紅木中交趾黃檀dna鑒定的方法及專用引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及木材材種鑒定的分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說涉及對交趾黃檀的DNA鑒定方法及其專用的引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002]《紅木國家標(biāo)準(zhǔn)》自2000年頒布實(shí)施，《紅木國家標(biāo)準(zhǔn)》中把“紅木”范圍的樹種列為“五屬八類”。這“五屬八類”中共包括了 33種木材。5屬:即紫檀屬、黃檀屬、柿屬、豆屬及鐵刀木屬。8類:則是以木材的商品名來命名的，即紫檀木類、花梨木類、香枝木類、黑酸枝類、紅酸枝木類、烏木類、條紋烏木類和雞翅木類。
[0003]交止黃檀cochinchinensisW&H “大紅酸枝”，屬于紅木國標(biāo)中豆科家族的黃檀屬、黑酸枝類。產(chǎn)于東南亞地區(qū)，包括柬埔寨各地，老撾中部和南部，泰國東北部、東部和中部，越南廣平省以南地區(qū)。紅木行業(yè)通常指的大紅酸枝一般即指老撾大紅酸枝即交趾黃檀，是公認(rèn)的最好酸枝木，俗稱老紅木。
[0004]傳統(tǒng)的紅木鑒定識別方法是利用人工經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行識別，主要通過對木材截面進(jìn)行人工觀察的方式完成。對交趾黃檀的鑒定目前采用的也是傳統(tǒng)的紅木鑒定方法。所謂的傳統(tǒng)鑒定方法主要依賴宏觀識別，而微觀識別則需要使用光學(xué)顯微鏡觀察其內(nèi)部的解剖結(jié)構(gòu)特征，也就是觀察構(gòu)成木材的各類細(xì)胞與組織的形態(tài)及排列特征，該方法涉及的識別特征較多，鑒定相對準(zhǔn)確，但對于鑒定工作者的要求很高，要對此做出準(zhǔn)確的鑒定，必須具有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。近年來研究工作者開發(fā)了基于數(shù)字圖像處理的木材圖像識別技術(shù)，大大提高了木材識別的準(zhǔn)確性，推動了木材識別技術(shù)的發(fā)展。但是，無論是基于識別者經(jīng)驗(yàn)的傳統(tǒng)識別技術(shù)還是基于計(jì)算機(jī)圖像檢索的識別技術(shù)，都沒有脫離木材本身的形態(tài)結(jié)構(gòu)及特征，鑒定識別工作都必須建立在所檢木材有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，這就為木材識別工作帶來了一定的局限性，同時，相近種屬木材易出現(xiàn)材質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似，為木材識別的準(zhǔn)確性帶來困難。
[0005]若能建立起以紅木木材基因多樣性的分子鑒定技術(shù)，一方面可以杜絕紅木制品的摻假造假行為，對于保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，提高品牌價值，規(guī)范紅木市場；另一方面，為檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)林、工商的快速篩查和鑒定提供技術(shù)方法，促進(jìn)物種資源的保護(hù)和利用，提高進(jìn)出口的檢驗(yàn)檢疫的準(zhǔn)確性。
[0006]然而，目前對交趾黃檀的鑒定依然采用傳統(tǒng)的木材鑒定手段，即解剖切片觀察木材的構(gòu)造以及形態(tài)特征從而得出判定結(jié)果。因此建立起交祉黃檀的分子鑒定方法，實(shí)現(xiàn)交趾黃檀的簡單、快速、準(zhǔn)確、客觀的鑒定是目前急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種交趾黃檀DNA鑒定的專用引物和探針，所述引物和探針序列包括:
JZHT Primer-F:5’- CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT -3’JZHT Primer-R:5’- CGAATCCACCACGAACCC -3’
JZHT Primer Probe:5’-VIC- CAACCCGTGCGCCT -MGB-3'。
[0008]進(jìn)一步地，所述引物和探針的PCR反應(yīng)條件為:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40個循環(huán)。
[0009]進(jìn)一步地，所述引物和探針的使用濃度比為:JZHT Primer-F: JZHTPrimer-R:JZHT Primer Probe=1:1:2。
[0010]本發(fā)明還提供了一種交趾黃檀DNA鑒定的方法，包括如下步驟:
(1)木材樣本的預(yù)處理；
(2)提取經(jīng)(I)處理后的木材樣本中的DNA;
(3)利用引物JZHT Primer-F 和 JZHT Primer-R，以及探針 JZHT Primer Probe 對(2)中提取的DNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；
(4)木材種類的確定；
所述引物和探針序列包括:
JZHT Primer-F:5’- CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT -3’
JZHT Primer-R:5’- CGAATCCACCACGAACCC -3’
JZHT Primer Probe:5' -VIC- CAACCCGTGCGCCT -MGB-3’。
