膠原肽的氨基酸序列為Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met, ES I/MS 檢測分子量為 1027.20 Da。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蝦仁下腳料鋅螯合肽，具體講是以蝦仁加工下腳料為原料，采用酸法提取膠原蛋白，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對膠原蛋白進(jìn)行酶解，采用超濾、大孔樹脂柱層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到鋅螯合膠原肽Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ESI/MS檢測分子量為1027.20Da。<b><u /></b>
【IPC分類】C07K7/06, C07K1/22, C07K1/34, C07K1/20, C07K1/36, C12P21/06, C07K1/16
【公開號】CN105198963
【申請?zhí)枴緾N201510399464
【發(fā)明人】趙玉勤, 徐銀峰, 王斌, 陳蔭, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年7月9日