[0056] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定黃連屬植物的產(chǎn)品含有檢測(cè)所述黃連分子標(biāo)記 多態(tài)性的物質(zhì)。
[0057] 上述產(chǎn)品中，所述檢測(cè)黃連分子標(biāo)記多態(tài)性的物質(zhì)為所述引物對(duì)037A4、所述引物 對(duì)034H11、所述引物對(duì)006G4和/或所述引物對(duì)008H3。
[0058] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述產(chǎn)品在鑒定或輔助鑒定黃連屬植物中 的應(yīng)用。
[0059] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定黃連屬植物的方法。
[0060] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定黃連屬植物的方法，包括如下步驟：分別以黃連、 峨眉黃連、云南黃連、短萼黃連、三角葉黃連和待鑒定黃連屬植物的基因組DNA為模板，采 用所述引物對(duì)037A4、所述引物對(duì)034H11、所述引物對(duì)006G4和所述引物對(duì)008H3分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，分別得到037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 和008H3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)這四種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列進(jìn)行0/1分型：
[0061] 若所述037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1第433-435位為GTA，將所述 037A4-1定義為1，若所述037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1第433-435位為TCC， 將所述037A4-1定義為0,若所述037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1第433-435位 的同源染色體比較為GTA與TCC的雜合型，將所述037A4-1定義為0;
[0062] 若所述037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1第438-440位為TCC，將所述 037A4-2定義為1，若所述037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1第438-440位為GTA， 將所述037A4-2定義為0;
[0063] 若所述037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1第430-440位的同源染色體比 較無(wú)核苷酸的替換，將所述037A4-3定義為1，若所述037A4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1第430-440位的同源染色體比較有核苷酸的替換，將所述037A4-3定義為0;
[0064] 若所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第154位為G，將所述 034H11-1定義為1，若所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第154位為A，將 所述034H11-1定義為0;
[0065] 若所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第285位和第286位間無(wú) 核苷酸的插入，將所述034H11-2定義為1，若所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第285位和第286位間有核苷酸的插入，將所述034H11-2定義為0;
[0066] 若所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第359-360位為CC，將所述 034H11-3定義為1，若所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第359-360位為 TT，將所述034H11-3定義為0;
[0067]若所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第320-330位間無(wú)核苷酸 插入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度相同，將所述034H11-4定義為1，若 所述034H11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 2的第320-330位間有核苷酸插入和/或 刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度不同，將所述034H11-4定義為0 ;
[0068] 若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3的第254位為G，將所述006G4-1 定義為1，若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3的第254位為A，將所述006G4-1 定義為〇 ;
[0069] 若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3的第286位為C，將所述006G4-2 定義為1，若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3的第286位為T，將所述006G4-2 定義為〇 ;
[0070] 若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3的第31-50位間有核苷酸插 入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度不同，將所述006G4-3、所述006G4-4 和所述006G4-5分別定義為1、1和0 ;若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3 的第31-50位間無(wú)核苷酸插入和/或刪除，同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度相同，將所述 006G4-5定義為1 ;
[0071] 在所述006G4-5為1時(shí)，若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3的第 225-245位間有核苷酸插入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度不同，將所述 006G4-3和所述006G4-4分別定義為0、1 ;若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3 的第225-245位間無(wú)核苷酸插入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度相同，將 所述006G4-3定義為1;