[0011]進(jìn)一步地，所述的熒光PCR擴(kuò)增條件為:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40個循環(huán)。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:本發(fā)明通過一對特異性擴(kuò)增引物及MGB探針對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，條件依賴少，一般的PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)備即可滿足，對結(jié)果的分析非常直觀，不用比對復(fù)雜的測序圖譜，直接根據(jù)擴(kuò)增曲線即可做出分析該位點(diǎn)基因型。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(real time quantitative PCR，RQ-PCR)具有較高的靈敏度和特異性，而且能對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時檢測。該法綜合生物學(xué)、酶學(xué)和熒光化學(xué)于一體，從擴(kuò)增到結(jié)果分析均在PCR反應(yīng)管封閉狀態(tài)下進(jìn)行，解決了 PCR產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。
[0013]本發(fā)明在對交趾黃檀大量基因信息進(jìn)行分析比較的基礎(chǔ)上，通過采用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對交趾黃檀分子水平上的條形碼鑒定。并根據(jù)序列位點(diǎn)多態(tài)性，設(shè)計(jì)交趾黃檀種屬特異引物和探針，建立了交趾黃檀特異性的熒光定量PCR鑒定檢測方法。本發(fā)明并不需要木材有完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，只需從木料上取極少量木材樣本，即可滿足檢測要求，操作簡單。并且通過木材特有的DNA信息做出判斷，鑒定過程客觀、準(zhǔn)確?？朔藗鹘y(tǒng)鑒定方法主要依賴于形態(tài)鑒定方法，并必須建立在木材有完整易辨識的形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上的技術(shù)局限性。本發(fā)明很好地滿足各相關(guān)部門對交趾黃檀快速篩查和鑒定的要求，能有效杜絕交趾黃檀制品的摻假造假行為，對于保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，提高品牌價值，規(guī)范市場，促進(jìn)物種資源的保護(hù)和利用具有重要的意義。
【附圖說明】
[0014]圖1是紅木中交趾黃檀和15個對照組樹種DNA提取效果。
[0015]圖2是本發(fā)明方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0016]圖3是本發(fā)明方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0017]圖4是取自針對經(jīng)不同處理方式得到的木材樣本的檢測結(jié)果。
[0018]圖5是取自木材不同部位的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但并不因此將本發(fā)明限制在所述的具體實(shí)施例中。實(shí)施例中未說明的條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照商品說明書建議的步驟和條件。
[0020]實(shí)施例1檢測交趾黃檀的引物、探針和檢測試劑盒
利用NCBI等資源信息，找出交趾黃檀與其他木材的基因差異位點(diǎn)，篩選出一對特異性擴(kuò)增引物對(JZHT Primer-F和JZHT Primer-R),并在該引物對的擴(kuò)增區(qū)域設(shè)定了一條特異性的探針(JZHT Primer Probe)。所述擴(kuò)增引物對和探針序列分別是:
JZHT Primer-F:5’- CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT -3’
JZHT Primer-R:5’- CGAATCCACCACGAACCC -3’
JZHT Primer Probe:5' -VIC- CAACCCGTGCGCCT -MGB-3’。
[0021]一種檢測交趾黃檀的試劑盒，所述試劑盒包括樣品DNA抽提試劑、qPCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
[0022]其中所述qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:20μ1的體系包括:
SYBR Prmix Taq II (2Χ )ΙΟμΙ
ROX Referance Dye II (50Χ ) 0.4μ1 JZHT Primer Probe0.4μ1
JZHT Primer-F (20μΜ)0.2μ1
JZHT Primer-R (20μΜ)0.2μ1
DNA樣品模板8.8μ1
其中所述引物和探針序列分別為:
JZHT Primer-F:5’- CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT -3’
JZHT Primer-R:5’- CGAATCCACCACGAACCC -3’
JZHT Primer Probe:5' -VIC- CAACCCGTGCGCCT -MGB-3’。
[0023]陽性對照品:含有本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增片段的質(zhì)粒溶液。
[0024]陰性對照品:不含本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增片段的質(zhì)粒溶液。
[0025]空白對照品:2 μ I生理鹽水或不加任何物質(zhì)的ddH20。
實(shí)施例2:實(shí)時熒光PCR的鑒定方法
(I)木材樣本的預(yù)處理:
用75%的乙醇對木材表面進(jìn)行徹底的消毒，經(jīng)無菌水沖洗并用擦干木材。切除待測木材