合成含有乙內(nèi)酰脲的肽產(chǎn)物的制作方法
【專利說明】合成含有乙內(nèi)酰脲的肽產(chǎn)物
[0001] 本發(fā)明涉及合成包含至少一個乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽產(chǎn)物的方法。所述肽產(chǎn)物可用作 用于質(zhì)量控制藥物肽，具體地用于質(zhì)量控制毒蜥外泌肽（exendin P印tide)的參比物質(zhì)。此 外，本發(fā)明涉及乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件（building block)、制備所述化學(xué)構(gòu)件的方法以及它們 用于合成肽產(chǎn)物的用途。
[0002] 使用熟知的重組DNA和化學(xué)固相合成方法，已經(jīng)合成了用于制藥的若干蛋白和 肽。然而這些蛋白和肽的生產(chǎn)通常導(dǎo)致大量不期望的合成副產(chǎn)物。這在它們通過固相合成 而產(chǎn)生時尤其如此。隨著肽/蛋白長度的增加，導(dǎo)致了合成步驟的增加，這些副產(chǎn)物可占粗 產(chǎn)物的50至70%。
[0003] 用于肽合成的乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件的合成來自Zhang et al.，J. Org. Chem. 71 (2006), 1750-1753 ；0pacic et al. , J. Pept. Res. 66(2005), 85-93 ；Vazquez et al. , Chem. Med. Chem. 3(2008), 979-985 ；Takeuchi et al. , Chem. Commun. (2000), 785-786 ； Nefzi et al. , Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 (1998), 2273-2278 ；Lamothe et al. , J. Comb. Chem. 4 (2002), 73-78 ;Chong and Petillo, Tetrahedron Lett. 40 (1999) ,2493-2496,以及 Park and Kurth, Tetrahedron Lett. 41(2000) ,7409-7413。
[0004] 上述文件描述了乙內(nèi)酰脲化合物的固相合成。然而，包含酸-不穩(wěn)定的經(jīng)保護(hù)的 側(cè)鏈的乙內(nèi)酰脲的制備是未知的。
[0005] 本發(fā)明描述了由具有經(jīng)酸-不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)諸如三苯甲基（Trt)、叔丁基（tBu) 或丁氧基-羰基（Boc)保護(hù)的側(cè)鏈的二肽合成含有乙內(nèi)酰脲的肽產(chǎn)物的新的合成。所得的 乙內(nèi)酰脲可包含具有酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的三官能化的氨基酸，或具有完整側(cè)鏈保護(hù) 基團(tuán)的二官能化氨基酸和三官能化氨基酸的組合。
[0006] 此外，發(fā)明人提供了用于制備乙內(nèi)酰脲的新方法，其在酸-不穩(wěn)定的載體例如 CTC(氯三苯甲基氯）樹脂上進(jìn)行以及例如在三光氣的存在下環(huán)化。
[0007] 此外，本申請?zhí)峁┝诉m于固相肽合成的新的乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件以制備具有N-末 端乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽產(chǎn)物。
[0008] 該方法針對肽利西拉來（AVE0010)，即一種具有44個氨基酸長度的GLP-I激動劑 進(jìn)行示例性顯示。利西拉來的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 1 :
[0009] H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A -P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH 2
[0010] 利西拉來通過化學(xué)固相合成方法產(chǎn)生。
[0011] 在利西拉來粗產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)了若干含有N-末端乙內(nèi)酰脲的肽作為副產(chǎn)物。認(rèn)為它 們通過（N-I)酰胺的氮與Fmoc (荷基甲氧基羰基（Fmoc))保護(hù)基團(tuán)的羰基反應(yīng)而產(chǎn)生，如 在圖1中所示。在移去芴基甲醇后，形成了包含N-末端乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽產(chǎn)物，從而導(dǎo)致 肽合成提早終止。如在圖1顯示的肽Des[l-12]-乙內(nèi)酰脲-(13)-AVE0010被鑒定為不能 通過色譜操作完全與AVE0010分離的產(chǎn)物。