[0072] 在所述006G4-5為1且在所述006G4-3為1時(shí)，若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì) 應(yīng)于SEQ ID No. 3的第325-345位間無(wú)核苷酸插入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷 酸區(qū)段長(zhǎng)度相同，將所述006G4-4定義為1，若所述006G4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 3的第325-345位間有核苷酸插入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度不 同，將所述006G4-4定義為0;
[0073] 若所述008H3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 4的第126位為A，將所述008H3-1 定義為1，若所述008H3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 4的第126位為G，將所述008H3-1 定義為〇 ;
[0074] 若所述008H3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 4的第130-150位間無(wú)核苷酸插 入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度相同，將所述008H3-2定義為1，若所述 008H3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 4的第130-150位間有核苷酸插入和/或刪除，造 成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度不同，將所述008H3-2定義為0;
[0075] 若所述008H3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 4的第220-240位間無(wú)核苷酸插 入和/或刪除，造成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度相同，將所述008H3-3定義為1，若所述 008H3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 4的第220-240位間有核苷酸插入和/或刪除，造 成同源染色體對(duì)應(yīng)核苷酸區(qū)段長(zhǎng)度不同，將所述008H3-3定義為0;
[0076] 對(duì)所述黃連、所述峨眉黃連、所述云南黃連、所述短萼黃連、所述三角葉黃連和所 述待鑒定黃連屬植物的0/1分型結(jié)果進(jìn)行聚類分析，所述待鑒定黃連屬植物與所述黃連聚 為一類，所述待鑒定黃連屬植物為或候選為黃連；所述待鑒定黃連屬植物與所述峨眉黃連 聚為一類，所述待鑒定黃連屬植物為或候選為峨眉黃連；所述待鑒定黃連屬植物與所述云 南黃連聚為一類，所述待鑒定黃連屬植物為或候選為云南黃連；所述待鑒定黃連屬植物與 所述短萼黃連聚為一類，所述待鑒定黃連屬植物為或候選為短萼黃連；所述待鑒定黃連屬 植物與所述三角葉黃連聚為一類，所述待鑒定黃連屬植物為或候選為三角葉黃連；所述待 鑒定黃連屬植物與所述黃連、所述峨眉黃連、所述云南黃連、所述短萼黃連和所述三角葉黃 連均不聚為一類，所述待鑒定黃連屬植物不為或候選不為黃連、峨眉黃連、云南黃連、短萼 黃連和三角葉黃連。
[0077] 進(jìn)行所述聚類分析的軟件可為常用的聚類分析軟件，如NTsys-p C2. 1。所述聚類分 析可利用UPGMA算法進(jìn)行。
[0078] 本發(fā)明中，所述黃連屬植物為黃連（Coptis chinensis)、短萼黃連（Coptis chinensis var. Brevisepala)、三角葉黃連(Coptis deltoidea)、云南黃連(Coptis teeta)、峨嵋黃連（Coptis omeiensis)、五裂黃連（Coptis quinquesecta W.T. Wang)和五 葉黃連（Coptis quinquefolia Miq.)中的至少一種。
[0079] 實(shí)驗(yàn)證明，在黃連屬植物中，黃連分子標(biāo)記037A4的037A4-l、037A4-2和037A4-3 在不同黃連屬植物間存在差異；黃連分子標(biāo)記034H11的034H11-1、034H11-2、034H11_3 和034H11-4在不同黃連屬植物間存在差異；黃連分子標(biāo)記006G4中的006G4-l、006G4-2、 006G4-3、006G4-4和006G4-5在不同黃連屬植物間存在差異；黃連分子標(biāo)記008H3的 008H3-U008H3-2和008H3-3在不同黃連屬植物間存在差異。對(duì)黃連分子標(biāo)記037A4、 034H1U006G4和008H3的各多態(tài)性的0/1分型結(jié)果進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，黃連屬植物中相同 種聚為一類，黃連屬植物中不同種不聚為一類。
[0080] 在實(shí)際應(yīng)用中，可將檢測(cè)黃連分子標(biāo)記多態(tài)性的物質(zhì)與其它物質(zhì)（如檢測(cè)其它的 黃連分子標(biāo)記多態(tài)性的物質(zhì)）聯(lián)合在一起制備鑒定或輔助鑒定黃連屬植物的產(chǎn)品。
[0081] 其中，檢測(cè)黃連分子標(biāo)記多態(tài)性的物質(zhì)可為通過(guò)DNA測(cè)序確定黃連分子標(biāo)記多態(tài) 性所需的試劑和/或儀器。其中，利用DNA測(cè)序確定黃連分子標(biāo)記多態(tài)性所需的試劑和/ 或儀器包括PCR引物對(duì)、進(jìn)行PCR反應(yīng)所需試劑和儀器、進(jìn)行DNA測(cè)序所需試劑和儀器。 [0082] 所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為由試劑或試劑盒與儀器組成的系統(tǒng)，如由引 物、PCR試劑、DNA測(cè)序試劑、PCR儀和/或DNA測(cè)序儀組成的系統(tǒng)或試劑盒，由包含引物、 PCR試劑、DNA測(cè)序試劑、PCR儀和/或DNA測(cè)序儀的系統(tǒng)或試劑盒與進(jìn)行序列分析所需軟 件或模塊以及DNA測(cè)序所需要的其他試劑組成的系統(tǒng)。
[0083] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用DNA測(cè)序確定黃連分子標(biāo)記多態(tài)性。所述PCR引物 對(duì)在序列上沒(méi)有特殊要求，只要能擴(kuò)增出包括黃連分子標(biāo)記037A4、034H11、006G4或008H3 在內(nèi)的基因組DNA片段即可，擴(kuò)增出包括黃連分子標(biāo)記037A4在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR 引物對(duì)為SEQ ID No. 1的第17-40位所示的單鏈DNA和與SEQ