[0012] 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有N-末端乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽產(chǎn)物諸如Des[l-12]-乙內(nèi)酰 脲-(15-44)-AVE0010(也稱為Des[l-12]修飾的（13)-AVE0010)的靶向合成可通過固相肽 合成使用具體的乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件來進(jìn)行。該化學(xué)構(gòu)件通過將Fmoc-經(jīng)保護(hù)的Met化學(xué)構(gòu) 件偶聯(lián)至氯三苯甲基氯（CTC)樹脂上來合成。在Fmoc斷開后，偶聯(lián)另一個化學(xué)構(gòu)件，即側(cè) 鏈-三苯甲基（Trt)保護(hù)的Gln化學(xué)構(gòu)件。在另外的Fmoc斷開后，在三光氣的存在進(jìn)行環(huán) 化。乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件與樹脂的斷開在溫和條件例如在20%六氟異丙醇（HFIP)在二氯甲 烷（DCM)中的溶液中進(jìn)行，以將酸-不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)保留在Gln側(cè)鏈上。反應(yīng)方案顯示 于圖2。所得的產(chǎn)物⑶-2- {(S) -2, 5-二氧代-4- [2-(三苯甲基-氨甲?；?乙基]-咪 唑烷-1-基}-4-甲基硫基丁酸為新的化合物。該化合物可偶聯(lián)至完全保護(hù)的肽產(chǎn)物，例 如H-(15-44)-AVE0010,其固定于適當(dāng)?shù)墓腆w載體上。在用適當(dāng)?shù)脑噭├鏚ing's混合物 (King et al·，Int. J. Peptide Protein Res. 36 (1990) ,255-266)處理后，乙內(nèi)酰脈-修飾 的肽，例如Des[l-12]修飾的（13)-AVE0010可與載體斷開。
[0013] 該原理可用于在適當(dāng)載體例如CTC樹脂上制備任何乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件。保留了原 始二肽的酸不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)。所得的乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件可偶聯(lián)至肽的N-末端以在與載體 斷開后得到含有乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽。
[0014] 本發(fā)明的方法允許以高收率和純度靶向合成含有乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽產(chǎn)物。這些肽 產(chǎn)物可例如用作用于質(zhì)量控制藥物肽產(chǎn)物諸如利西拉來的參比物質(zhì)。
[0015] 本發(fā)明的主題是合成式（I)的包含N-末端乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽產(chǎn)物或其鹽或溶劑 化物的方法：
[0017] 其中
[0018] RjPR2為氨基酸側(cè)鏈，
[0019] P為肽殘基，且
[0020] (*)在每種情況下獨(dú)立地表示任選不對稱的C-原子，
[0021] 所述方法包括以下步驟：
[0022] (a)使式（II)的乙內(nèi)酰脲化學(xué)構(gòu)件與式（III)的肽產(chǎn)物偶聯(lián)，
[0023] 所述式（II)為：
[0025] 其中
[0026] R1，為任選經(jīng)保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈，
[0027] R2，為任選經(jīng)保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈，
[0028] Z為羧基，且
[0029] (*)在每種情況下獨(dú)立地表示任選不對稱的C-原子，
[0030] 所述式（III)為：
[0031] H2N-P '
[0032] 其中P'為任選包含經(jīng)保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽殘基，其優(yōu)選與固相載體偶聯(lián)，
[0033] (b)任選將保護(hù)基團(tuán)與經(jīng)保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈斷開，以及
[0034] (C)分離并任選純化肽產(chǎn)物（I)。
[0035] 本發(fā)明的另一主題為式（I)的包含N-末端乙內(nèi)酰脲基團(tuán)的肽產(chǎn)物或其鹽或溶劑 化物：
[0037] 其中
[0038] RjPR2為氨基酸側(cè)鏈，
[0039] P為肽殘基，且
[0040] (*)在每種情況下獨(dú)立地表示任選不對稱的C-原子。
[0041 ] 具體地，肽產(chǎn)物為GLP激動劑肽產(chǎn)物，例如毒蜥外泌肽產(chǎn)物諸如毒蜥外泌 肽-4、利拉魯肽或利西拉來（AVE0010)，或GLP-1受體激動劑如GLP-1 (7-36)、高血糖 素、胃泌酸調(diào)節(jié)素，以及結(jié)合并活化高血糖素和GLP-I受體（Hjort et al.，Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124, 1994 ；Day Jff et al., Nature Chem. Biol. 5:749-757, 2009)并抑制體重增加且減少食物攝取的肽（其描述于專利申請TO 2008/071972、TO 2008/101017、TO 2009/155258、TO 2010/096052、TO 2010/096142、TO 2011/075393、TO 2008/152403、 TO 2010/070251、TO 2010/070252、TO 2010/070253、 TO 2010/070255、WO 2011/160630、WO 2011/006497、WO 2011/152181、WO 2011/152182、WO 2011/117415、TO 2011/117416,將其內(nèi)容通過引用的方式人并入本申請），或GIP以及結(jié)合 并活化GIP和GLP-I受體以及任選高血糖素受體并改善血糖控制、抑制體重增加且減少食 物攝取的肽（其描述于專利申請 WO 2011/11